一种检测生物制品中牛血清白蛋白的试纸及制备方法与流程

本发明涉及生物制品检验技术领域，具体而言，涉及一种检测生物制品中牛血清白蛋白的试纸及制备方法。

背景技术：

牛血清白蛋白(bsa)是牛血清中的一种球蛋白，包含607个氨基酸残基，其分子量为66.446kda并且其等电点为4.7，目前生物制品生产普遍采用牛血清作为细胞培养的主要成分，但是由于它对人体是一种异源蛋白，注射后可能会引发过敏性休克等不良反应，目前已经有报道的过敏成分主要是牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)和牛血清igg(bovineimmunoglobuling，b-igg)，为了有效控制过敏原含量，《中国药典》第三部中规定疫苗中牛血清白蛋白残留量不得超过50ng/ml。

牛血清白蛋白是抗牛血清蛋白的对应抗体，因此如何能够快速准确地检验生物制品中牛血清白蛋白(bsa)的残留成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术或相关技术中存在的技术问题之一，提供了一种检测生物制品中牛血清白蛋白的试纸及制备方法，该试纸能够快速准确地检验生物制品中牛血清白蛋白(bsa)的残留。

本发明公开了一种检测生物制品中牛血清白蛋白的试纸，从上到下依次包括样品垫、胶体金标记垫、检测反应区、吸水垫以及底板，胶体金标记垫吸附有兔抗牛血清白蛋白抗体，检测反应区设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的两侧分别设有含有包被有牛血清白蛋白(bsa)的检测线以及羊抗兔血清印制的质控线。

根据上述技术方案，优选地，包被有牛血清白蛋白(bsa)为牛血清白蛋白标准品。

根据上述技术方案，优选地，底板由pvc材料制成。

根据上述技术方案，优选地，样品垫用玻璃纤维棉制成。

根据上述技术方案，优选地，吸水垫用吸水滤纸制成。

根据上述技术方案，优选地，检测反应区用硝酸纤维素膜制成。

根据上述技术方案，优选地，胶体金标记垫用尼龙膜制成。

一种检测生物制品中牛血清白蛋白的试纸的制备方法，包括以下步骤：

(1)胶体金标记垫制备：

a.在沸腾的150ml0.02～0.03％氯金酸溶液中加入5ml新鲜配制的1.5％柠檬酸钠，获得胶体金溶液，用冰醋酸调节ph值至4.5-5，低温保存，备用；以1：3000的标记比将待标记的兔抗牛血清白蛋白抗体加入制备的胶体金溶液中，标记15min后加入30％的peg10000至终浓度为0.08％，离心除去未结合的胶体金颗粒，离心除去上清液，获得初步纯化的胶体金标记物蛋白混合物，再用sephadexg-100柱进行分离纯化，获得胶体金标记的兔抗牛血清白蛋白抗体；

b.将标记好胶体金的兔抗牛血清白蛋白抗体均匀点射到尼龙膜上，冷冻干燥，即制得胶体金标记垫。

(2)检测反应区硝酸纤维素膜制备：将包被有牛血清白蛋白和羊抗兔血清分别喷涂在硝酸纤维素膜的两端不同区域，形成匀点射到尼龙膜上，冷冻干燥，即制得胶体金标记垫；检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，然后放入干燥室中干燥。

(3)样品垫制备：将玻璃纤维膜在温度为37℃的缓冲液中浸泡1.5小时，得到样品垫，然后放入干燥室中干燥。

(4)试纸制备：将样品垫、胶体金标记垫、检测反应区以及吸水垫从上到下依次固定在底板上，裁切得到一种检测生物制品中牛血清残留的试纸，然后将试纸与干燥剂一起放入铝箔袋密封包装，5℃贮存。

该试纸的工作原理为：采用胶体金免疫层析技术，当待检样品中含有牛血清白蛋白时，在吸水垫的牵引下由于毛细血管作用牛血清白蛋白先和尼龙膜上胶体金标记的兔抗牛血清白蛋白抗体结合形成复合物，然后复合物通过层析作用向前移动，上行到检测线时，遇到羊抗兔血清，形成二抗、一抗结合一个蛋白的金标复合物，因有金颗粒在此沉积，聚集在检测带上，故检测线显红色，可通过肉眼观察到显色结果。

本发明的试纸使用方法：取生物制品终产品以300g，离心5min，取100-150ul上清液，滴加到制备的试纸的样品垫上，15-20分钟判读结果：如样品中含有牛血清白蛋白，则其经过胶体金标记垫时，会与兔抗牛血清白蛋白抗体结合，进而被检测线上的羊抗兔血清捕获，聚集在检测带上形成红色的沉淀，即为阳性，反之则为阴性。

本发明的有益效果体现在：由于牛血清白蛋白残留量是判定生物制品是否合格的关键指标，《中国药典》规定的酶联免疫检测法用时较长，通过胶体金免疫层析法可以快速检测生物制品中牛血清白蛋白残留量是否合格，本方法可以直接快速的检测牛血清白蛋白残留量是否合格，不需专业培训，操作方便，快速，适合生物制品研发及生产使用。

附图说明

图1示出了dna法与本发明试纸条检测结果统计。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。

实施例1：

一种检测生物制品中牛血清白蛋白残留的试纸，从上到下依次包括样品垫、胶体金标记垫、检测反应区、吸水垫以及底板，胶体金标记垫吸附有兔抗牛血清白蛋白抗体，检测反应区设有包被有羊抗兔血清质控线的硝酸纤维素膜以及牛血清白蛋白印制的检测线。

根据上述实施例，优选地，包被有牛血清白蛋白为牛血清白蛋白标准品。

根据上述实施例，优选地，底板由pvc材料制成。

根据上述实施例，优选地，样品垫用玻璃纤维棉制成。

根据上述实施例，优选地，吸水垫用吸水滤纸制成。

根据上述实施例，优选地，检测反应区用硝酸纤维素膜制成。

根据上述实施例，优选地，胶体金标记垫用尼龙膜制成。

一种检测生物制品中牛血清白蛋白残留的试纸的制备方法，包括以下步骤：

(1)胶体金标记垫制备：

a.在沸腾的150ml0.02％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1.5％柠檬酸钠5ml，获得直径为20nm的胶体金溶液，用3mol/l的冰醋酸调节ph值至4.5，置于1℃保存，备用；以1：3000的标记比将待标记的兔抗牛血清白蛋白抗体加入ph值为8的胶体金溶液中，标记15min后加入30％的peg10000至终浓度为0.08％，5℃、600g离心30min，除去未结合的胶体金颗粒，3℃、12000rpm离心1h，除去上清液，获得初步纯化的胶体金标记物蛋白混合物，再用sephadexg-100柱进行分离纯化，获得胶体金标记的兔抗牛血清白蛋白抗体；

b.将标记好胶体金的抗牛血清蛋白均匀点射到尼龙膜上，冷冻干燥，即制得胶体金标记垫。

(2)检测反应区硝酸纤维素膜制备：将包被有牛血清白蛋白和羊抗兔血清分别喷在硝酸纤维素膜的两端不同区域，形成质控线和检测线，得到含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，然后放入干燥室中干燥；包被有牛血清白蛋白浓度为50ng/ml；羊抗兔血清浓度为2.5mg/ml。

(3)样品垫制备：将玻璃纤维膜在温度为37℃的缓冲液中浸泡1.5小时，得到样品垫，然后放入干燥室中干燥；缓冲液是指磷酸盐缓冲液，先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中，用1mol/l氢氧化钠溶液校正ph7.5。

(4)试纸制备：将样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在底板上，裁切得到一种检测生物制品中牛血清白蛋白残留的试纸，然后将试纸与干燥剂一起放入铝箔袋密封包装，5℃贮存。

实施例2：

一种检测生物制品中牛血清白蛋白残留的试纸，从上到下依次包括样品垫、胶体金标记垫、检测反应区、吸水垫以及底板，胶体金标记垫吸附有兔抗牛血清白蛋白抗体，检测反应区设有包被有羊抗兔血清检测线的硝酸纤维素膜以及牛血清白蛋白印制的质控线，包被有牛血清白蛋白为牛血清标准品。

一种检测生物制品中牛血清白蛋白残留的试纸的制备方法，包括以下步骤：

(1)胶体金标记垫制备：

a.在沸腾的150ml0.025％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1.5％柠檬酸钠5ml，获得直径为25nm的胶体金溶液，用3mol/l的冰醋酸调节ph值至4.7，置于2.5℃保存，备用；以1：3000的标记比将待标记的兔抗牛血清白蛋白抗体加入ph8.5的胶体金溶液中，标记15min后加入30％的peg10000至终浓度为0.08％，5℃、1000g离心30min，除去未结合的胶体金颗粒，3℃、12000rpm离心1h，除去上清液，获得初步纯化的胶体金标记物蛋白混合物，再用sephadexg-100柱进行分离纯化，获得胶体金标记的兔抗牛血清白蛋白抗体；

b.将标记好胶体金的兔抗牛血清白蛋白抗体均匀点射到尼龙膜上，冷冻干燥，即制得胶体金标记垫。

(2)检测反应区硝酸纤维素膜制备：将包被有牛血清白蛋白和羊抗兔血清蛋白分别喷在硝酸纤维素膜的两端不同区域，形成质控线和检测线，得到含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，然后放入干燥室中干燥；包被有牛血清白蛋白浓度为50ng/ml；兔抗牛血清蛋白浓度为2.5mg/ml。

(3)样品垫制备：将玻璃纤维膜在温度为37℃的缓冲液中浸泡1.5小时，得到样品垫，然后放入干燥室中干燥；缓冲液是指磷酸盐缓冲液，先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中，用1mol/l氢氧化钠溶液校正ph7.75。

(4)试纸制备：将样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在底板上，裁切得到一种检测生物制品中牛血清白蛋白残留的试纸，然后将试纸与干燥剂一起放入铝箔袋密封包装，5℃贮存。

实施例3：

一种检测生物制品中牛血清白蛋白残留的试纸，从上到下依次包括样品垫、胶体金标记垫、检测反应区、吸水垫以及底板，胶体金标记垫吸附有兔抗牛血清白蛋白抗体；检测反应区设有包被有羊抗兔血清检测线的硝酸纤维素膜，以及牛血清白蛋白印制的质控线,包被有牛血清白蛋白为牛血清标准品。

一种检测生物制品中牛血清白蛋白残留的试纸的制备方法,包括以下步骤：

(1)胶体金标记垫制备：

a.在沸腾的150ml0.03％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1.5％柠檬酸钠5ml，获得直径为30nm的胶体金溶液，用3mol/l的冰醋酸调节ph值至5，置于5℃保存，备用；以1：3000的标记比将待标记的兔抗牛血清白蛋白抗体加入ph5的胶体金溶液中，标记15min后加入30％的peg10000至终浓度为0.08％，5℃、1600g离心30min，除去未结合的胶体金颗粒，3℃、12000rpm离心1h，除去上清液，获得初步纯化的胶体金标记物蛋白混合物，再用sephadexg-100柱进行分离纯化，获得胶体金标记的兔抗牛血清白蛋白抗体；

b.将标记好胶体金的兔抗牛血清白蛋白抗体均匀点射到尼龙膜上，冷冻干燥，即制得胶体金标记垫。

(2)检测反应区硝酸纤维素膜制备：将包被有牛血清白蛋白和羊抗兔血清白蛋白分别喷在硝酸纤维素膜的两端不同区域，形成质控和检测线线，得到含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，然后放入干燥室中干燥；包被有牛血清白蛋白浓度为50ng/ml；兔抗牛血清蛋白浓度为2.5mg/ml。

(3)样品垫制备：将玻璃纤维膜在温度为37℃的缓冲液中浸泡1.5小时，得到样品垫，然后放入干燥室中干燥；缓冲液是指磷酸盐缓冲液，先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中，用1mol/l氢氧化钠溶液校正ph7.5。

(4)试纸制备：将样品垫、胶体金标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在底板上，裁切得到一种检测血清中牛血清白蛋白igm的试纸，然后将试纸与干燥剂一起放入铝箔袋密封包装，5℃贮存。

研发统计试验：

检测结果如图1所示，研发实验中所得生物制品的牛血清白蛋白残留检测：收集50批次生物制品终产品上清作为样本，牛血清标准品进行5个梯度稀释，每个梯度复检3次，与传统常用的牛血清白蛋白酶联免疫检测试剂盒比较，本发明试纸条法有1例牛血清白蛋白未超标被检出，其灵敏度为99.0％，特异性为100％。

本发明的有益效果体现在：本方法可以直接快速的检测牛血清白蛋白残留量是否合格，本发明的检测试纸条具有较高的灵敏度和特异性，不需专业培训，操作方便，快速，适合生物制品研发及生产使用，适合研发生产应用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。