一种白色念珠菌胶体金检测卡及其应用的制作方法

本发明涉及念珠菌检测领域，特别涉及一种白色念珠菌胶体金检测卡及其应用。

背景技术

念珠菌是典型的条件致病菌，携带于几乎所有人的体内。具有感染频率高，感染面广等特点，尤其是在免疫缺陷型病人、器官移植病人、糖尿病人、癌症病人、老人和婴儿中的发病率相对较高。特别是妇女的外阴阴道感染疾病发病率尤其高，几乎每人一生中都要面临一次以上。

目前，医院里常用的检测方法是白带涂片，再通过光学显微镜观察。该类方法脱离了仪器读数，过多地依赖于人为判断，缺少一个量化的衡量标准以界定念珠菌症。而一些小型诊所，甚至部分欧美的家庭医生会根据症状直接给药，误诊率较高。日常生活中，因为症状不剧烈，生活节奏快，就医难，甚至观念保守等原因也经常造成对该病的忽视而贻误治疗。所以，建立一种简单、有效、家用的测定方法是极其必要的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种更适合患者针对白色念珠菌进行自检测，并且快捷简便、成本低廉的定性检测卡。

本发明的技术方案如下：一种白色念珠菌胶体金检测卡，所述检测卡包括试纸条以及检测卡外壳，所述试纸条包括胶体金膜、硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、pvc胶板，所述样品垫、胶体金膜、醋酸纤维素膜以及吸水垫依次粘贴在pvc胶板上，样品垫与胶体金膜并排，醋酸纤维素膜一端与胶体金膜略交叉，另一端与吸水垫略交叉，试纸条通过切割成与检测卡宽度略窄的长条，再将所述长条状的试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中，所述检测卡外壳上设有加样窗口和检测结果显示窗口，样品垫位于加样窗口，所述胶体金膜位于检测结果显示窗口；所述胶体金膜包被了单克隆抗体胶体金标记物；硝酸纤维素膜上有包被了白色念珠菌表面抗原烯醇化酶eno1的检测线t以及包被了羊抗鼠igg的质控线c。

作为其中一种优选的技术方案，所述醋酸纤维素膜上的检测线t设在质控线c的左方，靠近样品垫。

作为其中一种优选的技术方案，所述胶体金膜的包被方法为：

(1)胶体金溶液制备：取1l三角烧瓶1个，加入超纯水495ml，而后加入1％氯金酸(haucl4·3h2o)5ml，配制成500ml0.01％氯金酸(haucl4·3h2o)水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠(na3c6h5o7·2h2o)溶液5-7ml，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的eno1抗体在1000r/min，4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/l的pbs稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40ml，用0.25mol/l碳酸钾(k2co3)调节胶体金溶液ph至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4ml含0.3mg抗体蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4ml10％小牛血清蛋白(bsa)，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速(1500r/min)离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1ml，制备成eno1单克隆抗体胶体金标记物；

(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)中eno1单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μl/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含eno1单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

作为其中一种优选的技术方案，所述硝酸纤维素膜的包被方法为：将羊抗鼠igg抗体稀释成1mg/ml，用划膜仪依次以1μl/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，包被成羊抗鼠igg抗体质控线c；将eno1抗体稀释成1mg/ml，用划膜仪依次以1μl/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，包被成enol单克隆抗体检测线t，然后37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干。

作为其中一种优选的技术方案，所述样品垫的制备方法为：在玻璃纤维素膜上均匀地涂布上样品垫处理液后，在空气湿度低于60％的条件下，室温自然晾干。

作为其中一种优选的技术方案，所述样品垫处理液是由1gbsa(小牛血清蛋白)和0.8gnacl(氯化钠)，用含有0.5％triton-100(聚乙二醇辛基苯基醚)的0.01mol/lpbs(磷酸盐缓冲液)定容至100ml而成。

本发明还提供了一种白色念珠菌胶体金检测卡的检测方法，将需要检测的固体物样品物取样后用500μl超纯水浸润或者直接需要检测的悬浮物样品，用吸管吸取3-4滴，滴到加样窗口，5分钟以内读取结果，然后根据检测卡的检测情况判断检测结果，这样即完成了样本检测，

测试结果判断：显示两条线，一条检测线，一条质控线，则表示结果呈阳性，检测样品中存在白色念珠菌；若仅显示一条线质控线，则表示结果呈阴性，检测样品中不存在白色念珠菌，若仅显示一条检测线，则表示检测结果无效。

本发明的另外一个目的是提供一种白色念珠菌胶体金检测卡在检测样品中白色念珠菌存在中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所提供的白色念珠菌胶体金检测卡兼具高灵敏性和高特异性，能够快速检测白色念珠菌抗原；此外，检测卡具有操作方便，方法简单，快速简捷、结果准确、经济适用等优点。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明白色念珠菌胶体金检测卡的结构示意图；

图2为本发明白色念珠菌胶体金检测卡内置试纸条的结构示意图；

其中，1、加样窗口；2、检测结果显示窗口；3、样品垫；4、胶体金膜；5、pvc胶板；6、醋酸纤维素膜；7、质控线c；8、检测线t；9、吸水垫，

空心方块表示检测样品中的enol；实心圆代表金标。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。

本发明中药品名称对照表如下：

实施例1

如图1和图2所示，一种白色念珠菌胶体金检测卡，包括试纸条以及检测卡外壳，所述试纸条包括胶体金膜4、硝酸纤维素膜6、样品垫3、吸水垫9、pvc胶板5，所述样品垫3、胶体金膜4、醋酸纤维素膜6以及吸水垫9依次粘贴在pvc胶板5上，样品垫3与胶体金膜4并排，醋酸纤维素膜6一端与胶体金膜4略交叉，另一端与吸水垫9略交叉，试纸条通过切割成与检测卡宽度略窄的长条，再将长条状的试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中，所述检测卡外壳上设有加样窗口1和检测结果显示窗口2。

如图2所示：图中底层附pvc胶板；a为样品垫；g为胶体金膜，该胶体金膜上包被了单克隆抗体胶体金标记物；t、c所在白条为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了eno1单克隆抗体和羊抗鼠igg；b为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。

在pvc胶板a的一端上(样品端)粘附样品垫，其与胶体金膜为并排结构。

在pvc胶板中间粘附硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上设置有羊抗鼠igg质控线c和eno1单克隆抗体检测线t。

在pvc胶板b端粘附吸水垫，硝酸纤维素膜的一端与膜略交叉，另一端与吸水垫b略交叉，该试纸条可装入有塑料模具制成的检测卡外壳中，制成检测卡，在检测卡外壳图1中a处设有加样窗口1和检测结果显示窗口2，样品垫正对该加样窗口1，硝酸纤维素膜正对图1中检测结果显示窗口2。

检测卡的组装：pvc胶板上依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

实施例2

白色念珠菌胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：

(1)胶体金溶液制备：取1l三角烧瓶1个，加入超纯水495ml，而后加入1％氯金酸(haucl4·3h2o)5ml，配制成500ml0.01％氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠(na3c6h5o7·2h2o)溶液5-7ml，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的eno1抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/lpbs稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40ml，用0.25mol/lk2co3调节胶体金溶液ph至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4ml含0.3mg抗体蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4ml10％小牛血清蛋白(bsa)，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速(1500r/min)离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1ml，制备成eno1单克隆抗体胶体金标记物；

(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)eno1单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μl/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含eno1单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

(5)包被膜制备：将羊抗鼠igg抗体、eno1抗体稀释成1mg/ml，用划膜仪依次以1μl/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60％的条件下，室温自然晾干；

(7)检测卡的组装：pvc胶板上依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

步骤(5)中所包被的检测线t设在质控线c的左方(如图1)；

步骤(6)中的样品垫处理液是由1g小牛血清蛋白(bsa)和0.8g氯化钠(nacl)，用含有0.5％triton-100的0.01mol/lpbs定容至100ml。

实施例3

一种白色念珠菌胶体金检测卡的检测方法，将需要检测的固体物样品物取样后用500μl超纯水浸润或者直接需要检测的悬浮物样品，用吸管吸取3-4滴，滴到加样窗口，5分钟以内读取结果，然后根据检测卡的检测情况判断检测结果，这样即完成了样本检测，

测试结果判断：显示两条线，一条检测线，一条质控线，则表示结果呈阳性，检测样品中存在白色念珠菌；若仅显示一条线质控线，则表示结果呈阴性，检测样品中不存在白色念珠菌，若仅显示一条检测线，则表示检测结果无效。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。