建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒的制作方法

本发明属于基因重组及蛋白制备技术领域。

背景技术：

感染性疾病是指由致病微生物（细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、真菌等）通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病，其中最常见是细菌和病毒感染，需要快速诊断细菌或病毒感染，指导临床治疗方向。临床上常用检测血清中降钙素原（procalcitonin,pct）指标，来快速诊断细菌感染发生，指导抗细菌感染治疗。目前，还没有一个血液学指标能诊断病毒感染发生，需要寻找判定病毒感染血液指标，而血液中单核细胞产生粘病毒抗性基因蛋白a(myxovirusresistanceproteina，mxa）有潜力作为病毒感染指标,用于早期诊断病毒感染发生。

mxa是血液单核细胞质中蛋白，mxa基因位于21号染色体长臂远端(21q22),经ifn-α/β处理细胞，诱导产生78kdamxa蛋白，mxa属于大gtp酶的动态蛋白(dynamin)超家族成员，mxa的特征是相对高分子量,自我聚合倾向,相对比较低gtp亲和力和高gtp水解速率，不同种群mxa蛋白间的同源性很高。

mxa蛋白主要由3个区域组成:(1)n端gtpase结构域,由约300个氨基酸组成,是gtp酶活性区,包含3个gtp结合基序，1个自我组装区;(2)中央相互作用结构域:约含有150个氨基酸;(3)c端gtpase效应结构域,约含有100个氨基酸,其中含2个亮氨酸拉链结构,形成分子双螺旋结构。

技术实现要素：

本发明的目的是用sf9细胞表达flag-mxa，纯化出mxa蛋白，作为校准品。制备时间分辨荧光免疫层析法检测mxa试纸卡，用时间分辨荧光免疫法分析仪测定试纸卡荧光强度，进一步获得样品中mxa浓度的建立时间分辨荧光免疫层析法检测mxa试剂盒。

本发明包括试纸卡和低渗溶液；在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有mxa抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。

本发明硝酸纤维素膜上包被有mxa抗体形成检测线和抗igg抗体形成质控线。

本发明荧光微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，直径为100-500nm；根据权利要求1所述的荧光微球标记镧系元素螯合物，包括铕(eu)、钐(sm)、铒(er)、钕(nd)螯合物中一种；进一步优选为铕螯合物(europiumchelate)，激发波长是420nm，发射波长是615nm。

本发明低渗溶液是tris,磷酸盐，碳酸盐缓冲液，盐浓度低于10mm,含0.1-0.5%np-40,用于裂解细胞，释放出细胞内的蛋白。

本发明所用时间分辨荧光免疫层析（trfia）分析仪，波长350-430nm激发光作用后，延时100-400us，再测定波长600-650nm荧光强度。

本发明mxa抗体-荧光微球，选用镧系元素螯合物荧光标记羧基修饰微球，用碳二亚胺(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)处理羧基修饰荧光微球后，mxa抗体偶联到上述荧光微球上，mxa抗体与荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪将mxa抗体-荧光微球喷涂于结合垫上，干燥后，封存备用。

本发明制备mxa校准品：用pcr从pcs6-mx1扩增出mxadna（核酸序列1-1989），构建pfastbac-flag-mxa载体，转导到hd10bac细菌中，产生重组flag-mxaacnpv（昆虫病毒）质粒；再转导此质粒进到昆虫细胞（sf9细胞），产生重组flag-mxaacnpv；此病毒感染sf9细胞后，表达出flag-mxa蛋白；用anti-flag抗体亲和层析法纯化出flag-mxa蛋白，此纯化flag-mxa蛋白作为校准品。

本发明flag-mxa为校准品，用trfia分析仪测定不同浓度mxa校准品试纸卡检测线上呈现荧光强度，制备mxa浓度标准曲线，建立mxa浓度标准卡，输入到trfia分析仪，建立trfia分析仪自动显示样品中mxa浓度检测系统。

本发明采用昆虫细胞系统表达mxa，昆虫细胞近似于人体细胞，但产量高，成本低，能大量生产，纯化出mxa具有蛋白自然结构和抗原性，能作为trfia检测mxa浓度试剂盒的校准品。

附图说明

图1是侧向免疫层析法试纸条侧面图；

图2是包装外壳后侧向免疫层析法试纸卡示意图；图1和图2中1是底板，2是样品垫，3是结合垫，4是硝酸纤维素膜，5是检测线，6是质控线，7是吸水垫，8是样品窗口，9是检测窗口，10是塑料外壳；

图3是侧向免疫层析法试纸条长度示意图；

图4是pcr产物；

图5是sall/xhol切割pfastbac-mxa质粒dna；

图6是flag-mxaacnpv重组质粒pcr产物；

图7是银染法测定flag-mxa纯度；

图8是mxa抗体的免疫印迹分析；

图9是bsa浓度标准曲线；

图10是mxa浓度标准曲线；

图11是mxa浓度敏感度曲线；

图12是mxa蛋白结构示意图。

具体实施方式

本发明是用纯化的重组mxa蛋白为校准品，建立时间分辨荧光免疫层析法检测mxa试剂盒过程，是表达和纯化出flag-mxa，及用时间分辨荧光免疫层析法定量检测mxa过程。

研究发现，病毒感染人体后，诱导人体细胞分泌的一种具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性的宿主特异性糖蛋白，称为干扰素（interferon，ifn），是机体防御系统的重要组成部分，由于ifn在血液中寿命很短，不适合作为检测指标。i型inf(α/β)进一步诱导人外周血单核细胞，巨噬细胞产生mxa，又称inf诱导蛋白p78(interferon-inducibleproteinp78,ifi78)，mxa分布于细胞质中的蛋白质,具有广谱的抗病毒活性,对多种rna病毒和部分dna病毒均有抑制作用，并且mxa水平是代表病毒诱导机体产生ifn状态指标。

试验表明，人单核细胞在受到人免疫缺陷病毒（hiv）感染后６小时可产生ｍxa，14天达高峰，ｍxa表达可不依赖ifn的存在。腺病毒３型可诱导ｍxa蛋白产生，ｍxa对病毒反应非常敏感，高度稀释腺病毒３型可以诱导ｍxa产生。

单核细胞中mxa基础浓度很低，但ⅰ型ifn（α/β)及多种病毒诱导后，人外周血单个核细胞中产生大量mxa，尤以人单核白细胞对inf敏感性高，合成大量mxa，可占细胞质蛋白总量0.5%；mxa半衰期较长，达2.5天。mxa表现出基础值低，正常人群中mxa值低于100ng/ml，而病毒感染人群mxa值可高达1000ng/ml以上，适合作为病毒感染早期诊断血液学指标。另外，其它细胞因子，如il-1或tnfα，不诱导mxa水平增高；细菌、真菌、寄生虫及其它微生物感染，不能诱导细胞mxa表达，表明ｍxa是病毒感染特异性指标。

许多病毒种类，包括呼吸道合胞病毒、腺毒毒、轮状病毒、流感病毒、疱疹病毒、eb病毒等，可诱导细胞表达mxa增高，表明ｍxa不是鉴定病毒感染类型的指标。

急性感染病人，儿科病人，重症病人，icu病人，大创伤及休克病人都需要简单，快速鉴别细菌感染或病毒感染，指导药物治疗，并监测病性进展。本发明采用侧向免疫层析法（lateralflowimmunoassay,lfia）测定外周血单核细胞裂解液中mxa，15分钟内出结果，用时间分辨荧光免疫法（time-resolvedfluoroimmunoassay，trfia)定量检测mxa浓度，快速，准确地检测出样品中mxa浓度，用于诊断急性病毒感染发生。

一．制备mxa校准品

本发明采用昆虫细胞系统表达mxa，昆虫细胞近似于人体细胞，但产量高，成本低，能大量生产，纯化出mxa具有蛋白自然结构和抗原性，能作为trfia检测mxa浓度试剂盒的校准品。

用pcr从pcs6-mx1扩增出mxadna（核酸序列1-1989）。选用昆虫细胞表达载体pfastbac-flag,含polyhedrin启动子，在昆虫细胞中表达外源性蛋白；此载体插入8个氨基酸残基（dykddddk）短肽（flag）dna序列,用于表达flag融合蛋白；此载体带有部分acnpvdna序列，用于在hd10bac细菌中产生基因重组昆虫病毒（acnpv）质粒。用内切酶ndei/sali切割mxadna，ndei/xhoi切割pfastbac-flag，将mxadna连接到pfastbac-flagndei/xhoi部位，构建pfastbac-flag-mxa载体，转导到hd10bac细菌中，产生重组flag-mxaacnpv质粒；再转导此质粒进到sf9细胞，产生重组flag-mxaacnpv；此病毒感染sf9细胞后，表达出flag-mxa蛋白。

本发明表达全长mxa（1-662氨基酸残基），n-端带有flag标记短肽，用anti-flagm2affinityagarose亲合层析法分离和纯化出flag-mxa。

纯化flag-mxa进行sds-page电泳，再做银染法，测定flag-mxa纯度达到98%以上；westernblot法进一步证实，抗mxa抗体结合flag-mxa蛋白。用纯化flag-mxa作为校准品，-80℃冻存。

二．制备时间分辨荧光免疫层析法检测mxa试纸卡

本发明所述的时间分辨荧光免疫层析法检测mxa试剂盒，由试纸卡和低渗溶液组成。

所述试纸卡，是在底板上顺次相互搭接预处理样品垫、吸附有mxa抗体-荧光微球结合垫、喷涂有检测线和质控线硝酸纤维素膜和吸水垫，组装成试纸板，然后切割成3-5mm宽试纸条，将试纸条装入塑料外壳中形成试纸卡。

所述结合垫上吸附的荧光微球，直径范围100-500nm，进一步优选，所选用荧光微球直径是300nm。

所述荧光微球标记有镧系元素螯合物，包括铕(eu)、钐(sm)、铒(er)、钕(nd)螯合物中的任意一种或几种。进一步优选，为铕螯合物(europiumchelate)，在420nm激发光源作用下，发射出波长615nm荧光。

所述与荧光微球偶联抗体为羊抗mxa抗体；所述检测线包被为mxa单克隆抗体;所述质控线包被抗体为抗羊igg抗体。

所述的低渗溶液是tris,磷酸盐，碳酸盐缓冲液，盐浓度低于10mm，含0.1-0.5%np-40。

所述trfia分析仪，在350-430nm波长激发光作用后，延时100-400us，测定600-650nm波长荧光强度。对mxa检测范围为0.1-100ng/ml。

1.制备mxa抗体-荧光微球

(1)加mxa抗体到抗体净化和浓缩离心柱中（innovabiosciences）,按说明书步骤，净化和浓缩mxa抗体，用磷酸盐缓冲液调节mxa抗体浓度到0.5-2.0mg/ml；

(2)用25mmolmes缓冲液(ph6.0)洗涤铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，加入5-20mmol碳二亚胺(edc)和10-40mmoln-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)，室温下,反应10-30分钟。

（3）用上述mes缓冲液洗涤荧光微球，用50mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)复溶微球后，加入净化后mxa抗体，使mxa抗体与荧光微球的质量比为1:50-1:10，室温下，反应2小时。

（4）用200mmtris(ph7.5)终止反应，0.2%bsa，0.01%tween-20，50mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)洗涤荧光微球，再复溶mxa抗体-荧光微球。

2.制备吸附mxa抗体-荧光微球结合垫

用10mm磷酸盐缓冲液（ph8.0）,0.1%bsa，10%sucrose,0.1%peg,0.1%pvp,0.02%tween20,0.01%nan3复溶amh抗体-荧光微球至需要浓度。本发明选用玻璃纤维结合垫，预处理后，上述玻璃纤维膜放在bio-dotxyz3060三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头，5ul-15ul/cm速度，将mxa抗体-荧光微球喷到玻璃纤维膜上，37°c烘干2-5小时，干燥封存，备用。

3.制备包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜

用5mm磷酸盐缓冲液（ph8.0）含10%sucrose,0.01%tween20，0.01%nan3溶解mxa抗体和抗igg抗体至需要浓度，将硝酸纤维素膜放在bio-dotxyz3060三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头，0.8-1.5ul/cm速度，将amh抗体和抗鼠igg抗体喷到硝酸纤维素膜上，两线间隔4-6mm,37°c烘干2-5小时，干燥封存,备用。

4.组装trfia免疫层析法检测mxa试纸卡

在底板上依次粘贴预理样品垫、吸附mxa抗体-荧光微球结合垫、包被有检测线和质控线硝酸纤维素膜和吸水垫，形成试纸板，再切割成4mm宽试纸条，将试纸条装入塑料外壳中形成试纸卡。

三．trfia分析仪检测mxa浓度程序设定

本发明用铕螯合物为荧光物，铕螯合物峰值激发波长420nm，峰值发射波长是615nm,stocks位移较大，可有效排除普通非特异性荧光对检测荧光的干扰。铕螯合物的萤光寿命较长,可达到数百微秒（us）,而普通荧光团的荧光衰变时间只有1〜100μs，样品中的一些蛋白质荧光衰变时间更短，仅为1〜10μs。用trfia分析仪测定铕螯合物荧光强度，延时100-400μs后,待背景荧光和蛋白质荧光完全衰减后，再测定铕螯合物荧光信号。

本发明使用trfia分析仪,激发波长350-430nm，接收波长600-650nm，延时100-400μs后，测定试纸卡检测线及质控线上荧光强度。

四．建立时间分辨荧光免疫层析法检测mxa浓度方法

用低渗溶液稀释纯化flag-mxa浓度到0,50，100，200，500，1000，2000ng/ml，作为mxa校准品,加5ulmxa校准品到试纸卡的样品窗口部位，再加150ul低渗液样品窗口部位，进行膜层析反应，10-15分钟后，用trfia分析仪检测线试纸卡检测线和质控线的荧光强度。以mxa校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度为横坐标，制备mxa校准品浓度标准曲线，再获得mxa浓度标准卡，输入trfia分析仪，建立trfia分析仪自动显示mxa浓度系统。进一步测定5μ1全血中mxa浓度。

本发明包括试纸卡和低渗溶液；在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有mxa抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。

本发明硝酸纤维素膜上包被有mxa抗体形成检测线和抗igg抗体形成质控线。

本发明荧光微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，直径为100-500nm；根据权利要求1所述的荧光微球标记镧系元素螯合物，包括铕(eu)、钐(sm)、铒(er)、钕(nd)螯合物中一种；进一步优选为铕螯合物(europiumchelate)，激发波长是420nm，发射波长是615nm。

本发明低渗溶液是tris,磷酸盐，碳酸盐缓冲液，盐浓度低于10mm,含0.1-0.5%np-40,用于裂解细胞，释放出细胞内的蛋白。

本发明所用时间分辨荧光免疫层析（trfia）分析仪，波长350-430nm激发光作用后，延时100-400us，再测定波长600-650nm荧光强度。

本发明mxa抗体-荧光微球，选用镧系元素螯合物荧光标记羧基修饰微球，用碳二亚胺(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)处理羧基修饰荧光微球后，mxa抗体偶联到上述荧光微球上，mxa抗体与荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪将mxa抗体-荧光微球喷涂于结合垫上，干燥后，封存备用。

本发明制备mxa校准品：用pcr从pcs6-mx1扩增出mxadna（核酸序列1-1989），构建pfastbac-flag-mxa载体，转导到hd10bac细菌中，产生重组flag-mxaacnpv（昆虫病毒）质粒；再转导此质粒进到昆虫细胞（sf9细胞），产生重组flag-mxaacnpv；此病毒感染sf9细胞后，表达出flag-mxa蛋白；用anti-flag抗体亲和层析法纯化出flag-mxa蛋白，此纯化flag-mxa蛋白作为校准品。

本发明flag-mxa为校准品，用trfia分析仪测定不同浓度mxa校准品试纸卡检测线上呈现荧光强度，制备mxa浓度标准曲线，建立mxa浓度标准卡，输入到trfia分析仪，建立trfia分析仪自动显示样品中mxa浓度检测系统。

结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步实验过程：

一.制备flag-mxa蛋白

（一）pcr扩增mxadna

1.合成mxa引物，引物-1:tttttcatatggttgtttccgaagtggacatc；

引物-2:tttttctcgagttaaccggggaactgggcaagcc

2.进行pcr

5xreactionbuffer10ul

5xhighgcenhancer10ul

10mmdntp1ul

25pm/ul引物-11ul

25pm/ul引物-21ul

pcs6-mx1dna10ng

q5hf-dnapolymerase0.5ul

h2o到50ul

3.pcr条件如下：

a．95℃2分钟

b．95℃1分钟

c．56℃1分钟

d．72℃1.5分钟

重复b-d步骤30次

e．95℃1分钟30秒

f．56℃1分钟30秒

g．72℃7分钟

冷却到25℃，完成pcr

4.吸取5ulpcr产物，加2ul5xdnaloadingbuffer

5.放在1%agarose/tbe凝胶电泳孔中，进行电泳

6.用eb进行dna染色，紫外线下观察2.0kbdna条带(图4孔1,2)

7.其余pcr产物，加100ulh2o，再加150ul苯酚/氯仿/异戊醇（25/24/1），混合

8.离心，13000rpm,5分钟

9.收取上清液，加15ul5mnacl,800ul乙醇，混合，-20℃，过夜

10.4℃条件下,离心，13000rpm,20分钟

11.去除上清液，加800ul70%乙醇，4℃条件下,离心，13000rpm,10分钟

去除上清液，干燥微量离心管底部dna，加50ulh20溶解dna。

（三）构建fastbac-flag-mxa质粒

1.用ndei/xhoi内切酶（newenglandbiolabs）切割dna

pcrdna产物48ul

cutsmartbuffer6ul

ndei3ul

xhoi3ul

pfastbac-flag载体dna3ul（3ug）

cutsmartbuffer6ul

ndei3ul

xhoi3ul

h2045ul

混均，37℃反应2小时，

2.放在1%agarose/tbe胶电泳孔中，进行电泳

3.eb进行dna染色，紫外线下观察2.0kb（pcr产物）和4.6kb（载体）dna条带，分别切割下dna条带,分别放到1.5ml微量离心管中

4.用qiaquickgelextractionkit(qiagen),提取agarose条带中dna,按说明书步骤操作，用nanodropspectrophotometer测定提取dna浓度

5.用t4dnaligase(newenglandbiolabs.)，连接pcrdna片段pfastbac-flag载体中，

在1.5ml微量离心管中加入以下物质

pcrdna（ndei/xhoi）60ng

载体dna（ndei/xhoi）30ng

10xt4dnaligasebuffer1.0ul

t4dnaligase0.5ul

h2o到10ul

混均，25℃，反应4小时，

6.放微量离心管在冰块上，加100ul感受态细菌（xl10gold细菌株），轻轻混合，冰块上放置30分钟

7.放微量离心管在42℃水浴条件下，50秒，再放到冰块上3分钟

8.加700ullb培养液，37℃，摇动1小时

9.离心，10000g,5分钟，去除上清液，收集微量离心管底部细菌

10.涂种在100ug/mlampicillinlb-琼脂板上，37℃，培养过夜

11.挑选单个菌落，接种到3ml100ug/mlampicillinlb培养液中，37℃，摇动，过夜

12.提取细菌质粒dna，用purelinkquickplasmidminiprepkits(lifetechnologiesinc.)，按说明书步骤操作，用nanodropspectrophotometer测定提取dna浓度

13.限制性内切酶（newenglandbiolabs），切割pfastbac-flag-mxadna

dna1.0ug

cutsmartbuffer2.0ul

bamhi1.0ul

xhoi1.0ul

h2o到20ul

混均，37℃,反应2小时，

14.放在1%agarose/tbe胶电泳孔中，进行电泳

15.eb进行dna染色，紫外线下观察形成dna条带

16.选出900bp,6.0kbdna条带质粒（图5孔1，2）为fastbac-flag-mxa阳性质粒

17.用mxadna测序引物，引物-1:tttttcatatggttgtttccgaagtggacatc；

引物-2:tttttctcgagttaaccggggaactgggcaagcc进行dna序列测定

18.选择出正确mxadna序列的pfastbac-flag-mxa质粒dna。

mxadna序列（1-1989bp）

atggttgtttccgaagtggacatcgcaaaagctgatcc

agctgctgcatcccaccctctattactgaatggagatgctactgtggcccagaaaaatcc

aggctcggtggctgagaacaacctgtgcagccagtatgaggagaaggtgcgcccctgcat

cgacctcattgactccctgcgggctctaggtgtggagcaggacctggccctgccagccat

cgccgtcatcggggaccagagctcgggcaagagctccgtgttggaggcactgtcaggagt

tgcccttcccagaggcagcgggatcgtgaccagatgcccgctggtgctgaaactgaagaa

acttgtgaacgaagataagtggagaggcaaggtcagttaccaggactacgagattgagat

ttcggatgcttcagaggtagaaaaggaaattaataaagcccagaatgccatcgccgggga

aggaatgggaatcagtcatgagctaatcaccctggagatcagctcccgagatgtcccgga

tctgactctaatagaccttcctggcataaccagagtggctgtgggcaatcagcctgctga

cattgggtataagatcaagacactcatcaagaagtacatccagaggcaggagacaatcag

cctggtggtggtccccagtaatgtggacatcgccaccacagaggctctcagcatggccca

ggaggtggaccccgagggagacaggaccatcggaatcttgacgaagcctgatctggtgga

caaaggaactgaagacaaggttgtggacgtggtgcggaacctcgtgttccacctgaagaa

gggttacatgattgtcaagtgccggggccagcaggagatccaggaccagctgagcctgtc

cgaagccctgcagagagagaagatcttctttgagaaccacccatatttcagggatctgct

ggaggaaggaaaggccacggttccctgcctggcagaaaaacttaccagcgagctcatcac

acatatctgtaaatctctgcccctgttagaaaatcaaatcaaggagactcaccagagaat

aacagaggagctacaaaagtatggtgtcgacataccggaagacgaaaatgaaaaaatgtt

cttcctgatagataaagttaatgcctttaatcaggacatcactgctctcatgcaaggaga

ggaaactgtaggggaggaagacattcggctgtttaccagactccgacacgagttccacaa

atggagtacaataattgaaaacaattttcaagaaggccataaaattttgagtagaaaaat

ccagaaatttgaaaatcagtatcgtggtagagagctgccaggctttgtgaattacaggac

atttgagacaatcgtgaaacagcaaatcaaggcactggaagagccggctgtggatatgct

acacaccgtgacggatatggtccggcttgctttcacagatgtttcgataaaaaattttga

agagttttttaacctccacagaaccgccaagtccaaaattgaagacattagagcagaaca

agagagagaaggtgagaagctgatccgcctccacttccagatggaacagattgtctactg

ccaggaccaggtatacaggggtgcattgcagaaggtcagagagaaggagctggaagaaga

aaagaagaagaaatcctgggattttggggctttccagtccagctcggcaacagactcttc

catggaggagatctttcagcacctgatggcctatcaccaggaggccagcaagcgcatctc

cagccacatccctttgatcatccagttcttcatgctccagacgtacggccagcagcttca

gaaggccatgctgcagctcctgcaggacaaggacacctacagctggctcctgaaggagcg

gagcgacaccagcgacaagcggaagttcctgaaggagcggcttgcacggctgacgcaggc

tcggcgccggcttgcccagttccccggttaa

（四）制备重组flag-mxaacnpv质粒

1.取50ng,pfastbac-flag-mxadna放入微量离心管中，再放在冰块上，加100ul感受态hd10bac细菌，轻轻混合，冰块上,放置30分钟

2.放微量离心管在42℃水浴条件下，50秒，再放到冰块上3分钟

3.加700ullb培养液，37℃摇动4小时培养细菌

4.取20ul细菌液，涂种在50ug/mlkanamycin,7ug/mlgentamicin,10ug/mltetracycline,100ug/mlx-gal,40ug/mliptglb-琼脂板上，37℃，培养过夜

5.挑选单个白色菌落，接种到3ml50ug/mlkanamycin,7ug/mlgentamicin,10ug/mltetracyclinelb培养液中，37℃，摇动，培养过夜

6.提取细菌质粒dna

a.加1.5ml细菌液到微量离心管中，离心，13000rpm3分钟,去除上清液,

b.加300ulbufferi（15mmtris,ph8.0,10mmedta,100ug/mlrnasea）到微量离心管中,均匀悬浮细菌

c.加300ulbufferii(0.2nnaoh,1%sds)到微量离心管中,上下倒置微量离心管8次，放置室温下，5分钟

d.加300ulbufferiii(kch3coo,ph5.5)到微量离心管中,上下倒置微量离心管8次，放置微量离心管在冰块中，10分钟

e.离心，13000rpm，10分钟

f.转移700ul离心上清液到微量离心管中，加700ulisopropanol到微量离心管中，混均，放置-20°c条件下，过夜

g.离心，14000g，20分钟，去除上清液，

h.加1.0ml70%ethanol到微量离心管中，洗涤，14000g，10分钟，去除上清液

i.干燥微量离心管底部dna

j.加40ultebuffer到微量离心管中，溶解dna

7.用mxa引物-1,引物-2进行pcr

5xreactionbuffer10ul

5xhighgcenhancer10ul

10mmdntp1ul

25pm/ul引物-11ul

25pm/ul引物-21ul

重组flag-mxaacnpv质粒dna1ul

q5hf-dnapolymerase0.5ul

h2o到50ul

8.pcr条件如下：

a．95℃2分钟

b．95℃1分钟

c．56℃1分钟

d．72℃1.5分钟

重复b-d步骤30次

e．95℃1分钟30秒

f．56℃1分钟30秒

g．72℃7分钟

冷却到25℃，完成pcr

9.吸取10ulpcr产物，加3ul5xdnaloadingbuffer

10.放在1%agarose/tbe凝胶电泳孔中，进行电泳

11.用eb进行dna染色，紫外线下观察2.0kpdna条带(图6孔1-4)质粒为阳性flag-mxaacnpv重组质粒。

（五）制备flag-mxaacnpv

1.溶液a：6ul重组flag-mxaacnpvdna+100ultnm-fh液（nofbs，noantibiotics）

2.溶液b：6ulcellfectin(invitrogen)+100ultnm-fh液(nofbs，noantibiotics）

3.混合溶液a和溶液b，用微量移液器轻轻吹吸3次，室温下，放置30分钟后，加800ultnm-fh液,混匀,成为质粒dna细胞转染液

4.吸出6孔培养皿中sf9细胞tnm-fh培养液，加2mltnm-fh液，洗涤sf9细胞一次

5.加质粒dna细胞转染液到sf9细胞培养皿中，放在摇床上缓慢摇动，室温下，5小时

6.从sf9细胞培养皿吸出质粒dna细胞转染液，加2.0ml含有10%fbstnm-fh培养液,28℃，培养3天

7.吸取细胞培养液到离心管中，3000rpm,离心10分钟，收集上清液，做为flag-mxaacnpv液

8.加2x10⁶sf9细胞到100mm细胞培养皿中,加5ml含10%fbs的tnm-fh培养液,28℃，放置4小时

9.吸出旧tnm-fh培养液,加5ml含10%fbs的tnm-fh培养液，加100ulflag-mxaacnpv液到sf9细胞培养皿中

10.室温下，轻轻摇动sf9细胞培养皿，1小时

11.加5ml含10%fbs的tnm-fh培养液到sf9细胞培养皿中，28℃，培养3天

12.吸取细胞培养液到离心管中，3000rpm,离心10分钟，收集上清液，为扩增flag-mxaacnpv液。

（六）制备flag-mxa蛋白

1.加8x10⁶sf9细胞到150mm细胞培养皿中,加20ml含10%fbstnm-fh培养液,28℃，放置4小时

2.吸出旧tnm-fh培养液,加10ml含10%fbs的tnm-fh培养液，加300ulflag-mxaacnpv到sf9细胞培养皿中

3.室温下，轻轻摇动sf9细胞培养皿，1小时

4.加20ml含10%fbstnm-fh培养液到sf9细胞培养皿中，28℃，培养3天

5.收集sf9细胞到50ml离心管中，离心，3000rpm,5分钟

6.去除上清液，加20mlpbs到离心管中，离心，3000rpm,5分钟，

7.加1mlpbs到离心管中,转移sf9细胞到1.5ml微量离心管中

8.离心，3000rpm,5分钟，去除上清液

9.加1.0ml细胞溶解溶液(10mmhepesph7.5,100mmnacl,0.5%np-40,1mmedta,1mmdtt,1mmpmsf,10ug/mlleupetine,10ug/mlaprotinin)到微量离心管中,用微量移液器轻轻吹吸，混均，放置在冰块中15分钟

10.在4℃条件下，离心，5000rpm,5分钟，转移上清液到新1.5ml微量离心管中

11.在4℃条件下，离心，13000rpm,20分钟

12.转移上清液（sf9细胞溶解液）到新1.5ml微量离心管中

13.取50ulanti-flagm2affinityagarose（sigma-aldrich）放到1.5ml微量离心管中

14.加1.2ml洗涤液(40mmtrisph8.0,300mmnacl,5%glycerol,0.01%np-40,1mmedta,1mmdtt,1mmpmsf,10ug/mlleupetine,10ug/mlaprotinin)到anti-flagm2affinityagarose微量离心管中，

15.在4℃条件下，离心，3000g,1分钟，吸出上清，重复洗涤2次

16.加sf9细胞溶解液到anti-flagm2affinityagarose微量离心管中

17.在4℃条件下，摇动微量离心管，1.5小时

18.在4℃条件下，离心，3000rpm,1分钟，吸除上清液

19.加1.2ml洗涤液到anti-flagm2affinityagarose微量离心管中，在4℃条件下，摇动微量离心管，20分钟

20.在4℃条件下，离心，3000rpm,1分钟，吸除洗涤液,相同条件，重复洗涤3次

21.加50ul洗脱液（0.1mglycine-hcl,ph2.5）到anti-flagm2affinityagarose微量离心管中,用微量移液器轻轻吹吸,放置在冰块中2分钟

22.在4℃条件下，离心，6000rpm,30秒，吸取上清液，到新微量离心管中，含2ul中和液(2mtris,ph8.0,3mnacl),混均，相同条件，重复洗脱4次,

23.结合4次洗脱液，转入到透析袋(spectra/pro)中，放在透析液(20mmtris,ph7.5,150mmnacl,5%glycerol,1mmdtt,1mmedta)中，在4℃条件下，缓慢搅动，过夜

24.收集透析袋中蛋白液体移到微量离心管中，在4℃条件下，离心，13000rpm,10分钟，

25.分装蛋白液到不同微量离心管中，4℃短期保存，-20℃或-80℃长期保存。

（七）测定纯化flag-mxa

a．银染法测定flag-mxa纯度

1.冻存10ul蛋白液放到37℃水浴中，快速溶化，放到冰块中，

2.加4ul4x蛋白加样液（50mmtris，ph6.8，2%sds,20%glycerol,1%β-mercaptoethanol,12.5mmedta,0.02%bromophenolblue）,100℃，3分钟

3.加10ul处理后蛋白液样本到10%sds-page凝胶的孔中，进行电泳

4.完成电泳后，获取sds-page凝胶，进行银染色，步骤如下：

a.加100ml50%methanol到sds-page凝胶的容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，

去除methanol液体

b.加100ml5%methanol到sds-page凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除methanol液体,用水洗涤sds-page凝胶1次

c.加10uldtt到sds-page胶容器中,有200ml水，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除dtt液体,用水洗涤sds-page凝胶1次

d.加100ml0.1%agno3到sds-page凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除agno3液体,用水洗涤sds-page凝胶2次

e.加100ml3%na2co3&0.05%formaldehyde到sds-page凝胶容器中，室温下反应，看到清晰蛋白条带为止

f.加criticacid到sds-page凝胶容器中,终止反应

g.用水清洗sds-page胶后，干躁sds-page凝胶,判断flag-mxa纯度

flag-mxa纯度达98%以上。

测定纯化flag-mxa

1.冻存flag-mxa蛋白液放到37℃水浴中，快速溶化，放到冰块中，用pbs1:20稀释蛋白液

2.20ul稀释bsa蛋白液（5ug/ml）和20ul稀释flag-mxa蛋白液，分别加8ul4x蛋白加样液,100℃，3分钟

3.10ul处理后蛋白液样本加到10%sds-page凝胶的孔中，进行电泳，100v，2小时

4.完成电泳后，获取sds-page凝胶

5.转移sds-page凝胶上蛋白到硝基纤维素膜上用蛋白转移缓冲液，30v，3小时

6.用5%脱脂牛奶粉在tbsbuffer(20mmtris,ph7.5,150mmnacl,0.05%tween-20),封闭硝基纤维素膜，室温，2小时，用tbsbuffer洗涤硝基纤维素膜一次，

7.加1：3000稀释羊抗mxa多克隆抗体（r&dsystems）在1%脱脂牛奶粉-tbsbuffer到硝基纤维素膜容器中，在6℃条件下，缓慢摇动，过夜

8.吸出抗体液，用tbsbuffer洗涤硝基纤维素膜4次，每次10分钟

9.加1：4000稀释抗羊igg抗体-hrp（promega）在1%脱脂牛奶粉-tbsbuffer到硝基纤维素膜容器中，室温下，缓慢摇动，1.5小时

10.吸出抗体液，用tbsbuffer洗涤硝基纤维素膜4次，每次10分钟

11.加eclwesternblotting底物（pierce）液到硝基纤维素膜上，反应2分钟

12.用imagereaderlas-4000(fujifilm)测定westernblot结果。

c．bradford法测定flag-mxa浓度

1．取2ml浓缩染料试剂（bio-radproteinassaydyereagentconcentrate）与6mlh2o混合均匀

2.用pbs稀释bsa标准液,浓度分别为0，25，50，100，200ug/ml

3.加80ulpbs到微量滴定板孔中，加5ul不同浓度bsa标准液，5ul纯化flag-mxa到微量滴定板孔中，每个样本加3个孔

4.加80ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中，反应5分钟

5.放微量滴定板到victor3v1420multilabelcounter，选用波长495nm,测定od值

6.根据bsa浓度标准曲线，计算出flag-mxa浓度为98ug/ml

。

二．制备测定mxa时间分辨免疫层析试纸条

（一）mxa侧向免疫层析试纸条组成

本发明实施例中，测定mxa侧向免疫层析试纸条（图1）包括底板（1）以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于底板上样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）、吸水纸（7）;其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔的由mxa单克隆抗体涂层形成的检测线（5）和由兔抗羊igg抗体涂层形成的质控线（6），检测线位于结合垫一侧，质控线靠近吸水纸一侧;结合垫喷涂羊抗mxa抗体-铕螯合物荧光微球；样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）、吸水纸（7）之间，依次与相邻部位接触且部分重叠。

本发明实施例中，检测线（5）与质控线（6）平行设置，检测线与质控线之间的距离为5mm（图1）。

吸水纸（7）位于硝酸纤维素膜（4）靠近质控线（6）一端，且吸水纸一端与硝酸纤维素膜有部分重叠，其重叠部分长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方（图1）。

结合垫（3）位于硝酸纤维素膜（4）靠近检测线（5）一端；且结合垫一端与硝酸纤维素膜部分重叠，其重叠部分长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方（图1）。

样品垫（2）位于结合垫（3）的外侧，并与结合垫部分重叠，其重叠部分长度为5mm;样品垫重叠在结合垫上方。

本发明实施例中，所有测定mxa时间分辨免疫层析试纸条宽度为4mm。

将上述结构试纸条装入塑料外壳里，外壳包括底座和卡盖（10），看图2，卡盖上设置有加样窗口（8）检测窗口（9），露出试纸条局部区域；加样窗口开口于样品垫（2）上部，露出部分样品垫区域；观察窗口开口于硝酸纤维素膜（4）上部，以露出全部检测线（5）和质控线（6）。

本发明选用玻璃纤维样品垫（emdmillipore），侵泡在样品垫处理液（0.1%np-40，0.1%nan3,20磷酸盐缓冲液ph7.4)，室温下，1小时，再37°c，烘干4小时，干燥封闭保持。

本发明选用聚酯膜结合垫组（emdmillipore），侵泡在结合垫处理液（0.1%np-40，0.1%nan3,20磷酸盐缓冲液ph7.4)，室温下，1小时，再37°c，烘干4小时，干燥封闭保持。

（二）mxa抗体化学偶联到铕螯合物(europiumchelate)荧光标记羧基修饰微粒上

本发明实施例中，选用铕螯合物(europiumchelate)荧光标记羧基修饰微粒（carboxylatedfluorescentmicrospheres），购于oceannanotech,可选用铕螯合物(europiumchelate)荧光标记羧基修饰微粒直径为100-500nm。

本发明实施例中，选用羊抗mxa多克隆抗体（r&dsystems）,用innovabiosciences公司抗体浓缩和净化离心柱（abselect™antibodyconcentrationandclean-upkit）预处理羊抗mxa多克隆抗体,步骤如下：

1.加500ul羊抗mxa多克隆抗体到抗体浓缩和净化离心柱中，

2.离心，15000g1-3分钟,减少mxa抗体液到100ul

3.去除收集管中液体,加400ul50mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)到抗体浓缩和净化离心柱中

4.离心，15000g1-3分钟,减少离心柱中液体积到100ul

5.重复3-4步骤，5次以上

6.吸出抗体浓缩和净化离心柱中约100ulmxa抗体

测定mxa抗体浓度，50mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)稀释mxa抗体浓度到1.0mg/ml。

本发明实施例中，用碳二亚胺（edc）和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)化学试剂，购于thermoscientific，把羊抗mxa抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒（直径300nm）上,步骤如下：

1.取0.4ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒(10mg/ml),直径300nmm，加入1.5ml离心管中，再加入1.0ml50mmolmes缓冲液(ph6.0)到离心管中

2.离心，10000rpm，6分钟，去除上清液

3.加入1.0ml50mmolmes缓冲液(ph6.0)到离心管中

4.离心，10000rpm，6分钟，去除上清液

5.新鲜制备50mmolmes缓冲液(ph6.0)含有10mmol碳二亚胺(edc)和20mmoln-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)，立即加0.4ml上述液体到离心管中,混均,

25°c，反应30分钟

6.离心，10000rpm，6分钟，去除反应液

7.加入1.0ml50mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)到离心管中

8.离心，10000rpm，6分钟，去除上清液，重复7-8步骤1次

9.加入0.4ml净化理过羊抗mxa抗体（0.25mg/ml）加入到上述离心管中,

25°c，反应2小时

10.加入0.1ml0.2mtrisph7.5,25°c，反应30分钟

11.离心，10000rpm，6分钟，去除上清液，

12.加入1.2ml0.2%bsa，0.1%tween20,50mmol磷酸盐缓冲液(ph7.5)到离心管中

13.离心，10000rpm，6分钟，去除上清液，重复12-13步骤3次

14.加入0.4ml抗体稀释液（0.2%bsa，10%sucrose,0.02%tween-20,0.01%nan3，50mmol磷酸盐缓冲液ph8.0)到离心管中,4°c储存备用。

（三）．喷涂mxa抗体到结合垫和硝酸纤维素膜上

1.将上述制备完成mxa抗体-铕螯合物荧光微粒液体，用喷膜仪(biodotxyz3050)以10ul/cm速度,喷涂在聚酯膜结合垫上，37°c，烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

2.用抗体浓缩和净化离心柱预处理mxa单克隆抗体及兔抗羊igg抗体后，用包被液（5%surcose,,0.01%tween-20，0.01%nan3,10mmol磷酸盐缓冲液ph8.0)把mxa单克隆抗体浓度调到2.0mg/ml,兔抗羊igg抗体浓度调到0.2mg/ml,喷膜仪(biodotxyz3050)，l.0ul/cm速度，将两抗体以5mm间隔喷涂于硝酸纤维素膜上，37°c，烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

（四）．组装检测mxa侧向免疫层析试纸条

组装操作在湿度小于30%，稳定25-30°c的房间进行，在层合机（biodotlm5000）上，底板中间先铺放硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜质控线相临近一侧铺放吸水纸，使吸水纸与硝酸纤维素膜部分重叠（2mm），吸水纸在硝酸纤维素膜上方；然后在硝酸纤维素膜检测线相临近一端铺放结合垫，使硝酸纤维素膜与结合垫一端部分重叠（2mm），结合垫在硝酸纤维素膜上方;随后，结合垫另一端铺设样品垫，使结合垫与样品垫一端部分重叠（5mm），样品垫在结合垫上方；最后用切割机,切割成宽度为4mm试纸条。

将上述宽度4mm试纸条装入外壳内，形成试纸卡。其中外壳包括底座和卡盖。看图2，卡盖上设置有加样窗（8）和观察窗口（9），露出试纸条局部区域；加样窗口开口在述样品垫上部，露出部分样品垫区域；检测窗口开口在硝酸纤维素膜上部，露出全部检测线和质控线，用于测定检测线和质控线发出荧光信号。

（五）．测定mxa时间分辨免疫层析试纸条操作过程

用时间分辨免疫层析试纸条测定mxa时，在样品垫窗口上加入样品液，在毛细现象作用下，样品液向吸水纸方向泳动，当样品液中含有mxa移动到结合垫时，mxa蛋白与mxa抗体-铕螯合物微粒结合，形成mxa-mxa抗体-铕螯合物微粒复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达硝酸纤维素膜检测线处，此处mxa抗体进一步结合，形成mxa抗体-mxa-mxa抗体-铕螯合物微粒夹心复合物，聚集在检测线上；而未结合mxa的mxa抗体-铕螯合物微粒继续前移，到达质控线时，此处兔抗羊igg抗体与mxa抗体-铕螯合物微粒结合，在质控线处出现兔抗羊igg抗体-mxa抗体-铕螯合物微粒复合物聚集。检测线和质控线都会产生相应的荧光信号，使用trfia分析仪,激发波长350-430nm,检测波长600-650nm，在延时100-400μs后，再测定试纸条的检测线及质控线上铕螯合物发出荧光强度，并计算出样品中mxa含量。整个反应在10-15分钟内完成。

（六）．建立时间分辨免疫层析试纸条定量检测mxa程序

1.建立mxa浓度标准曲线

用pbs稀释纯化flag-mxa，制成不同浓度mxa校准品(0,50，100,200,500,1000,2000ng/ml),加5ulmxa校准品到样品窗口部位，再加150ul低渗液到样品窗口部位，进行膜层析反应，15分钟后，

使用trfia分析仪,选定激发波长420nm,检测波长615nm，在延时200μs后，测定试纸条的检测线及质控线上荧光强度。

以flag-mxa校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度单位为横坐标，建立mxa校准品浓度标准曲线，得到方程式，y=26x-302.47，r²=0.8537，看图4，通过此标准曲线得到mxa浓度标准卡，作为对样品中所含mxa浓度进行定量分析的基础。输入上述参数到trfia分析仪，建立自动运行系统，trfia分析仪通过相应的分析软件自动计算出待测样品中的mxa浓度。

。

2.时间分辨免疫层析试纸卡检测mxa的灵敏度

用pbs制成低浓度mxa校准品(0，0.2，0.5，1，2，5，10ng/ml)，加5ulmxa校准品到mxa时间分辨免疫层析试纸卡加样窗口部位，再加150ul低渗液到样品窗口部位,进行膜层析反应，15分钟后，使用trfia分析仪，测定试纸卡检测线及质控线的荧光强度。

测定0-10ng/mlmxa校准品荧光强度,1-10ng/ml之间有线性关系，trfia分析仪测定1ng/mlmxa校准品荧光强度（2.64）与0ng/ml校准品荧光强度（0.45）相差5倍以上，确定此试剂盒trfia测定mxa敏感度为1.0ng/ml

。

3.时间分辨免疫层析试纸卡检测血液中mxa的浓度

加5ul血液到mxa时间分辨免疫层析试纸卡加样窗口部位，再加150ul低渗液到样品窗口部位,进行膜层析反应，15分钟后，使用trfia分析仪，测定试纸卡检测线及质控线的荧光强度，用多段线性法得到血液中mxa浓度

。