本发明涉及血铝检测技术领域,具体涉及一种血铝的标准物质及应用。
背景技术
铝普遍存在于自然界,是地壳中最为丰富的元素之一,约占地壳的8.8%,因此人们与铝的接触非常广泛。在上个世纪70年代以前,普遍认为铝不能被人体吸收,无急慢性毒性,广泛用于食品添加剂、药物、容器等。但是随着研究深入以及不断有铝致毒性的报道,发现铝可扰乱生物体内的代谢作用,长期缓慢对人类健康造成危害,其中最为引人注目的是铝对神经系统的毒性作用。长期接触铝可以引起学习记忆功能减退、认知功能障碍等痴呆症状,被认为与阿尔兹海默病等老年性神经退行性疾病有关。因此,血中铝浓度的检测,作为最简单、直观监测铝接触对人体影响的生化指标,可在预防、诊断、治疗相关疾病中起到重要的作用。
而在血铝的检测中,标准物质起到非常重要的作用,它可以评价方法的准确度、精确度,同时在浓度赋值、校正等方面起到重要的参考作用。目前在血铝的检测中用到的标准物质,为市面上销售的没有加血基质的铝的标准液,这种标准物质只能对仪器检测相关的方法评价及数值校正起到作用,并不能对血液前期处理等步骤进行全程监测。
技术实现要素:
本发明为解决目前没有加血基质的铝的标准液而研制,这种标准物质不仅能对仪器检测相关的方法评价及数值校正起到作用,还能对血液前期处理等步骤进行全程监测的问题,从而提供一种血铝的标准物质及应用。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案为:一种血铝的标准物质,是按照如下方法制备的:将al(mal)3溶液腹腔注射至大鼠体内,隔日定时经腹腔注射90天后从大鼠体内取血置于抗凝或者不抗凝采血管中,离心取上清液,并将上清液冷冻干燥成粉末,然后对粉末进行定值,得到血铝标准物质;所述al(mal)3溶液是alcl3·6h2o和麦芽酚两种溶液等摩尔浓度等体积混合配制成的浓度为40mmol/l的al(mal)3溶液。
从大鼠体内取血制备血铝标准物质,与采用人血作为基质相比,老鼠血具有获得方便,影响因素单一,质量可保证等优势。将铝溶液注射于大鼠体内,并取大鼠血液为血铝的标准物质,完全模拟血铝的存在形式,可用于对血铝的检测的全程对方法学进行质控,尽可能低的减少基质效应对标准物质定值的影响。
进一步的,所述腹腔注射是将al(mal)3溶液按照1.62μm/kg的浓度剂量来注射到大鼠体内,隔日定时经腹腔注射90天,建立铝染毒亚慢性模型。
进一步的,所述大鼠为无特定病原体级健康雄性成年sd大鼠,体重190±10g且活动能力相近,大鼠全营养饲料及自来水喂养,动物房按照昼夜节律自然采光,室温控制在22℃~24℃,湿度控制在40%~60%。
进一步的,取血是从大鼠腹主动脉抽取血液,每只大鼠10ml置于抗凝或不抗凝采血管中,上清液是将大鼠体内取出的血液用离心机13600g离心15min后取上层清液而获得。
进一步的,冷冻干燥的步骤为先将上清液分装后在-20℃冰箱或冷冻机中预冻,之后将冻结完全的上清液迅速装入冻干机中干燥架上进行冷冻干燥,结束后放入5ml塑料小瓶并密封。
进一步的,采用电感耦合等离子体质谱检测法进行定值,包括如下步骤:
(1)粉末样品复溶:分析天平称取1.000g粉末于5ml去离子离心管内,加1ml去离子水稀释成溶液;
(2)前处理:将步骤(1)的溶液加1ml含1%triton的4%硝酸稀释液,盖好盖子后封口膜密封以防硝酸挥发,涡旋混合器充分混匀后于常温放置24h。结束后13600g离心15min,上清液用0.22μm微孔过滤器过滤,过滤至2ml去离子离心管内得待测的稀释血样;
(3)标准溶液制备:取铝标准溶液(100μg/ml),用去离子水倍比稀释,制备0、1、5、10、20、40、80、160μg/l的系列标准溶液,上机检测,制备标准曲线;
(4)将步骤(2)待测的稀释血样及试剂空白上机检测并由标准曲线得到稀释血样中铝的浓度;
(5)采用如下公式标定标准物质中铝的浓度:
c=2(c-c0)
式中:
c——血中铝的浓度,单位为微克每升(μg/l);
c——由线性回归方程得到的稀释血样中铝的浓度,单位为微克每升(μg/l);
c0——由线性回归方程得到的试剂空白中铝的浓度,单位为微克每升(μg/l);
2——样品稀释倍数。
采用电感耦合等离子体质谱检测法对血铝浓度进行检测,该仪器灵敏度高、准确度高、检测限低,使得定值结果更精确。
将上述血铝的标准物质,应用在血铝的检测中,可应用在血液前处理过程平衡及监测血液基质效应对浓度测定的影响,应用在评价血铝检测方法的准确度、精密度中,应用在血中铝浓度赋值中。
上述血铝的标准物质可应用在公共卫生及临床领域包括:职业铝人群相关疾病预防及监测、临床认知行为相关疾病筛查、治疗方案评估等。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果:
本发明的血铝标准物质,以鼠的血液作为基体,成本低廉,易于获得,互通性好,定值结果可靠。血液复溶性良好,扩展不确定度为5.072μg/l,达到标准要求,为合格制品。将铝溶液注射于大鼠体内,并取大鼠血液为血铝的标准物质,完全模拟血铝的存在形式,可全程对方法学进行质控,尽可能低的减少基质效应对标准物质定值的影响。采用电感耦合等离子体质谱检测法对血铝浓度进行检测,该仪器灵敏度高、准确度高、检测限低,使得定值结果更精确。因此,本发明血铝标准物质在职业预防、环境监测等需要对血铝进行监测的领域有着广阔的应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例中使用的仪器、试剂等如下:
1、仪器
1.1nexiontm300d型电感耦合等离子体质谱检测仪
1.2labconco型冷冻干燥仪
1.3milli-q净化水装置
1.4eppendorfreference移液器
1.5s200s型电子天平(美国sartorius)
1.6离心机
2、试剂
2.1去离子水(电阻值≥18.2mω)
2.2三氯化铝(结晶)(alcl3·6h2o,纯度98.0%,美国sigma-aldrich公司)
2.3麦芽酚(美国sigma-aldrich公司)
2.4分析纯硝酸(纯度100%,天津化学试剂厂)
2.5铝标准溶液:国家标准物质gbw(e)080179(铝:100μg/ml)
3、耗材
去离子离心管
去离子枪尖
5ml一次性注射器
0.22μm微孔过滤器
4、溶液配制
alcl3·6h2o配制方法:取4.856g溶于200ml生理盐水,浓度为80mmol/l,取100ml加入生理盐水100ml,此时为40mmol/l。
麦芽酚铝溶液配制:6.048g溶于200mlpbs中,浓度为240mmol/l,取出100ml加入pbs100ml,此时浓度为120mmol/l,再将中浓度取33.3ml加入pbs66.7ml,此时浓度为40mmol/l。
al(mal)3溶液配制:将配置好的alcl3·6h2o及麦芽酚两种溶液等体积混合配制成浓度为40mmol/l的al(mal)3溶液,并用孔径为0.22μm滤膜对其进行抽滤。用20%的naoh调ph值至7.4左右。
4%硝酸溶液配制:用移液器取浓硝酸溶液(体积分数65%)4ml置于盛少量超纯离子水的100ml容量瓶中,边加边摇匀,之后继续加超纯离子水至刻度线,配制成4%硝酸溶液。
铝离子标准校正溶液的配制:取铝标准溶液(100μg/ml),用去离子水倍比稀释,制备0、1、5、10、20、40、80、160μg/l的系列标准溶液。
实施例1:血铝的标准物质的制备及定值
一、含铝血液标本的制备和收集
挑选体重均匀分布在190±10g的雄性健康成年sd大鼠40只,活动能力相当,将其饲养在山西医科大学公共卫生学院劳卫教研室符合gb14925-2010《实验动物环境及设施》有关规定的无菌动物房,并通过山西医科大学动物伦理委员会审查批准。动物房温度控制在22℃~24℃,湿度在40%~60%之间,持续通风,昼夜自然节律采光。适应性喂养普通饲料一周后,将40只大鼠分为三组,空白对照组(10只)、麦芽酚对照组(10只)、al(mal)3组(20只)。空白对照组隔天腹腔注射生理盐水,麦芽酚对照组隔天腹腔注射麦芽酚,al(mal)3组隔天腹腔注射al(mal)3,持续90天。90天后,从每只大鼠腹主动脉取血10ml,置于edta抗凝采血管中,涡旋混合器thermomixerc充分混匀后放入centrifuge5424r离心机中,13600g离心15min,取上层清液置于敞口坩埚,用封口膜密封后-20℃冰箱冷冻备用。
二、含铝血液标本的冷冻干燥
启动labconco型冷冻干燥仪,将-20℃冰箱预冻好的样品转移至冷冻干燥机的干燥架上。调节冷冻干燥温度为-60℃,时间为4小时。冻干结束后,将相同组别的样品转移至同一研钵中,研磨均匀后,用洁净的不锈钢药勺取出进行分装,按1g/瓶分装。用带有密封内盖的5ml塑料小瓶进行样品的分装,装好后的样品瓶放入铝箔袋中,抽真空封口包装,标好浓度及标签,-20℃冰箱冷冻备用。
三、含铝血液标品的标定
3.1样品前处理方法
用分析天平称取含铝血液粉末样本1.000g,置于5ml去离子离心管内。用移液器加1ml去离子水,涡旋混合器混匀5min,之后再加入含1%triton的4%硝酸稀释液1ml于去离子离心管内,盖好盖子后封口膜密封以防硝酸挥发,涡旋混合器充分混匀后于常温放置24h。每个浓度的样品平行取6份,只加去离子水和含1%triton的4%硝酸稀释液的试剂空白样品也取6份。结束后将去离子离心管放入离心机中,13600g离心15min,上清液用0.22μm微孔过滤器过滤,过滤至2ml去离子离心管内,待检。待检样品上nexiontm300d型电感耦合等离子体质谱检测仪检测。电感耦合等离子体质谱仪器参数见表1。
3.2标准曲线的制备
含铝血液标品的浓度值由标准曲线法获得。因此,需要同时测定铝离子系列标准校正溶液的浓度。制备方法取铝标准溶液(100μg/ml),用去离子水倍比稀释,制备0、1、5、10、20、40、80、160μg/l的系列标准溶液,上机检测,用铝浓度作为x、仪器响应值作为y,计算线性回归方程,要求相关系数的平方r2不低于0.99。电感耦合等离子体质谱仪器参数见表1。
3.3浓度计算方法
含铝血液标品的浓度计算公式为:c=2(c-c0)
式中:
c——血中铝的浓度,单位为微克每升(μg/l);
c——由线性回归方程得的稀释血样中铝的浓度,单位为微克每升(μg/l);
c0——由线性回归方程得的试剂空白中铝的浓度,单位为微克每升(μg/l);
2——样品稀释倍数。
表1:电感耦合等离子体质谱仪器参数
3.4定值数据统计处理方式
依据jjf1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理,定值时测量数据的处理需经过以下几个步骤:
(1)对每组测量结果,在技术上说明异常值的产生并予剔除后,用格拉布斯法从统计上再次剔除异常值。列出原始数据、平均值、标准偏差、测量次数。
(2)汇总全部测量数据,根据达戈斯提诺法检验数据正态性来检查数据的正态性。
采用狄克逊准则来判别每组实验数据中的可疑值。将n次测量数据按照由小到大的顺序排列得:x1≤x2≤……≤xn-1≤xn,
按如下公式计算r1和rn,并查出f(α,n),
r1=(x3-x1)/(xn-2-x1)
rn=(xn-xn-2)/(xn-x3)
若r1>rn,且r1>f(α,n),则判断x1为异常值,应被剔除。若rn>r1,且rn>f(α,n),则判断xn为异常值,应被剔除。若r1,rn的值都小于f(α,n),则所有数据均保留。狄克逊检验结果如表2所示,各数据均无异常值。
表2定值结果(μg/l)及可疑值检验
四、含铝血液标品的均匀性检查
按照《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(jjf1343-2012)规定,不论制备过程中是否经过均匀性初检测,凡成批制备并分装成最小包装单元的标准物质,必须进行均匀性评估,当总数n≤200时,抽取单元数不少于11个。含铝血标品初次共制备40瓶,故抽取11瓶进行均匀性检查。并将所得数据按照方差方法进行计算。
样品多次测定的总平均值:
组间差方和:
组内差方和:
组间方差:
统计量f:f=s
该统计量是自由度为(v1,v2)的f分布变量。根据自由度(v1,v2)及给定的显著性水平α,可由f分布临界值表查得临界的fα值。若按公式算得的f值有f<fα,则认为数据组间均匀性无明显差异。
瓶间均匀性标准偏差sbb可按如下公式计算:-
式中:sbb为瓶间标准偏差;s12为组间方差;s22为组内方差;n为组内测量次数。sbb等同于瓶间不均匀性导致的不确定度分量ubb,
即sbb=ubb
应将计算待测特性值的不均匀性引入的不确定度分量计入标准物质总的不确定度中。
表4.1均匀性试验结果(μg/l)
由以上计算结果可知,含铝血标品,瓶间含量无显著性差异。
五、含铝血液标品的稳定性检查
稳定性是指在规定的时间间隔和环境条件下,标准物质的特性量值保持在规定范围内的性质。稳定性与被分析物理化特性、基体特性以及保存条件等因素有关。规定的时间间隔越长,表明该标准物质的稳定性越好。本工作考察了所研制标准物质在模拟运输条件下的短期稳定性和储存条件下的长期稳定性。
5.1短期稳定性检验
所研制标准物质采用了避光密封的包装方式,因此短期稳定性仅考察了温度在运输过程中对样品中目标准物质的影响。本工作考察了所研制标准物质在20℃和60℃的运输条件下的稳定性情况。随机抽取6瓶,放置于相应的温度环境中,分别在第0,1,3,7天进行分析。实验方法采用t检验方法,检测数据如表5.1和表5.2所示。
表5.120℃短期稳定性试验结果(μg/l)
表5.260℃短期稳定性试验结果(μg/l)
从表5.1和表5.2的短期稳定性检验结果可以看出,表明样品在20℃和40℃的模拟运输条件下,所研制标准物质能在7天的时间内保持稳定,能够满足标准物质在国内大部分地区的运输需要。
5.2长期稳定性检验
对于本标准物质,样品制备后,在-20℃储存条件下,采用3中所描述方法(采用的试剂和仪器、前处理方法、仪器条件等)进行了9个月的稳定性监测,每次取6个待考察样品进行检测。采用t检验法进行检验。检验公式如下:
式中:
5.3长期稳定性试验结果(μg/l)
从表5.3长期稳定性检验结果可以看出,所研制标准物质能在9个月的时间内,-20℃冷冻保存条件下能够稳定存在。按国家“标准物质管理办法”中规定,标准物质的稳定性应在6个月以上,所以本标准物质的稳定性可以通过稳定性检验。
六、含铝血液标品的不确定度计算
标准物质的不确定度主要由标准物质定值过程引起的不确定度、均匀性、稳定性引起的不确定度组成,此外,标准品纯度的不确定度也应包括进去。
其中,uchar是对物质特性值定值时引起的不确定度;ue是物质均匀性引起的不确定度;uits和usts分别是长期稳定性和短期稳定性引起的不确定度,uc是标准品纯度的不确定度。
不确定度量化
1)定值不确定度uchar
当测量数据符合正态分布或近似正态分布时合成标准不确定度uchar=标准偏差s根据表2定值数据,计算得到,uchar=5.23%
2)均匀性差异带来的不确定度ue
在均匀性检验结果中(表4)已经计算得到
3)稳定性带来的不确定度us
在稳定性检验结果中(表5.1、表5.2)已经计算得出uits=0.034,usts=0.120,由长期稳定性带来的相对不确定度
4)不确定度的合成
通过以上分析,得到各不确定度分量,见表6.1
表6.1不确定度分量汇总(相对不确定%)
将4个分量合成即得到相对合成标准不确定度,则
相对合成标准不确定度乘以扩展因子(k=2)得相对扩展不确定度u。
u=2*u=10.46%
合成不确定度:
扩展不确定度(k=2):
表6.2含铝血液标品含量定值及不确定度
本研究完成了含铝血标品的研制,共制备标准物质20瓶。对其中的6瓶样品中铝含量进行了均匀性检验,检验结果表明样品均匀性良好;经过长期稳定性检验及短期稳定性检验,无显著性变化趋势。