一种β2-受体兴奋剂的广谱特异性分子印迹聚合物、化学发光试剂盒及检测方法和应用与流程

本发明涉及动物性食品安全领域，具体涉及一种基于分子印迹聚合物的能检测10种β2-受体兴奋剂的化学发光试剂盒的制备方法及应用。

背景技术：

β2-受体兴奋剂是一类化学合成性药物，可以缓解支气管平滑肌痉挛，用于治疗人和动物的哮喘，常见品种有克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、特步他林、莱克多巴胺、菲诺特罗、马布特罗、多巴酚丁胺、溴布特罗、克伦丙罗。当此类药物给动物大剂量使用时（饲料添加剂、口服、注射），可以促使动物体内的脂肪组织向肌肉组织转化，从而提高瘦肉率，因此，被俗称为“瘦肉精”。但含有此类药物残留的动物性食品被消费者摄入后，会直接兴奋β2-受体，很快出现呼吸加快、心跳加快、血压升高、肌肉震颤等中毒反应，严重者甚至可以危及生命。中国农业部规定：禁止此类药物在食品动物养殖过程中以任何形式使用，且在所有可食性动物组织中均不得检出。因此，必须要对饲料和动物性食品中可能添加/残留的β2-受体兴奋剂进行检测，以保障消费者健康。β2-受体兴奋剂在动物体内被代谢后，主要通过尿液进行排泄，因此，检测尿液可以确定动物是否被非法使用了此类药物。

目前，有很多方法可以对β2-受体兴奋剂的残留进行检测，其中免疫分析法简单、方便，可用于大批量样品的筛查，在基层检测机构广为使用。但免疫分析法的核心试剂-抗体需要4-6个月的生产周期，且以抗体为识别元件建立的免疫分析法或商品化免疫检测试剂盒均为一次性使用。因此，研制具有免疫分析法优点的、可循环使用的检测方法/产品势在必行。

分子印迹聚合物是一种化学合成性材料，在合成过程中可以形成对特定目标物具有特异性识别能力的三维空腔，因此，被称为“塑料抗体”。而且，分子印迹聚合物制备期短（1-2周）、成本低、可重复循环使用。化学发光法是一种操作简单，分析速度快（10-30秒）的检测法，灵敏度比传统免疫分析法更高，且所用试剂均为化学试剂，不受温度、时间等因素影响。目前，国内外有一些文献采用β2-受体兴奋剂的药物原形为分子模板，合成相应的分子印迹聚合物作为识别元件用于建立化学发光检测法。但这些方法均采用双泵流动注射模式，操作程序复杂，不能进行批量筛查，即只能对多个样品进行一个一个地检测。其次，已报道的方法只能检测某一种β2-受体兴奋剂。另外，这些方法的灵敏度无法对痕量的β2-受体兴奋剂残留进行检测。

因此，将分子印迹聚合物、免疫分析法、化学发光法三者的优点结合，以分子印迹聚合物为识别元件在普通微孔滴定板上建立的化学发光法或研制试剂盒，则具有分析速度快、操作简单、灵敏度高、可循环使用、适于批量样品筛查的特点。但到目前为止，国内外均没有针对β2-受体兴奋剂的基于分子印迹聚合物的化学发光法或试剂盒的相关研究报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种β2-受体兴奋剂的广谱特异性的分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物能够对多种β2-受体兴奋剂进行捕捉，并能够直接用于化学发光分析法的检测。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种β2-受体兴奋剂的广谱特异性的分子印迹聚合物，其特征在于由如下方法制备，以下原料按物质的量计：

（a）将1份假分子模板异丙肾上腺素、3~6份功能单体甲基丙烯酸、10~30份的引发剂偶氮二异丁腈和10~30份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于溶剂中，60~70℃反应10~12小时，得到固体颗粒物；

（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用提取液连续回流12~24小时，将所述假分子模板异丙肾上腺素提取出来；

（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得β2-受体兴奋剂的广谱特异性的分子印迹聚合物。

优选的，所述的步骤（a）中所用的溶剂为氯仿，步骤（b）中所用的提取液为甲醇与乙酸的混合溶液，并且甲醇与乙酸的体积比为9：0.5~2。

本发明的另一个目的是提供一种β2-受体兴奋剂的广谱特异性检测的化学发光试剂盒，该试剂盒能够对多种β2-受体兴奋剂进行准确检测，操作便捷，结果可靠。为此，本发明采取如下技术方案：

一种β2-受体兴奋剂的广谱特异性检测的化学发光试剂盒，该化学发光试剂盒以前述分子印迹聚合物为识别试剂，以咪唑为催化剂，以双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯和过氧化氢为化学发光试剂，根据发光强度与待测物浓度具有比例关系对待测物浓度做出检测。

本发明还提供利用上述化学发光试剂盒对β2-受体兴奋剂的检测方法，包括如下步骤：

（a）将上述的分子印迹聚合物悬浮于重量百分比为0.3~2%聚乙烯醇溶液中，然后加入到不透明的聚苯乙烯滴定板的小孔中，放置1~2小时；

（b）将待检测的β2-受体兴奋剂或样品提取液加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，室温放置5~50分钟；

（c）对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤，清除杂质和没有被捕获的β2-受体兴奋剂类药物；

（d）将双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯、咪唑和过氧化氢加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，将该聚苯乙烯滴定板置于化学发光仪或多功能酶标仪中，读取各小孔的化学发光值。

优选的，所述步骤（c）中，用乙醇对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤。

本发明提供一种上述化学发光试剂盒在检测克伦特罗、沙丁胺醇、马布特罗、菲诺特罗、莱克多巴胺、西马特罗、特步他林、溴布特罗、克伦丙罗、多巴酚丁胺领域的应用。

本发明的有益效果是：以一种常见药物异丙肾上腺素为假分子模板，合成了β2-受体兴奋剂的广谱特异性分子印迹聚合物，其能同时识别此类药物的10个常见品种：克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、特步他林、莱克多巴胺、菲诺特罗、马布特罗、多巴酚丁胺、溴布特罗、克伦丙罗。以该分子印迹聚合物为识别元件制备的化学发光试剂盒，可以对动物饲料、尿液和肌肉中的10种β2-受体兴奋剂进行多残留、快速、灵敏检测，为实现β2-受体兴奋剂残留的现场快速检测奠定了基础，可在更大范围内保障动物性食品安全。另外，由于分子印迹聚合物对化学/物理条件变化的耐受性强，因此，本发明提供的化学发光试剂盒可以重复使用，大大地降低了检测成本，减少了资源浪费，符合当前社会绿色可持续发展的趋势。

附图说明

图1为对照的无分子模板时合成的聚合物的电镜扫描图片；

图2为本专利制备的分子印迹聚合物的电镜扫描图片；

图3为本专利制备的分子印迹聚合物对10种β2-受体兴奋剂的捕捉效果；

图4为克伦特罗检测的浓度与光密度值的标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，以下按物质的量计：

实施例1分子印迹聚合物合成例1

（a）将1份假分子模板异丙肾上腺素、3份功能单体甲基丙烯酸、10份的引发剂偶氮二异丁腈和10份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿溶剂中，60℃反应12小时，得到固体颗粒物；

（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用甲醇与乙酸（9：1，v/v）提取液连续回流12小时，将印迹的假分子模板异丙肾上腺素提取出来；

（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得β2-受体兴奋剂的广谱特异性的分子印迹聚合物。

实施例2分子印迹聚合物合成例2

（a）将1份假分子模板异丙肾上腺素、6份功能单体甲基丙烯酸、30份的引发剂偶氮二异丁腈和30份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿溶剂中，70℃反应10小时，得到固体颗粒物；

（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用甲醇与乙酸（9：2，v/v）提取液连续回流24小时，将印迹的假分子模板异丙肾上腺素提取出来；

（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得β2-受体兴奋剂的广谱特异性的分子印迹聚合物。

实施例3分子印迹聚合物合成例3

（a）将1份假分子模板异丙肾上腺素、4份功能单体甲基丙烯酸、25份的引发剂偶氮二异丁腈和25份的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯置于氯仿溶剂中，65℃反应11小时，得到固体颗粒物；

（b）将所述固体颗粒物放在索氏提取器中，用甲醇与乙酸（9：0.5，v/v）提取液连续回流18小时，将印迹的假分子模板异丙肾上腺素提取出来；

（c）将步骤（b）反应后的固体颗粒物烘干后，得β2-受体兴奋剂的广谱特异性的分子印迹聚合物。

本例所制备的分子印迹聚合物的电镜扫描照片如图2所示，由图2可见其表面多孔，为分子模板印迹形成的空腔，可对β2-受体兴奋剂进行识别；与此相区别的，如果不采用上述假分子模板，合成出的聚合物的电镜扫描照片如图1所示，其表面平整、光滑，没有孔隙，不能对β2-受体兴奋剂进行识别。实施例1和实施例2所制备的分子印迹聚合物的电镜扫描照片与本例中的图2情况类似。

实施例4上述分子印迹聚合物对十种β2-受体兴奋剂的捕捉效果检验

将实施例3所制备的针对β2-受体兴奋剂的分子印迹聚合物颗粒作为填料置于空的固相萃取柱中，将10种药物（1＝克伦特罗、2＝沙丁胺醇、3＝马布特罗、4＝菲诺特罗、5＝莱克多巴胺、6＝西马特罗、7＝特步他林、8＝溴布特罗、9＝克伦丙罗、10＝多巴酚丁胺）的标准品混和溶液加到该柱上，液体自然流出。然后用甲醇/乙酸溶液(95:5，v/v)将被吸附的药物洗脱，洗脱液用超高效液相色谱法检测。色谱图（图3）表明该聚合物有特异性吸附上述10种药物的能力。尝试用金刚烷胺、磺胺类、喹诺酮、四环素、氯霉素、吩噻嗪等非β2-受体兴奋剂类药物进行类似实验，发现本分子印迹化合物对这些药物没有吸附。因此，将该聚合物包被于微孔板的小孔中作为识别元件，组装成的试剂盒就可以吸附上述10种β2-受体兴奋剂类药物。通过发光分析，可以快速筛选待测试样中是否还有上述10种β2-受体兴奋剂类药物的至少一种。

实施例5化学发光试剂盒的组成

化学发光试剂盒包括如下组成：

实施例1、2或3所制备的分子印迹聚合物，作为识别试剂，其可以捕捉β2-受体兴奋剂药物，为检测提供基础；

双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯和过氧化氢，二者作为化学发光试剂；

咪唑，作为为催化剂，对反应起到催化作用，使其快速发光；

发光后，利用化学发光仪根据发光强度与待测物浓度具有正比例关系对待测物浓度做出检测。

实施例6利用上述试剂盒β2-受体兴奋剂的检测方法

检测方法如下：

（a）将前述分子印迹聚合物悬浮于重量百分比为0.3~2%聚乙烯醇溶液中，然后加入到聚苯乙烯滴定板的小孔中，70℃放置1~2小时；

（b）将待检测的β2-受体兴奋剂或样品提取液加入到聚苯乙烯滴定板的小孔中，室温放置5~50分钟；

（c）对所述聚苯乙烯滴定板的小孔进行洗涤，清除杂质和没有被捕获的β2-受体兴奋剂类药物；

（d）将双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯、咪唑和过氧化氢依次加入到所述聚苯乙烯滴定板的小孔中，将该聚苯乙烯滴定板置于化学发光仪或多功能酶标仪中，读取各小孔的化学发光值。

（e）根据是否有发光值，判断是否含有实施例4中所用的10种β2-受体兴奋剂的至少一种。

上述分子印迹聚合物-化学发光试剂盒用甲醇/乙酸进行洗涤后，可重复使用8次。

本例说明本试剂盒能够一次性快速筛选待测样品中是否含有上述β2-受体兴奋剂类药物的一种或多种，对于没有发光现象的样品说明不含上述10种β2-受体兴奋剂，对于有发光现象的样品，可以再次通过高效液相色谱对所含β2-受体兴奋剂类药物的具体种类和含量进行分析。因此，本试剂盒极大提高了对样品的筛选效率。

实施例7化学发光试剂盒的检测效果

以克伦特罗为例，将药物标准品用样品提取液进行系列浓度的稀释（0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50、100ng/ml），然后分别添加到包有分子印迹聚合物的不同小孔中，按上述方法进行实验。结果表明，克伦特罗的浓度与化学发光值之间呈良好线性关系，说明使用该试剂盒时，可以通过测定的光密度值对药物的浓度进行计算，具有较高的准确性，实验结果如图4所示。

上述实施例只是对本新型构思和实现的说明，并非对其进行限制，在本发明构思下，未经实质变换的技术方案仍然在保护范围内。