基于石墨烯复合物的前列腺特异抗原检测方法与流程

本发明涉及电化学生物传感技术领域，特别涉及一种基于石墨烯复合物的前列腺特异抗原检测方法。

背景技术：

传统检测前列腺特异抗原(psa)的方法主要是利用免疫分析原理，通过比色法，荧光法，表面增强拉曼散射，电化学方法，化学发光，和电致化学发光(ecl)等技术进行检测。这些方法大多涉及到特殊的抗原-抗体识别，但是抗体容易随温度变性，分析过程大多需要繁琐的步骤和较长的反应时间。为了解决这些问题，设计出可被psa特异性切割的多肽，利用其更稳定，更易于操作等特点，实现psa的特异性检测，得到了广泛的关注。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于石墨烯复合物的前列腺特异抗原检测方法。

本发明通过设计一种基于多肽识别和石墨烯纳米银信号放大的检测体系，实现对psa的定量分析，以期在前列腺癌症的早期诊断和治疗中得到应用。

本发明基于电化学检测原理，设计出可被psa特异性切割的多肽(n’-cgghssklqfwyfwy-c′)，根据肿瘤标志物psa对多肽的特异性识别和切割作用，结合氧化石墨烯(go)和纳米银(agnps)的信号放大作用，利用交流阻抗法和线性扫描伏安法，实现对psa的定量分析和检测。

该多肽序列末端通过au-s键可固定在电极界面上，当样本中不存在psa时，多肽顶端的芳香族氨基酸可以和带负电的go特异性结合，并进一步还原ag⁺，得到较强的agnps信号。另一方面，当多肽在psa存在的溶液中经过识别和切割作用，无法与相应的信号分子结合，信号明显变弱。通过检测溶液的电化学信号，可以指示出待测psa的浓度。

本发明采用的技术方案是：一种基于石墨烯复合物的前列腺特异抗原检测方法，包括以下步骤：

1)对电极进行预处理；

2)利用设计出的可被psa特异性切割的多肽对电极进行修饰；

3)将多肽修饰后的电极与psa反应，对多肽进行特异性的识别和切割；

4)利用石墨烯@银复合纳米材料进行信号放大反应；

5)对psa进行定量分析和检测。

优选的是，所述步骤1)中电极为金电极，预处理的步骤具体包括：

1-1)先对电极表面进行打磨，再进行机械抛光，获得镜状表面；

1-2)用超纯水将电极冲洗干净，再先后用乙醇和超纯水进行超声处理，以除去任何粘附的氧化铝；

1-3)用水虎鱼溶液清洗电极，再用超纯水冲洗干净；

1-4)用h2so4溶液对电极进行电化学清洗；

1-5)将电极用氮气干燥以便进行下一步修饰。

优选的是，所述步骤1-1)中先用p3000和p5000碳化硅砂纸进行打磨，然后用1.0、0.3和0.05μm的氧化铝粉末依次进行机械抛光；步骤1-3)的水虎鱼溶液中，h2so4:h2o2＝3:1；步骤1-4)中用0.5mh2so4溶液进行电化学清洗，以去除任何多余的化合物。

优选的是，所述步骤2)具体包括：将预处理后的电极与多肽溶液反应后，然后在mch(巯基己醇)中浸泡处理，最后用超纯水清洗，并在氮气流中干燥。

优选的是，所述步骤2)中多肽溶液中还包括hepes、tcep，其ph为7.0。

优选的是，将预处理后的电极与20μm多肽溶液(20mmhepes，10mmtcep，ph7.0)在室温下反应16小时后，然后在1mmmch中浸泡处理30分钟，最后用超纯水清洗，并在氮气流中干燥。

优选的是，所述步骤2)中多肽为：n’-cgghssklqfwyfwy-c’。

优选的是，所述步骤3)具体为：将多肽修饰的电极浸入不同浓度的psa溶液中，进行多肽特异性的识别和切割，反应后，将电极用超纯水冲洗。

优选的是，所述步骤4)中具体包括：将所述步骤3)得到的电极浸泡在go(氧化石墨烯)溶液中处理后，将电极清洗，再放入agno3溶液中反应，反应后用超纯水清洗。

优选的是，所述步骤4)中具体包括：将所述步骤3)得到的电极浸泡在1mg/mlgo溶液中处理后，将电极清洗，再放入到ph为8.0的20mmagno3溶液中反应1小时，温度设定为60℃，反应后用超纯水清洗。

优选的是，所述步骤5)中采用电化学检测手段进行psa的定量分析和检测，具体为采用交流阻抗法来监测多肽与go、agnps组装是否成功，采用线性扫描伏安法对psa进行定量检测。

优选的是，所有的电化学实验在在室温下通过chi660d电化学工作站进行检测。应用三电极系统，含有一个ag/agcl参比电极，铂丝辅助电极和工作电极。实验数据由电化学交流阻抗法(eis)和线性扫描伏安法(lsv)产生。电化学交流阻抗法的缓冲液为含有1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-溶液，参数为0.232v偏置电位，5mv幅度，以及0.1hz-100khz的频率范围；线性扫描伏安法实验在0.1m的氯化钾溶液(ph7.0)中进行，扫描速率为50mv/s。

本发明的有益效果是：本发明设计出了一种基于石墨烯复合物的前列腺特异抗原检测方法，能实现对psa的定量分析，可在前列腺癌症的早期诊断和治疗中得到应用。本发明设计的检测方法反应迅速灵敏度高，可以检测的浓度范围是5pg/ml～20ng/ml，最低检测极限是5pg/ml。另外，这种多肽识别切割与go/agnps纳米复合材料的信号转导组合的生物传感器具有很高的特异性和稳定性。

附图说明

图1为基于多肽的psa检测示意图；

图2为电化学阻抗图谱；

图3为线性扫描伏安法检测图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明的原理分析：

本发明基于电化学检测原理，根据肿瘤标志物psa对多肽的特异性识别和切割作用，结合氧化石墨烯(go)和纳米银(agnps)的信号放大作用，利用交流阻抗法和线性扫描伏安法，实现对psa的定量分析和检测。本发明设计出可被psa特异性切割的多肽(n’-cgghssklqfwyfwy-c′)，利用其更稳定，更易于操作等特点，实现psa的特异性检测。

该多肽序列末端通过au-s键可固定在电极界面上，当样本中不存在psa时，多肽顶端的芳香族氨基酸可以和带负电的go特异性结合，并进一步还原ag⁺，得到较强的agnps信号。另一方面，当多肽在psa存在的溶液中经过识别和切割作用，无法与相应的信号分子结合，信号明显变弱。通过检测溶液的电化学信号，可以指示出待测psa的浓度

参照图1，其为基于多肽的psa检测示意图。图1详细说明了基于多肽切割的电化学方法检测psa的检测原理。底物多肽首先通过n端的半胱氨酸固定在金电极表面上。然后通过多肽的芳族氨基酸的苯环部分与go的相互作用，go被修饰在电极表面上。go具有较大的表面积，优异的导电性和高稳定性，适用于电化学分析。此外，其较好的电催化活性有助于银的连续沉积。银离子首先通过go基底平面上和边缘上的官能团被聚集吸附。此外，用go作为还原剂和分散剂，可以很容易地合成出大量的银纳米粒子(agnps)，同时获得了明显的agnps溶出伏安电流。该复合材料还具有良好的导电性，可以提高电子传输效率，进一步提高产生的信号。对于psa分析，首先将psa浓度的信息转化为电极表面上的底物多肽的识别和切割。由于裂解多肽不再有助于固定go和随后的agnps，电化学响应产生的显著改变，其可用于指示初始psa水平。

参照图2，交流阻抗法(eis)表征金电极的修饰状态：(a)裸电极，(b)修饰多肽，(c)go的修饰，(d)agnps信号分子的组装。为了有效地表征修饰电极的界面特性，通过eis测量来监测组装过程，其中使用[fe(cn)6]^3-/4-作为电活性探针。对于典型的奈奎斯特图，采用工作电极的等效电路模型来分析，并且阻抗的半圆直径通过氧化还原探针的传递而增加。如图2所示，裸金电极的曲线几乎是一条没有明显半圆区域的直线，表明电极表面的电子直接转移。当巯基末端修饰的多肽被固定在电极上时，由于多肽的电子转移的衰减，阻抗增加。由于多肽的芳香族氨基酸可与go的苯环相互作用，带负电荷的二维纳米材料很容易在电极上组装，这导致go和[fe(cn)6]^3-/4-之间的互相排斥。然而，随后agnps形成后，阻抗值急剧下降，这是由于形成的agnps能有效地促进电子转移。因此，阻抗值的逐步变化证实了生物传感器的成功建立。

参照图3，线性扫描伏安法(lsv)对psa定量检测：从a到i的浓度分别是5，20，100，500pg/ml，1，2，5，10，20ng/ml。插图显示反映psa对数浓度与峰值电流之间线性关系的校准曲线。

在这种生物传感器中，go具有巨大的表面积以加载许多agnps，可以提供显着的电化学响应。lsv用于评估用不同量的目标psa处理后的溶出伏安电流峰。如图3所示，在最佳条件下，峰值电流随着psa浓度的增加而降低。相应的校准曲线显示峰电流与psa浓度的对数之间的良好线性关系，范围从5pg/ml到20ng/ml。拟合方程是y＝-0.6595logx+3.4154(n＝3，r²＝0.993)其中，x是psa的浓度(pg/ml)，y是峰值电流(1e^-4a)。psa分析的检测限(lod)为5pg/ml，较低。生物传感器广泛的线性范围和高灵敏度为有效的检测psa做出很好的证明。

基于以上分析，以下再提供一种实施例，以对本发明做进一步说明。

一种基于石墨烯复合物的前列腺特异抗原检测方法，包括以下步骤：

1)对电极进行预处理：金电极表面首先用p3000和p5000碳化硅砂纸进行打磨，并用1.0，0.3和0.05μm的氧化铝粉末进行机械抛光，获得镜状表面。然后，将用超纯水冲洗电极干净，并先后用乙醇和超纯水进行超声处理，以除去任何粘附的氧化铝。接着，将电极小心地用水虎鱼溶液(h2so4:h2o2＝3:1)清洗10分钟(注意：高腐蚀性)，用超纯水冲洗干净。之后，用0.5mh2so4溶液进行电化学清洗，去除任何多余的化合物。最后，将准备好的电极用氮气干燥以便进行下一步修饰。

2)利用设计出的可被psa特异性切割的多肽对电极进行修饰：将预处理的电极与20μm多肽溶液(20mmhepes，10mmtcep，ph7.0)在室温下反应16小时。将修饰的电极进一步浸泡在1mm中mch30分钟，以避免电极界面物理性吸附的分子。然后，用超纯水清洗，并在氮气流中干燥，以用于接下来的实验。

3)将多肽修饰后的电极与psa反应，对多肽进行特异性的识别和切割：将多肽修饰的电极浸入200μl不同浓度的psa溶液中，多肽可以被特异性的识别和切割。反应30分钟后，将电极用超纯水冲洗。

4)进行信号放大反应：将反应过后的电极，浸泡在1mg/mlgo溶液中，然后将电极清洗，放在20mmagno3溶液(ph＝8)中反应1小时，温度设定为60℃。反应后用超纯水清洗。

5)对psa进行定量分析和检测：所有的电化学实验在在室温下通过chi660d电化学工作站进行检测。应用三电极系统，含有一个ag/agcl参比电极，铂丝辅助电极和工作电极。实验数据由电化学阻抗谱(eis)和线性扫描伏安法(lsv)产生。电化学阻抗图谱的缓冲液为含有1mkcl的5mm[fe(cn)6]^3-/4-溶液，参数为0.232v偏置电位，5mv幅度，以及0.1hz-100khz的频率范围。线性扫描伏安法实验在0.1m的氯化钾溶液(ph7.0)中进行，扫描速率为50mv/s。

本发明设计的检测方法反应迅速灵敏度高，可以检测的浓度范围是5pg/ml～20ng/ml，最低检测极限是5pg/ml。另外，这种多肽识别切割与go/agnps纳米复合材料的信号转导组合的生物传感器具有很高的特异性和稳定性。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。