专利名称：：人小rna129荧光定量试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属生物
技术领域：
，为一种通过逆转录(RT)microRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量检测标本中hsa-microRNA-129(hsa-miR-129，人小RNA129)表达量的试剂盒。技术背景microRNA(miRNA)是一类新发现的非编码小RNA分子，长度为22nt左右，来自于基因组DNA的基因间隔区或者断裂的内含子中，自身不编码蛋白，目前在人中发现了587禾中miRNA(microrna.sanger.av.uk/targets/v4)，hsa-miR-129是其中的一个家族。miRNA的发现被美国《科学》杂志评为2002年年度十大科技突破成果，并被排在首位。miRNA基因首先转录产生几百至几千nt的初级产物(pri-miRNA)，在核内被RNaselII内切酶家族Drosha酶切割成70nt左右的发夹状前体(pre-miRNA)。Pre-miRNA在Ran-GTP和转运蛋白Exportin-5的协同作用下转运出核，然后经Dicer酶切割成约22nt的成熟miRNA。成熟的miRNA在RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)引导下与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译。这类非编码的小RNA分子通过调节基因的表达在生物发育、脂肪代谢、细胞的分化、增殖和凋亡等过程中发挥着重要作用。近期一些研究表明miRNA与肿瘤的发生及分化密切相关，在胰腺癌、肺癌、白血病和肝癌等肿瘤中均有报道，提示miRNA与肿瘤的发生有一定的关系。最近研究发现let-7可与肺癌细胞中的癌基因HMGA2(ahigh-mobilitygroupprotein)多靶点mRNA的3'非翻译区(3'UTR)结合，但其在肺癌中的生长抑制作用被HMGA2无3'非翻译区(3'UTR)的开放阅读框过度表达，癌基因HMGA2再次复活，结果是一些肿瘤通过染色体转位消除癌基因3'UTR与Let-7靶点的结合。其他研究发现，Zhang等对227个癌标本，包括109个卵巢癌(93个原发肿瘤，16个癌细胞株)，73个乳腺癌(55个原发癌，18例细胞株)45个原发黑色素瘤原代细胞培养株，用高分辨aCHG检测已知miRAN位于的基因区不正常的DNA拷贝数，癌组织和细胞株分别用Cy3、Cy5作标记，对照癌组织与细胞株荧光比值，DNA小于0.8为DNA丢失，大于1.2为增殖，针对每个miRNA基因所观测到的DNA拷贝数大于159i的肿瘤中有显著的更迭，37.1%(105/283)卵巢癌的miRNA基因位于DNA数不正常的基因区，乳腺癌为72.8%(206/283)，黑色素瘤为85.9%(243/283),并发现hsa-miR-129在乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤中呈高表达。我们将经病理证实的7例膀胱移行细胞癌肿瘤组织标本及癌远端正常对照组织，采用miRNA芯片检测472条miRNA，发现7例肿瘤组^i与正常组织存在大量差异miRNA，其中表达上调61条，表达下调68条，其中在5例以上患者表达均有差异的14条，Hsa-miR-129是上调表达的miRNA之一。人小薩129(hsa-miR-129)的序列为5-cu画ugcgg腦gggcuugc-25，仅有21nt，无法利用传统的RT-PCR方法进行检测，目前检测hsa-miR-129表达方法主要依靠克隆、northernblotting和引物延伸法等方法，但上述方法不仅操作复杂，技术要求高，而且价格昂贵，费时费力，且不能进行定量。虽然芯片方法能够高通量检观lJmicroRNA(miRNA)表达谱，但其灵敏度及特异性限制了该方法对hsa-miR-129的定量检测；一些研究采用随机引物进行RT-PCR检测前体miRNA，但并不适用于成熟的hsa-miR-129检测。实时荧光定量PCR是定量检测基因表达的金标准。但由于hsa-miR-129长度仅为21nt，因此很难设计普通PCR检测hsa-miR-129。
发明内容本发明的目的是提供人小RNA129(hsa-miR-129)检测试剂盒，由(1)逆转录酶及其反应缓冲液，(2)茎环逆转录引物，(3)TaqDNA聚合酶，(4)荧光定量PCR混合液，(5)荧光定量PCR引物与探针，(6)人工合成的hsa-miR-129标准品及对照品组成，其中逆转录反应液含有逆转录引物129RT-primer、逆转录缓冲液、dNTPs，聚合酶链反应液含有聚合酶链反应缓冲液、MgCl2、dNTPs、检测用上游引物、检测用下游引物、荧光探针，检测用特异茎环逆转录引物序列为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTG-3'检测用上游引物序列为5，-GCCGCCMAAAGCGGACAGG-3，检测用下游引物序列为5，-GTGCAGGGTCCGAGGT-3，荧光探针序列为5,-TGGATACGACGCTTGC-3，。对照品分阴性对照品和阳性对照品，其中阴性对照品为无人hsa-MicroRNA-129的RNA样品，阳性对照品为人hsa-miR-129的试剂盒的RNA样品。本试剂盒保存于-20'C，尽量减少反复冻融。本发明试剂盒的使用方法每次检测均应设立阳性对照品和阴性对照品。以hsa-miR-129为模板，采用特异的茎环逆转录引物(129RT-primer:5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTG-3，)进行逆转录反应，将hsa-miR-129逆转录为cDNA，这样就将hsa-miR-129的cDNA序列延长，因此适用于实时荧光定量PCR检测方法。采用正向引物(miR129Pf:5'-GCCGCCAAAAAGCGGACAGG—3，)，反向引物(miRl29Pr:5，—GTGCAGGGTCCGAGGT-3，)以及MGB荧光探针[miR-129T:6-FAM-TGGATACGACGCTTGC(MGB)]进行荧光PCR反应以实现检测hsa-miR-129。在逆转录酶及其反应缓冲液加入一定量的总RNA及茎环逆转录引物后，反应30分钟后取2ul逆转录产物加入含有DNA聚合酶、荧光定量PCR混合液和荧光定量PCR引物与探针的反应体系中，在荧光PCR仪上进行检测，结果参见图l。本试剂盒适用于ABI7000和LightCycler等系列荧光PCR仪。检测样品的同时检测6个梯度人工合成的hsa-miR-129标准品，绘制标准曲线，根据+示准曲线进行定里。(一)cDNA合成10ul总RNA或人工合成hsa-miR-129模板加入50ng/ul的茎环逆转录引物129RT-primer1.0ul于70。C变性10分钟后立即冰浴；然后加入10mMdNTP1.0ul，5XRTbuffer4.Oul，RNA酶抑制剂l.0ul，二硫苏糖醇l.Oul，SuperscriptII逆转录酶l.Oul，补充dH20至反应体系为20ul;室温10分钟，42°C孵浴45分钟，85'C保温5分钟，4"C孵浴5分钟。(二)荧光聚合酶链反应述逆转录产物5.0ul10XPCRbuffer5.Oul25mMMg2+8.OullOmMdNTPl.Oul上游引物(10umol/ul)1.5ul下游引物(10umol/ul)0.7ulMGB探针(10umol/ul)0.3ulTaq酶(5U/ul)0.5uldH20_28.0ul反应体系50.0ul循环条件94'C变性IO分钟，94。C15秒T40个循环后观察结果。62°Cl分钟了本发明采用特异的茎环逆转录引物使hsa-miR-129的cDNA序列延长，可简便、定量、实用的检测hsa-miR-129，适用于实时荧光定量PCR检测方法。检测hsa-miR-129的灵敏度为1X102拷贝/ul。尽管hsa-raiR-129在肿瘤发生发展中的作用不清楚，但许多证据证明肿瘤病人中hsa-miR-129异常，设计和制作简便、有效、准确的hsa-miR-129表达定量分析方法和试剂盒将成为今后临床标本诊断肿瘤或其他疾病的辅助定量检测措施、也是研究疾病发生机理的重要手段之图l为人工合成hsa-miR-129模板的荧光曲线。图2为人工合成hsa-miR-129模板的标准曲线。图3为一例癌组织及相应正常粘膜组织标本中hsa-miR-129的表达。具体实施方式本发明结合实施例和附图作进一步的说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例一试剂盒标准曲线制备每次检测均应设立阳性对照品和阴性对照品。标准品用无菌去离子水稀释为1X102—1Xl()7拷贝/ul。一、标准品cDNA的合成10ul人工合成hsa-raiR-129模板(1乂102拷贝/"1一lX107拷贝/ul六个梯度)加入50ng/ul的茎环逆转录引物129RT-primerL0ul于70。C变性10分钟后立即冰浴；然后加入lOmMdNTP1.Oul，5XRTbuffer4.Oul，RNA酶抑制剂l.0ul，二硫苏糖醇l.Oul,S叩erScriptII逆转录酶l.Oul，补充dH20至反应体系为20ul;室温10分钟，42-C孵浴45分钟，85X:保温5分钟，4"C孵浴5分钟。二、荧光聚合酶链反应取上述逆转录产物5.0ul按以下体系进行PCR扩增5.0ul10XPCRbuffer,8.Oul25mMMg2+，1.OullOmMdNTP，上游引物(10umol/ul)l.5ul，下游引物(10咖ol/u1)0.7ul，MGB探(1Oumol/ul)0.3ul，Taq酶(5U/ul)0.5ul,dH2028.0ul，反应体系为50ul;循环条件94'C变性10分钟，94°C15秒、62'C1分钟扩增40个循环后观察分析结果。三、结果参见图l，为人工合成hsa-miR129模板(1X102拷贝/微升一1X107拷贝/微升六个梯度)逆转录荧光定量PCR的荧光曲线，其中①1XK)2拷贝/微升，②:1X103拷贝/微升，③1Xl()4拷贝/微升，:1X105拷贝/微升，⑤1X106拷贝/微升，⑥1X107拷贝/微升。参见图2，经过对数转换后的拷贝数与CT值的标准曲线，斜率是-2.945，截距为41.097，相关系数为0.990。计算公式为Y=-2.945X+41.097(Y:CT值，X:拷贝数的对数)；转换为拷贝数的计算公式为C叩ie^l0("，")"'945。实施例二检测膀胱癌及正常组织中hsa-miR-129的表达每次检测均应设立阳性对照品和阴性对照品。标准品用无菌去离子水稀释为1X102—lXl()7拷贝/ul。一、总RNA的提取膀胱癌组织及相应正常膀胱粘膜组织总RNA采用Trizor试剂(Invitrogen，Carlsbad,CA)提取，按以下步骤进行(1)组织加Trizor试剂在冰上研磨后，室温放置5min，使其充分裂解。(2)12000rpm离心5min，弃沉淀。(3)按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀15分钟，室温放置15min。(4)4。C12000g离心15min。(5)吸取上层水相，至另一离心管中。(6)按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。(7)4°C12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。(8)按lml75先乙醇/mlTrizol加入75y。乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。(9)4°C8000g离心5min，尽量弃上清。(10)室温晾干或真空干燥5-10min。(11)用50ulH20溶解RNA样品，55-60°C5-10min。(12)提取的总RNA在紫外分光光度计(UVPC2401,SHIMADZU)根据A260进行定量，将总RNA定量至500ng。二、cDNA合成10ul总RNA模板加入50ng/ul的茎环逆转录引物129RT-primer1.0ul于70。C变性10分钟后立即冰浴；然后加入lOmMdNTP1.0ul，5XRTbuffer4.Oul,RNA酶抑制剂l.0ul,二硫苏糖醇l.Oul,SuperscriptII逆转录酶1.0ul，补充dH20至反应体系为20ul;室温10分钟，42°C孵浴45分钟，85"C保温5分钟，4'C孵浴5分钟。三、荧光聚合酶链反应取上述逆转录产物5.0ul按以下体系进行PCR扩增5.0ul10XPCRbuffer,8.Oul25mMMg2+，1.OullOmMdNTP，上游引物(10umol/ul)1.5ul，下游引物(10umol/u1)0.7ul，MGB探针(10umol/ul)0.3ul，Taq酶(5U/ul)0.5ul，dH2028,0ul，反应体系为50ul;循环条件94'C变性10分钟，94°C15秒、62"C1分钟扩增40个循环后观察分析结果。四、结果参见图3及表1。膀胱癌组织及相应正常膀胱粘膜组织中hsa-miR129的表达，其中①肿瘤组织9.86Xl(f拷贝/微升，②正常组织1.40Xl(f拷贝/微升。表l7例膀胱癌和正常膀胱粘膜标本检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明涉及的序列<110>杭州市第一人民医院<120>人小RNA129荧光定量试剂盒<160〉4<210〉1<211>20<212〉腿<213>人工序列<220>〈223〉根据特异的hsa-miR-129序列设计的PCR检测上游引物序列<400〉1GCCGCCAAAAAGCGGACAGG20<210〉2〈211>16〈212>腿<213〉人工序列〈220>〈223〉根据特异的hsa-miR-129序列设计的PCR检测下游引物序列<400>2GTGCAGGGTCCGAGGT16<210>3<211〉16<212〉DNA<213〉人工序列〈220>〈223〉根据特异的hsa-miR-129序列设计的TaqMan荧光定量检测探针序列<400〉3TGGATACGACGCTTGC16<210〉4〈211>49<212〉■〈213>人工序列〈220〉〈223〉根据特异的hsa-miR-129序列设计的荧光定量检测茎环逆转录引物序列<400〉4GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTG49权利要求1.一种人小RNA129荧光定量试剂盒，含有(1)逆转录酶及其反应缓冲液，(2)茎环逆转录引物，(3)DNA聚合酶，(4)荧光定量PCR混合液，(5)荧光定量PCR引物与探针，(6)人工合成的hsa-miR-129标准品及对照品，其特征是逆转录反应液含有逆转录引物129RT-primer、逆转录缓冲液、dNTPs，聚合酶链反应液含有聚合酶链反应缓冲液、MgCl2、dNTPs、检测用上游引物、检测用下游引物、荧光探针，其中检测用特异茎环逆转录引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTG-3’检测用上游引物序列为5’-GCCGCCAAAAAGCGGACAGG-3’检测用下游引物序列为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’荧光探针序列为5’-TGGATACGACGCTTGC-3’。2.根据权利要求1所述的人小RNA129荧光定量试剂盒，其特征是对照品分阴性对照品和阳性对照品，其中阴性对照品为实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人hsa-miR-129的试剂盒的线虫RNA样品，阳性对照品为实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人hsa-miR-129的试剂盒的RNA样品。全文摘要本发明提供一种人小RNA129检测试剂盒，由逆转录酶及其反应缓冲液，茎环逆转录引物，TaqDNA聚合酶，荧光定量PCR混合液，荧光定量PCR引物与探针，人工合成的hsa-miR-129标准品及对照品组成，其中逆转录反应液含有逆转录引物129RT-primer、逆转录缓冲液、dNTPs，聚合酶链反应液含有聚合酶链反应缓冲液、MgCl<sub>2</sub>、dNTPs、检测用上游引物、检测用下游引物、荧光探针。本发明试剂盒，可简便、定量、实用的检测hsa-miR-129，灵敏度为1×10<sup>2</sup>拷贝/ul，可成为今后临床标本诊断肿瘤或其他疾病的辅助定量检测措施、也是研究疾病发生机理的重要手段之一。文档编号C12Q1/68GK101126705SQ200710069338公开日2008年2月20日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者张红河,刚王申请人:杭州市第一人民医院