铁蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及体外诊断试剂的
技术领域：
，尤其涉及一种铁蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：铁蛋白由蛋白壳和铁核两部分组成，蛋白壳由24个高度对称的亚基形成一个球形空腔结构，内径通常为7-8nm，外径为12-13nm，厚度2-2.5nm；铁核由数千个氢氧化铁分子和数百个磷酸盐分子组成。每个铁蛋白亚基外形成空心的柱状(长约5nm，直径约2.5nm)且由一个两两成反向平行的4个α螺旋簇(a、b和c、d)、c末端第五个较短α螺旋(e)以及n末端的伸展肽端(ep)构成。b和c螺旋之间由一段含18个氨基酸的bc环连接，e螺旋位于4α螺旋簇的尾端并与之成60°夹角。每两个铁蛋白亚基反向平行形成一组，再由这十二组亚基对构成一个近似正八面体，成4-3-2重轴对称的球状分子。每个铁蛋白分子形成12个二重轴通道、8个三重轴通道、6个四重轴通道，这些通道被认为是铁蛋白内部与外部离子出入铁蛋白的必经之路，起着联系铁蛋白内部空腔与外部环境的作用。铁蛋白的分子量约为450kda，沉降系数为17-18s。对于哺乳动物来说，铁蛋白通常由h和l两种类型的亚基组成。h亚基为重链，分子量约为21kd，l亚基为轻链，分子量约为19kd，两种亚基的氨基酸序列具有55％的相似度，而功能截然不同。h型亚基包含一个由his65、glu27、glu61、glu107、tyr34、glu62和gln141七个保守的氨基酸组成的亚铁氧化中心，主要负责亚铁离子的快速氧化，1个亚铁氧化中心可同时结合2个fe2+离子；而l型亚基缺乏这个活性中心，但含有一个成核中心，负责亚铁离子的缓慢氧化以及矿物核的形成。两种亚基的组成比例具有组织特异性，如心脏和脑由于铁代谢旺盛而富含h型亚基，肝脏和脾脏由于主要用于铁的长期储藏而富含l型亚基。铁蛋白是人体重要的铁贮存蛋白，参与对造血和免疫系统的调控。血清中铁蛋白水平可反映铁贮备情况及机体营养状态，它与多种疾病相关。铁蛋白降低几乎都可以诊断为铁缺乏，主要因为：①铁贮存减少：如缺铁性贫血、营养不良等；②铁蛋白合成减少、维生素c缺乏等。在体内铁缺乏早期，尚无显著的贫血改变时，仅有体内铁贮存量减少，常规生化指标正常，血清铁蛋白就开始减少。铁蛋白含量测定是目前诊断隐性贫血最早最准确的指标，诊断符合率可达95.5％。部分自身免疫性疾病如全身性红斑狼疮、干燥综合征、某些胶原性病时铁蛋白也可明显降低。妊娠和哺乳期也可低于正常值。铁蛋白升高可以表征为一下几种情况：①铁贮存增加原发性血色病、继发性铁负荷过多，如过多输血、不恰当铁剂治疗、溶血性贫血等。②铁蛋白合成增加炎症或恶性病变，如许多恶性肿瘤细胞可以合成和分泌铁蛋白，如肝癌、肺癌、胰腺癌、白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤等，铁蛋白测定已成为恶性肿瘤辅助诊断指标之一；甲状腺功能亢进症时铁蛋白合成也增加。③组织内的铁蛋白释放增加急性肝炎、慢性肝炎或其他肝病时血清铁蛋白也明显增高。在肝硬化等高危患者中同时测定afp与铁蛋白对于早期发现肝癌有重要价值。急性心肌梗死早期也出现铁蛋白升高。目前用于检测fer的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法。酶联免疫分析法采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体，用于催化发光底物产生颜色变化，操作简单，但是标记物易失活，发光底物需要避光，试剂的检测灵敏度较低，导致测试结果不准确。化学发光免疫分析法采用催化剂催化化学发光物质形成一种激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，发出光子，具有操作简单，自动化程度高，检测速度快等优点。以上定量检测fer的方法存在一下缺陷：1)elisa方法采用微孔板作为固定性，包被密度有限，灵敏度较低，反应时间较长；2)采用异鲁米诺衍生物直接标记抗体，采用fitc抗体-fitc将fer抗体间接偶联至磁微粒表面，引入更多的影响因素，影响结果的检测；3)采用三联吡啶钌的电化学发光法，仪器要求较高，试剂及仪器昂贵。技术实现要素：本发明针对上述技术问题，提供一种铁蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒用于检测血清/血浆中的铁蛋白，具有灵敏度高，特异性好，操作简单等优点。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：铁蛋白化学发光检测试剂盒，包括以下试剂：r1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体；r2：含有生物素标记的铁蛋白抗体的液体；r3：含有吖啶酯标记的铁蛋白抗体的液体；其中，r1中磁微粒与链霉亲和素的质量比为1:10-1:20；链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为10mg/ml；r2中铁蛋白抗体与生物素的摩尔比为1:5-1:10；生物素标记的铁蛋白抗体的浓度为1mg/ml；r3中铁蛋白抗体与吖啶酯的摩尔比为1:5-1:10；吖啶酯标记的铁蛋白抗体的浓度为1mg/ml。进一步地，上述的铁蛋白化学发光检测试剂盒，还包括7个浓度的校准品，校准品中含有铁蛋白的浓度分别为0ng/ml，6.00～8.00ng/ml、40.00～45.00ng/ml、200.00～220.00ng/ml、430～450ng/ml、900.00～1100.00ng/ml及2000.00～2200.00ng/ml。进一步地，上述的铁蛋白化学发光检测试剂盒，还包括两个浓度的质控品，其中，高浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为290.00～310.00ng/ml，低浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为19.00～21.00ng/ml。进一步地，校准品或质控品的缓冲液中含有0.1mol/l的pb、0.15mol/l的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20。进一步地，r1的制备方法为：取磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1:10-1:20的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂。进一步地，r2的制备方法为：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将生物素按照抗体与生物素摩尔比1:5-1:10进行添加，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有生物素标记的铁蛋白抗体的液体试剂。进一步地，r3的制备方法为：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将吖啶酯按照抗体与吖啶酯摩尔比1:5-1:10添加，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有吖啶酯标记的铁蛋白抗体的液体试剂。进一步地，所述封闭液为含2-5％bsa的20mmpb缓冲液。本发明还提供了上述的铁蛋白化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：s1、制备试剂r1，r1的制备方法为：取磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1:10-1:20的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂；s2、制备试剂r2，r2的制备方法为：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将生物素按照抗体与生物素摩尔比1:5-1:10进行添加，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有生物素标记的铁蛋白抗体的液体试剂；s3、制备试剂r3，r3的制备方法为：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将吖啶酯按照抗体与吖啶酯摩尔比1:5-1:10添加，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有吖啶酯标记的铁蛋白抗体的液体试剂。进一步地，上述的铁蛋白化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：s1、制备试剂r1，r1的制备方法为：取磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1:15的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂；s2、制备试剂r2，r2的制备方法为：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将生物素按照抗体与生物素摩尔比1:10进行添加，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有生物素标记的铁蛋白抗体的液体试剂；s3、制备试剂r3，r3的制备方法为：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将吖啶酯按照抗体与吖啶酯摩尔比1:10添加，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有吖啶酯标记的铁蛋白抗体的液体试剂。本发明还提供了上述的铁蛋白化学发光检测试剂盒的检测方法，步骤如下：1)将待测样本与r2及r3试剂孵育10min，样本中fer抗原与生物素标记fer第一抗体、吖啶酯标记的fer第二抗体发生免疫反应，形成生物素-fer抗体-fer-fer抗体-吖啶酯溶剂；2)再加入r1试剂孵育10min，链霉亲和素磁珠与生物素结合，形成磁珠-链霉亲和素-生物素-fer抗体-fer-fer抗体-吖啶酯复合物；3)加入清洗缓冲液洗涤，将未反应的溶液清洗去除；4)加入酸性激发液，使吖啶酯标记物游离；加入碱性激发液，使吖啶酯发射光子；光电倍增管接收光量子数与fer的含量成正比。其中，清洗缓冲液包括50g/l磷酸氢二钠、10g/l磷酸二氢钠、100g/lnacl、2％的triton-100和2％的proclin-300；酸性激发液为过氧化氢和硝酸水溶液，过氧化氢的质量浓度为0.2％，硝酸的摩尔浓度为7mm；碱性激发液为氢氧化钠水溶液，氢氧化钠的摩尔浓度为0.35m。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的铁蛋白化学发光检测试剂盒，采用双抗体夹心法的原理，同时利用亲和素-生物素体系，采用吖啶酯化学发光，大大提高了试剂盒的检测灵敏度，减少反应时间，降低试剂成本，可用于血清/血浆中的铁蛋白含量的定量检测。本发明提供的铁蛋白化学发光检测试剂盒的制备方法，该方法简单易操作，制备得到的铁蛋白化学发光检测试剂盒，灵敏度高、线性范围广、稳定性好。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例提供的铁蛋白化学发光检测试剂盒剂量反应校准曲线。具体实施方式本发明提供的铁蛋白化学发光检测试剂盒，包括以下试剂：r1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体；r2：含有生物素标记的铁蛋白抗体的液体；r3：含有吖啶酯标记的铁蛋白抗体的液体；其中，r1中磁微粒与链霉亲和素的质量比为1:10-1:20；链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为10mg/ml；r2中铁蛋白抗体与生物素的摩尔比为1:5-1:10；生物素标记的铁蛋白抗体的浓度为1mg/ml；r3中铁蛋白抗体与吖啶酯的摩尔比为1:5-1:10；吖啶酯标记的铁蛋白抗体的浓度为1mg/ml。上述的铁蛋白化学发光检测试剂盒，还包括7个浓度的校准品，校准品中含有铁蛋白的浓度分别为0ng/ml，6.00～8.00ng/ml、40.00～45.00ng/ml、200.00～220.00ng/ml、430～450ng/ml、900.00～1100.00ng/ml及2000.00～2200.00ng/ml。上述的铁蛋白化学发光检测试剂盒，还包括两个浓度的质控品，其中，高浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为290.00～310.00ng/ml，低浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为19.00～21.00ng/ml。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细介绍。实施例1校准品制备①校准品缓冲液的组成：包括0.1mol/l的pb、0.15mol/l的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20，ph值6.0，2-8℃存放备用；②取一定量的铁蛋白用①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0ng/ml，7.29ng/ml、42.33ng/ml、215.95ng/ml、443.19ng/ml、909.55ng/ml、2099.52ng/ml的校准品，等量分装成浓度分别为0ng/ml，7.29ng/ml、42.33ng/ml、215.95ng/ml、443.19ng/ml、909.55ng/ml、2099.52ng/ml的7瓶校准品。质控品制备方法同上。参见图1所示，铁蛋白化学发光检测试剂盒剂量反应校准曲线，线性相关系数r≥0.9900，校准合格，具体相关参数如表1：表1.铁蛋白测定试剂盒剂量反应校准曲线相关参数实施例2铁蛋白化学发光检测试剂盒的制备r1的制备：取磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1:10的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂；r2的制备：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将生物素按照抗体与生物素摩尔比1:5进行添加，37℃孵育2h进行标记，然后加入封闭液(含2％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育2h，最后使用蛋白纯化仪对蛋白进行纯化，收集蛋白峰值，得到含有生物素标记的铁蛋白抗体的液体试剂；r3的制备：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将吖啶酯按照抗体与吖啶酯摩尔比1:5添加，37℃孵育2h进行标记，然后加入封闭液(含2％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育2h，最后使用蛋白纯化仪对蛋白进行纯化，收集蛋白峰值，得到含有吖啶酯标记的铁蛋白抗体的液体试剂。实施例3铁蛋白化学发光检测试剂盒的制备r1的制备：取磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1:15的比例添加链霉亲和素，37℃孵育24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂；r2的制备：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将生物素按照抗体与生物素摩尔比1:10进行添加，37℃孵育4h进行标记，然后加入封闭液(含2％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育4h，最后使用蛋白纯化仪对蛋白进行纯化，收集蛋白峰值，得到含有生物素标记的铁蛋白抗体的液体试剂；r3的制备：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将吖啶酯按照抗体与吖啶酯摩尔比1:10添加，37℃孵育4h进行标记，然后加入封闭液(含2％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育2-4h，最后使用蛋白纯化仪对蛋白进行纯化，收集蛋白峰值，得到含有吖啶酯标记的铁蛋白抗体的液体试剂。实施例4铁蛋白化学发光检测试剂盒的制备r1的制备：取磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1:20的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂；r2的制备：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将生物素按照抗体与生物素摩尔比1:10进行添加，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液(含2％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育2-4h，最后使用蛋白纯化仪对蛋白进行纯化，收集蛋白峰值，得到含有生物素标记的铁蛋白抗体的液体试剂；r3的制备：取铁蛋白抗体，首先用20mmpb缓冲液置换铁蛋白抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，将吖啶酯按照抗体与吖啶酯摩尔比1:10添加，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液(含2％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育2-4h，最后使用蛋白纯化仪对蛋白进行纯化，收集蛋白峰值，得到含有吖啶酯标记的铁蛋白抗体的液体试剂。实施例5铁蛋白化学发光检测试剂盒的性能评估①最低检测限检测用实施例1的零浓度校准品或样本稀释液作为样本进行检测，采用实施例2制备的试剂盒重复测定20次，得出20次检测结果的rlu值(相对发光值)，计算其平均值(m)和标准差(sd)，得出m+2sd，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度—rlu值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将m+2sd的rlu值带入上述方程，求出对应的浓度值，即为最低检测限，结果应符合应<0.5ng/ml。结果如表2所示：表2.最低检测限数据②线性检测将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中稀释后的最低值浓度样本须接近线性范围的下限，线性范围为0.5-2000ng/ml。将每一浓度的样本采用实施例3制备的试剂盒重复检测3次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，结果应符合线性范围，线性相关系数r应≥0.9900。结果如表2所示：表2.线性检测数据③重复性检测用实施例4制备的试剂盒，对高值和低值两个浓度的质控品样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值和标准差sd，根据公式(1)计算变异系数(cv)，结果应符合变异系数(cv)应≤8.0％。式中：cv—变异系数；sd—测量结果的标准差；—测量结果的平均值。结果如表3所示：表3.重复性数据测定次数重复性样本1重复性样本2rep120.01298.64rep219.68300.99rep320.42297.7rep420.17299.91rep518.65299.08rep620.55298.45rep720.46299.00rep819.94298.00rep919.79299.19rep1020.09300.05测定均值19.98299.15sd0.54721.0535cv2.74％0.35％由检测结果显示本发明所涉及试剂盒检测线性相关系数r≥0.9900，即线性检测合格；最低检测限是0.5ng/ml；重复性检测结果符合变异系数(cv)应≤8.0％要求，即重复性检测合格。综上，本试剂盒具有灵敏度高、线性范围广、稳定性好的特点。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12