专利名称：抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说本发明关于一种抗病毒基因MxA萸 光定量试剂盒及检测方法。
背景技术：
ct-干扰素(IFN-oc )是目前国际公认的治疗慢性乙型肝炎的有效药 物之一，慢乙肝患者IFN- cc治疗6-12个月后，ALT复常率为34%至45%， HBeAg消失/抗HBe出现率约为15%至37%， HBV-DNA转阴率(低于 105拷贝/ml)为37%， HBsAg转阴率约为l%-8%。导致慢乙肝患者在干 扰素治疗之后取得持续性应答、部分应答或者无应答的原因是临床医生非 常关心的问题，与干扰素应答密切的因素包括治疗前高ALT的水平、治 疗前低HBV-DNA的载量和肝脏组织学明显的炎症活动。其他与干扰素 应答相关的因素还包括感染后病程短、有急性肝炎过程、女性、无 HCV/fflV/HDV合并感染、HBeAg阳性。另外，成年后感染HBV者其干 扰素的疗效明显高于母嬰传播的HBV患者。众多的研究表明在亚洲流行 的B型患者干扰素疗效优于C型，而A型疗效优于D型，前C区1896 位变异与干扰素疗效密切相关。干扰素治疗早期病毒学应答HBeAg、 HBV-DNA下降以及肝脏内cccDNA的含量、HBcAg含量对预测干扰素疗效具有重要的意义。
MxA表达在慢乙肝中具有重要的临床意义。Leifeld L等发现在暴发 型肝衰竭患者肝脏MxA的表达明显高于慢乙肝患者，Fernandez M等研 究发现IFN-ct刺激后MxA应答在慢乙肝患者中明显低于健康对照，而且 HBV-DNA滴度高的患者MxA的应答更弱。King JK等收集慢乙肝干扰素 治疗有应答者46名和无应答者36名，对干扰素信号传导途径中的22个 单个核苷酸多态性进行分析，发现MxA -88为G/T杂合子在干扰素应答 组中占43%,而无应答组为19%,杂合子率在有应答组高于无应答组。 目前上海基康生物技术有限公司其网站和销售人员提供乙型肝炎干扰素 疗效预测的检测，其理论根据来源于60例丙型肝炎患者300多个干扰素 诱导基因SNP分析的结果，选择主要的5个基因的19个SNP进行基因 分型，并对其方法做出有效的患者进行干扰素治疗，在这部分患者干扰素 的有效率是60%,明显高于临床所观测到的干扰素疗效，但目前为止未 见公开发表或国内外专利。
目前对干扰素疗效的预测判断主要来自于临床医生对患者各方面 临床指标的考虑，如性别、年龄、ALT、 HBV-DNA、 HBeAg等，但是这 些判断缺乏准确性、客观性、不能提高受治疗患者的有效率。上海基康公 司推出的SNP预测干.扰素疗效由于缺乏公开文献，也无法进行客观的评 价。但是利用SNP进行疗效预测普遍存在的问题是人群的复杂性以及其 SNP分布只有三种基因型，而分布频率可能影响其在人群整体中的价值， 如MxA-88G/T SNP与干扰素疗效相关，但是其倾向于有效的T等位基因 在中国人群中的频率只有10%，这样排除了大部分可能有效的患者进行
治疗的可能。
发明内容
本发明的目的在于
(1)提供一种抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒； (2 )提供一种利用抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒检测方法。 本发明的目的是通过以下技术方法来实现的 一种抗病毒基因MxA焚光定量试剂盒，包括:MxA和管家基因GAPDH
扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其緩沖液的一种或多种。
其中，MxA:正向引物-2040F: 5,GTCCAGCTCGGCAACAGACT3，， (见SEQ1 )，反向引物-2157R:5，CATGAAGAACTGGATGATCA AAGG3， (见SEQ2 )，探针-2093T:5，FAM-CCTATCACCAGGAGGCCAGCAAG CG3，TARMA ;(见 SEQ3 ) , GAPDH : 正向引物-81F: 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3，， (见SEQ4 ),反向引物-287R: 5，GAAGATG GTGATGGGATTTC3，， (见SEQ5 )探针-258T: 5，FAM-CAAGCTTCCCGTTC TCAGCC3，TARMA (见SEQ6 );其中抗病 毒基因MxA序列(见SEQ7);
所述的PCR緩冲液中含有IX Buffer, 2mM MgCl2, 200 M M dNTP， 1U Taq酶，正反向引物均500nM，探针为200nM。
一种利用抗病毒基因MxA焚光定量试剂盒检测方法，包括以下步骤 (1)、采集外周血单个核细胞PBMC;
(2) 、干扰素剌激PBMC细胞；
(3) 、构建含MxA和管家基因GAPDH目的基因片段的TA克隆；
(4 )、采用实时荧光PCR检观'J MxAmRNA的诱导表达；
(5 ) 4艮据标准曲线和域值，判断样本的Ct值。
其中步骤(2 )中体外使用10000IU/ml干扰素刺激100万个PBMC:
步骤(4 )中在ABI- RPISM7000进行实时焚光PCR， PCR扩增反应为 58。C2min, 95。Cl5Sec, 59。C45Sec， 40个循环。
本发明所公开抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒及检测方法，其优点表 现在
(1) 利用外周血干扰素刺激后MxA的表达可以反映患者干扰素治疗后 的疗效，因此对于患者和医生选择干扰素治疗具有重要的意义，避免医疗 资源的浪费。
(2) MxA表达的测定采用实时荧光定量PCR，该方法简单、方便、廉价， 在拥有定量PCR仪的基层医院可以开展检测工作，而每个患者只需要2 空反应管进行检测，其成本低，也容易让检验人员接受，此外其数据分析 方便，结果解释直接。
(3) 荧光定量PCR避免了 PCR反应过程中因开盖而引起的污染，结合 Taq - Man探针技术，其准确性和灵敏性较高。
(4) 本发明抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒准确、灵活、快速的检测 抗病毒基因MxA。
图l显示GAPDH与MxA之间PCR体系关系，此图说明根据分子量 的大小，及所测得的0D值，推算出质粒的浓度，将其稀释成不同的拷贝， 以上图GAPDH标准品为例，定量PCR的检测范围为103至10'拷贝/ml,其 相关系数R2为0.998， Slope为-3. 47，接近-3. 2的理想标准。此外同 一反应板上，GAPDH与MxA相同浓度的标准品它们的Ct值非常接近，说 明两种的PCR体系效率相当。在该方法建立后，每次定量PCR反应过程加 入管家基因和目的基因的标准品，选择104至108五个标准品，其Ct值约 14至28， 一方面进4于PCR反应效率和可靠性的评估，另外作为绝对定量 的标准。
图2显示MxA诱导量与干扰素治疗疗效关系，此图说明MxA诱 导量能够基本预测慢乙肝患者干扰素治疗疗效，ROC为0.87，预测有效 的准确性是68%，预测无效的准确性是90%。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。 实施例1
( 一 )慢乙肝患者在接受干扰素治疗前抽取外周静脉血5ml，采用 淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，细胞计数。同时收集 患者临床资料，包括基本信息，肝功能，HBV病毒学检测结果。
(二)每次采集干扰素治疗前患者全血时，同时采集健康志愿者全 血作为平行对照。体外使用10000IU/ml干扰素刺激100万个PBMC混悬
在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，6小时后，离心并将细胞 混匀于0.2ml Trizol中，力口入40ial氯仿，混匀，2國8 °C 10000g/min离心 15分钟，取上清加入异丙醇100 ia 1,混匀室温放置10分钟后，10000g/min 离心10分钟，弃上清，加入0.2ml 75%乙醇，混勻后室温放置3分钟， 8000g/min离心5分钟，弃上清，沉淀为RNA, 20 m 1 DEPC水溶解RNA。 取稀释的RNA,用无RNA酶DNA酶1U 37°C 30分钟，去除残余的DNA, 50 |i 1反应体系合成含5Xbuffer 10 |i 1， lOOOng随机引物，0.5mM dNTP, 68°C 10分钟后置水上，然后加入M-MLV逆转录酶400U， 37°C 120分钟， 72。C10分钟使逆转录酶失活，然后置-2(TC保存。合成的cDNA用50ng/ Ml酵母tRNA稀释2倍进行MxA基因定量。
(三) 构建含MxA和管家基因GAPDH目的基因片段的TA克隆， 方法简述如下，克隆扩增GAPDH和MxA目的基因，切胶纯化PCR产物 与pGEM-T easy栽体使用T4连接酶连接，转染DH5a细菌，蓝白斑筛选 阳性克隆，抽提质粒并通过电泳和测吸光度进行定量，根据质粒片段的分 子量计算质粒的拷贝数，将此质粒稀释到108、 107、 106、 105、 104拷贝/1111 的标准品。
(四) 采用实时焚光PCR检测MxA mRNA的诱导表达，取cDNA 模板lul加入Kl PCR緩冲液中(含IX Buffer, 2mM MgCl2, 200 m M dNTP, lUTaq酶，正反向引物均500nM，探针为200nM)。各引物和探针序列如 下GAPDH:正向引物-81F: 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3', 反 向引物-287R: 5'GAAGATG GTGATGGGATTTC3，，探针-258T: 5，FAM-CAAGCTTCCCGTTC TCAGCC3，TARMA; MxA:正向引物
-2040F: 5'GTCCAGCTCGGCA ACAGACT3，， 反向引物 陽2157R:5,CATGAAGAACTGGATGATCA AAGG3，， 探针 -2093T:5，FAM-CCTATCACCAGGAGGCCAGCAAG CG3TARMA 。 在 ABI- RPISM7000 (美国应用生物系统公司-PRSIM7000 )进行实时焚光 PCR， PCR扩增反应为58。C2min， 95。C15Sec, 59。C45Sec， 40个循环。 (五)PCR定量的标准曲线见图1。每个样本均做三个平行管，PCR 反应结束后，根据标准曲线和域值，判断样本的Ct值。C代表Cycle (中 文名称循环数)，t代表threshold (中文名称域值)，Ct值的判断是根 据每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值越 小，则其达到域值的循环数越少，说明其初始浓度较高。
千扰素疗效的判断指标根据是否出现持续性病毒学应答。干扰素有效 指干扰素治疗l年，随访半年时肝功能正常，HBV-DNA转阴，HBeAg 阳性的患者出现HBeAg血清学转换。比较有效和无效者MxA表达结果， 治疗前MxA预测千扰素是否有效ROC为0.87，预测有效的准确性是680/。， 预测无效的准确性是90%。(结果见图2)
SEQUENCE LISTING
〈110>上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120>抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒及检测方法
<130〉 /
〈160> 6
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210> 1
<211> 20
〈212〉 ■
〈213>人工序列
〈400〉 1
gtccagctcggcaacagact 20
<210> 2
〈211〉 24
〈212> DNA <213〉人工序列
<400> 2
catgaagaactggatgatcaaagg 24
〈210〉 3
〈211> 25
〈212> DNA 〈213>人工序列
<400> 3
cctatcaccaggaggccagcaagcg 25
〈210> 4
<211〉 19
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<400> 4
gaaggtgaaggtcggagtc 19 <210> 5 〈211> 20 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400> 5
gaagatggtgatgggatttc 20 <210> 6 〈211> 20 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400> 6
caagcttcccgttctcagcc 20 <210> 7 <211> 2787 〈212〉 DNA
<213〉 智人(Homo sapiens) 〈400> 7
agagcggagg ccgcactcca gcactgcgca gggaccgcct tggaccgcag ttgccggcca 60 ggaatcccag tgtcacggtg gacacgcctc cctcgcgccc ttgccgccca cctgctcacc 120 cagctcaggg gctttggaat tctgtggcca cactgcgagg agatcggttc tgggtcggag 180 gctacaggaa gactcccact ccctgaaatc tggagtgaag aacgccgcca tccagccacc 240 attccaagga ggtgceiggag aacagctctg tgataccatt taacttgttg acattacttt 300 tatttgaagg aacgtatatt agagcttact ttgcaaagaa ggaagatggt tgtttccgaa 360 gtggacatcg caaaagctga tccagctgct gcatcccacc ctctattact gaatggagat 420 gctactgtgg cccagaaaaa tccaggctcg gtggctgaga acaacctgtg cagccagtat 480 gagg卿agg tgcgcccctg catcgacctc attgactccc tgcgggctct aggtgtggag 540 caggacctgg ccctgccagc catcgccgtc atcggggacc agagctcggg caagagctcc 600
gtgttggagg cactgtcagg agttgccctt cccagaggca gcgggatcgt gaccagatgc 660
ccgctggtgc tga犯ctgaa gaaacttgtg aacgaagata agtggagagg caaggtcagt 720
taccaggact acgagattga gatttcggat gcttcagagg tagaaaagga aattaataaa 780
gcccag犯tg ccatcgccgg ggaaggaatg ggaatcagtc atgagctaat caccctggag 840
atcagctccc gagatgtccc ggatctgact ctaatagacc ttcctggcat aaccagagtg 900
gctgtgggca atcagcctgc tgacattggg tataagatca agacactcat caagaagtac 960
atccagaggc aggagacaat cagcctggtg gtggtcccca gtaatgtgga catcgccacc 匿O
acagaggctc tcagcatggc ccaggaggtg gaccccgagg gagacaggac catcggaatc 1080
ttgacgaagc ctgatctggt ggacaaagga actgaagaca aggttgtgga cgtggtgcgg 1140
aacctcgtgt tccacctgaa gaagggttac atgattgtca agtgccgggg ccagcaggag 1200
atccaggacc agctgagcct gtccgaagcc ctgcagagag agaagatctt ctttgagaac 1260
cacccatatt tcagggatct gctggaggaa ggaaaggcca cggttccctg cctggcagaa 1320
aaacttacca gcgagctcat cacacatatc tgtaaatctc tgcccctgtt agaaaatcaa 1380
atcaaggaga ctcaccagag aataacagag gagctacaaa agtatggtgt cgacataccg 1440
gaagacgaaa atgaaaaaat gttcttcctg atagataaaa ttaatgcctt taatcaggac 1500
atcactgctc tcatgcaagg agaggaaact gtaggggagg aagacattcg gctgtttacc 1560
agactccgac acgagttcca caaatggagt acaataattg aaaacaattt tcaagaaggc 1620
cataaaattt tgagtagaaa aatccagaaa tttga犯atc agtatcgtgg tagagagctg 1680
ccaggctttg tgaattacag gacatttgag acaatcgtga aacagcaaat caaggcactg 1740
gaagagccgg ctgtggatat gctacacacc gtgacggata tggtccggct tgctttcaca 1800
gatgtttcga taaaaaattt tgaagagttt tttaacctcc acagaaccgc caagtccaaa 1860
attgaagaca ttagagcaga acaagagaga gaaggtgaga agctgatccg cctccacttc 1920
cagatggaac agattgtcta ctgccagga.c caggtataca ggggtgcatt gcagaaggtc 1980
agagagaagg agctggaaga agaaaagaag aagaaatcct gggattttgg ggctttccag 2040
tccagctcgg caacagactc ttccatggag gagatctttc agcacctgat ggcctatcac 2100
caggaggcca gcaagcgcat ctccagcca.c atccctttga tcatccagtt cttcatgctc 2160
cagacgtacg gccagcagct tcagaaggcc atgctgcagc tcctgcagga caaggacacc 2220
tacagctggc tcctg卿ga gcggagcgac accagcgaca agcggaagtt cctga鄉ag 2280 <sequence>complex sequence see original document page 14</sequence>
权利要求
1、一种抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒，包括MxA和管家基因GAPDH扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种。
2、 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于MxA:正向引物國2040F: 5'GTCCAGCTCGGCAACAGACT3,，反向引物-2157R:5，CATGAAGAACTGGATGATCAAAGG3，，探针-2093T:5，FAM-CCTATCACCAGGAGGCCAGCAAG CG3，TARMA。
3、 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于GAPDH:正向引物國81F: 5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3，，反向引物-287R: 5'GAAGATG GTGATGGGATTTC3，，探针國258T: 5，FAM-CAAGCTTCCCGTTC TCAGCC3，TA画A。
4、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的PCR緩沖液中含 有IX Buffer, 2mM MgCl2, 200 n M dNTP， 1U Taq酶，正反向引物均500nM, 探针为200nM。
5、 一种利用权利要求1所述的抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒检测方法， 包括以下步骤(1) 、采集外周血单个核细胞PBMC;(2) 、干扰素刺激PBMC细胞；(3) 、构建含MxA和管家基因GAPDH目的基因片段的TA克隆；(4) 、采用实时焚光PCR检测MxAmRNA的诱导表达；(5) 、根据标准曲线和域值，判断样本的Ct值。
6、 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)中体外使 用lOOOOIU/ml千扰素刺激100万个PBMC。
7、 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(4)中在ABI-RPISM7000进行实时荧光PCR， PCR扩增反应为58。C2min， 95。C15Sec， 59 。C45Sec, 40个循环。
全文摘要
本发明涉及一种试剂盒，具体地说本发明关于一种抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒及检测方法。该试剂盒，包括MxA和管家基因GAPDH扩增引物，探针，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种。所述的检测方法，包括以下步骤(1)、采集外周血单个核细胞PBMC；(2)、干扰素刺激PBMC细胞；(3)、构建含MxA和管家基因GAPDH目的基因片段的TA克隆；(4)、采用实时荧光PCR检测MxA mRNA的诱导表达；(5)根据标准曲线和域值，判断样本的Ct值。本发明所公开抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒及检测方法，其优点表现在利用外周血干扰素刺激后MxA的表达可以反映患者干扰素治疗后的疗效，因此对于患者和医生选择干扰素治疗具有重要的意义，避免医疗资源的浪费。
文档编号C12Q1/70GK101195844SQ200610119308
公开日2008年6月11日 申请日期2006年12月7日 优先权日2006年12月7日
发明者孔晓飞, 张欣欣 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院