专利名称：：一种隐孔菌发酵工艺的质量控制方法一种隐孔菌发酵工艺的质量控制方法(一)
技术领域：
本发明涉及一种隐孔菌发酵工艺的质量控制方法。(二)
背景技术：
：隐孔菌俗名松橄榄、树荷苞、树疙瘩、荷色菌、木鱼菌、香木兰、黑迈子(云南)、一口萆(日本)。属于真菌界、担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hyme廳ycetes)、非褶目[Aphyllophorales，旧系统作多孑L菌目(Polyporales)]、多孑L菌科(Polyporaceae)、瞎、孑L菌属(Cryptoporus)。分布于中国的四川、江苏、浙江、湖北、吉林、云南、海南、福建等省，朝鲜、曰本、欧洲、北美洲也有分布。关于隐孔菌的药用价值早有报道，蓝茂(1397-1476)《滇南本草》记载味苦、甘，性微寒。治大肠下血，积热之毒。疗(内夕卜)九种誇疮，(附方)治牙齿疼，将松橄榄于疼牙上咬住，疼即止。韩国李氏等人(1981)得到的热水提取物中的多糖蛋白具有抗癌活性。江苏省植物研究所等编著(1990)的《新华本草纲目》记载味微苦，性平。有止咳、平喘、解毒等功能。用于治气管炎、哮喘，还可用于小儿断奶(云南丽江民间常用)，徐锦堂等编《中国药用真菌学》(1997)第三十二章隐孔菌全面记载了隐孔菌的国内外的报道、药用价值、形态结构、生活习性、生活史、生活条件、培养技术等。关于隐孔菌的人工栽培未见报道，但华启洪等对隐孔菌的液体发酵培养进行了研究，并申请了中国专利(申请号94117227.9)，而后杭州泰士生物技术有限公司对隐孔菌的液体发酵技术和药用价值进行了进一步研究，发现隐孔菌的液体发酵物对过敏性哮喘和过敏性鼻炎有很好的疗效，并申请了中国专利(申请号G1126498.5)。此后柯传奎等发现隐孔菌多糖是隐孔菌发酵产物的主要活性成分，对过敏性哮喘和成人型呼吸窘迫综合征等有好的效果，申请了专利(申请号200510060463.8)。关于隐孔菌的化学成分也有报道华启洪、金国梁等《中国药学杂志》1993.28(2):P75~76报道了隐孔菌19种挥发油成分研究；华启洪、金国梁等《植物资源与环境》1993.2(1):P60-61报道了隐孔菌糖、氨基酸、微量元素等化学成分研究；马伟光等《云南植物研究》1994.I6(2):PW6-:20()报道了从野生隐孔菌中分离的四个麦角甾醇类化合物；吴锦忠、黄年来《福建中医学院学报》1997.7(2)P21-26报道了隐孔菌发酵培养物和野生隐孔菌中氨基酸、糖类和水提取物、乙醇提取物、石油醚提取物之间的薄层分析结果比较。ShinichiKitamura等在CarbohydrateResearch263(1994)111-121报道从隐孔菌中提取出来一种多糖有抗肿瘤活性。Xiao-yanZHAO等在ActaPharmacolSin2004Apr,25(4):503-507中报道从隐孔菌发酵产物中提取的多糖具有抑制气道高反应性的作用。周建仓等在中国药理学通报2002apr:18(2):1"~1"中报道从隐孔菌发酵产物中提取的多糖有抑制肺组织释放白三烯和抗变态反应作用。目前天然的隐孔菌已经极少，人工隐孔菌发酵过程主要通过常规理化指标测定控制，而多篇文献报道多糖是隐孔菌的主要活性成分，因此对发酵过程及终产品的多糖测定就显的十分必要，本发明就是提供了一个对多糖控制的方法。
发明内容本发明既是为了提供一种隐孔菌发酵工艺的质量控制方法，通过对发酵过程多糖和终产物多糖的单糖组成变化控制产品的质量。为达到发明目的本发明采用的技术方案是量取发酵中间产物200ml,过滤，得到菌丝体和发酵液。将发酵液浓缩至20ml，加无水乙醇80ml，边加边搅拌，放置1小时待沉淀完全后过滤，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖约O.02g，加入2M的H2S042ml,密封，混匀溶解，于125。C烘箱中反应1小时，放至室温，3500r/min离心IO分钟，上清用损的NaOH调溶液pH至7.0。水解液1.Oml,加入1.Oml的NaOH(0.3M)和1.Oml的PMP甲醇溶液(0.5M)于水解管中，混匀，密封，于70。C水浴中反应30min，取出放冷至室温，用HC1调pH至7.0，加入2ml氯仿萃取，振摇，3500rpm/min离心10分钟，反复萃取3次，水层过0.45um膜即可。将过膜后的滤液注入液相色镨仪分析单糖的种类和比例。液相条件为紫外检测器检测波长250nm,SB-C8反相色语柱，流动相磷酸盐緩冲液(pH5.8):乙睛=80:20，流速lml/min。或者称取隐孔菌菌丝体5g，加水編超声提取1小时，3500r/min离心10分钟，上清浓缩至10ml，加无水乙醇40ml，边加边撹拌，放置1小时待沉淀完全后过滤，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖约0.02g，加入2M的三氟乙酸2ml，密封混匀，于于125。C烘箱中反应1小时，放至室温，在氮气流下吹干水解液。加入lml甲醇，混匀后在氮气流下吹干。吹干后的样品加入蒸馏水lml，硼氢化钠粉末25mg，混匀反应2小时。滴入醋酸中止反应至无气泡为止。在氮气流下吹干反应液，加0.1%(V/V)的盐酸-曱醇2ml，混匀，氮气吹干，重复3次。剩余物105。C烘箱加热1小时除去水分。加入0.5ml吡啶和0.5ml醋酸酐，封管后在沸水浴中反应1小时，反应产物进行气相色谱分析单糖组成。所述隐孔菌发酵工艺简单流程为配制培养基—接种—发酵培养-发酵中间产物—发酵结束—菌丝体和发酵外液分离—分别干燥得到隐孔菌菌丝体粉和隐孔菌发酵液粉。或者发酵结束后将发酵产物不进行分离直接干燥得隐孔菌发酵物粉。所述隐孔菌发酵中间产物指的是在隐孔菌发酵过程中所产生的菌丝体和不含菌丝体的发酵外液。在不同的发酵时间取样得到不同发酵时间的隐孔菌发酵中间产物。所述隐孔菌发酵物粉指的是隐孔菌发酵完毕后将发酵产物不进行分离即隐孔菌菌丝体和发酵外液混合干燥得到的产物。所述隐孔菌多糖可由如下方法制备得到将隐孔菌菌丝体粉力口适量水提取，水提液浓缩后加入4倍体积的乙醇沉淀，离心得到沉淀，干燥即为粗多糖。将隐孔菌发酵液适当浓缩后加入4倍体积的乙醇沉淀，离心得到沉淀，干燥即为粗多糖。取隐孔菌发酵液粉加适量水溶解后加5倍体积的乙醇沉淀，离心得到沉淀干燥即为粗多糖。取隐孔菌发酵物粉加适量水溶解后加5倍体积的乙醇沉淀，离心得到沉淀干燥即为粗多糖。上述方法中，所述的测定多糖的单糖组成的方法可以有很多种，比如高效液相法、气相法、薄层色谱法、毛细管电泳法等等。在发酵过程中，测定不同发酵时间发酵液中的隐孔菌多糖，结果表明变化很有规律(见附图)。在0h的时候发酵液多糖主要由培养基贡献，单糖组成主要是葡萄糖，发酵开始以后隐孔菌的生长开始消耗培养基多糖并向发酵液中分泌自身合成的多糖，导致发酵液中的多糖的单糖组成有规律的变化，多糖中甘露糖和半乳糖的百分含量显著增加。当发酵进行到一定时间后，发酵液中的多糖的单糖组成趋向稳定。发酵液中多糖的单糖变化规律给发酵终点判断提供了依据，可以作为发酵工艺主要的控制指标之一。结合发酵工艺的其它指标可以更好的控制发酵过程。本发明所述的控制隐孔菌发酵工艺质量的有益效果主要体现在(1)本发明所述的测定方法可以反应出不同发酵时间隐孔菌发酵液多糖的单糖组成变化，为确定发酵终点提供参考(实施例4表1)。(2)本方法对隐孔菌菌丝体多糖的单糖组成分析可以用来作为产品的鉴别标准(实施例5表2)。(四)附图隐孔菌发酵液多糖的单糖组成随发酵时间变化具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不l又限于此实施例1:隐孔菌菌丝体多糖的单糖组成测定称取隐孔菌菌丝体粉5g,加水40ml超声提取1小时，3500r/min离心10分钟，上清浓缩至10ml，加无水乙醇40ml，边加边搅拌，放置1小时待沉淀完全后过滤，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖约0.02g，加入2M的三氟乙酸2ml,密封混匀，于125。C烘箱中反应1小时，放至室温，在氮气流下吹干水解液。加入lml曱醇，混匀后在氮气流下吹干。吹干后的样品加入蒸馏水lml，硼氢化钠粉末25mg,混匀反应2小时。滴入醋酸中止反应至无气泡为止。在氮气流下吹干反应液，加O.1%(V/V)的盐酸-曱醇2ml，混匀，氮气吹干，重复3次。剩余物105。C烘箱加热1小时除去水分。加入0.5ml吡啶和0.5ml醋酸肝，封管后在沸水浴中反应l小时，反应产物进行气相色谱分析单糖组成。1。/。0V-2"填充柱(2mx0.3cm),进样器和检测器(FID)均为250。C;柱温195°C;H230mL/min;空气200mL/min;载气为高纯N2:10mL/min;进样量0.6iaL。实施例2:隐孔菌菌丝体多糖的单糖组成测定量取发酵中间产物200ml，过滤，得到菌丝体和发酵液。将菌丝体加水200ml,混匀后过滤，滤々并加水100ml煮沸1小时，过滤，滤液浓缩至20ml，加无水乙醇80ml，边加边搅拌，放置1小时待沉淀完全后过滤，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖约0.02g，加入2M的H2S042ml，密封，混匀溶解，于125。C烘箱中反应l小时，放至室温，3500r/min离心IO分钟，上清用4M的NaOH调溶液pH至7.0。水解液1.Oml，加入1.Oml的NaOH(0.3M)和1.Oml的PMP甲醇溶液(0.5M)于水解管中，混匀，密封，于70。C水浴中反应30min，取出放冷至室温，用HC1调pH至7.0，加入2ml氯仿萃取，振摇，3500rpm/min离心10分钟，反复萃取3次，水层过0.45um膜即可。将过膜后的滤液注入液相色镨仪分析单糖的种类和比例。液相条件为紫外检测器检测波长250nm，SB-C8反相色谱柱，流动相磷酸盐緩冲液(pH5.8):乙睛=80:20,流速lml/min。实施例3:隐孔菌发酵液多糖的单糖组成测定量取发酵中间产物200ml,过滤，得到菌丝体和发酵液。将发酵液浓缩至20ml,加无水乙醇80ml，边加边搅拌，放置1小时待沉淀完全后过滤，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖约O.02g,加入2M的H2S042ml，密封，混匀溶解，于125。C烘箱中反应1小时，放至室温，3500r/min离心IO分钟，上清用4M的NaOH调溶液pH至7.0。水解液1.Oml，加入1.Oml的NaOH(0.3M)和1.Oml的PMP曱醇溶液(0.5M)于水解管中，混匀，密封，于7(TC水浴中反应30min，取出放冷至室温，用HC1调pH至7.0，加入2ml氯仿萃取，振摇，3500rpm/min离心10分钟，反复萃取3次，水层过0.45um膜即可。将过膜后的滤液注入液相色谱仪分析单糖的种类和比例。液相条件为紫外检测器检测波长250nm，SB-C8反相色躲，流动相磷酸盐緩冲液(pH5.8):乙睛-80:20，流速lml/min。实施例4:不同发酵时间隐孔菌发酵液多糖的单糖组成测定从发酵开始(Oh)至发酵终点U09h)间隔一定时间分别取样，按照实施例3中的方法分离发酵液并对发酵液中多糖的单糖组成进行测定，结果表明发酵液多糖的单糖组成呈一定规律变化，如下表1和说明书附图表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例5:不同发酵产品中提取的多糖的单糖组成分析分别称取发酵乌灵菌粉、发酵虫草菌粉、隐孔菌菌丝体粉、发酵虫草头孢菌粉、发酵猪苓菌粉和发酵拟青霉菌粉各5g，加水40ml回流提取1小时，3500r/min离心IO分钟，上清浓缩至10ml，加无水乙醇40ml，边加边搅拌，》文置1小时待沉淀完全后过滤，沉淀干燥后即得粗多糖。各粗多糖样品按照实施例2中的方法测定单糖组成，结果表明发酵隐孔菌菌粉多糖的单糖组成与其他几种发酵产品有显著的区别，如下表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1、一种隐孔菌发酵工艺的质量控制方法，其特征在于量取发酵中间产物200ml，过滤，得到菌丝体和发酵液，将发酵液浓缩得到浓缩液20ml，冷却到室温，浓缩液加无水乙醇80ml，边加边搅拌，放置1小时待沉淀完全后过滤，沉淀干燥后即得粗多糖A；称取隐孔菌菌丝体粉、隐孔菌发酵液粉和隐孔菌发酵物粉各5g，分别加水40ml超声提取1小时，3500r/min离心10分钟，上清浓缩得到10ml浓缩液，冷却到室温，加无水乙醇40ml，边加边搅拌，放置1小时待沉淀完全后过滤，沉淀干燥后即得粗多糖B、C和D，取粗多糖A、B、C和D各约0.02g，分别加入2mol/L的H2SO4溶液2ml，密封，混匀溶解，于125℃反应1小时，放至室温，3500r/min离心10分钟，上清用4mol/L的NaOH水溶液调pH至7.0，量取此水解液1.0ml于水解管中，加入0.3mol/LNaOH水溶液和0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液各1.0ml，混匀，密封，于70℃水浴中反应30min，取出放冷至室温，用盐酸调pH至7.0，加入2ml氯仿萃取，反复3次，水层用0.45um膜滤过，将过膜后的滤液注入液相色谱仪分析，对比标准品色谱图判断单糖的种类和比例；液相条件为紫外检测器检测波长250nm，SB-C8反相色谱柱，流动相为pH5.8的磷酸盐缓冲液和乙睛以体积比80∶20组成，流速1ml/min；多糖A的单糖组成可以作为发酵控制指标；多糖B、多糖C和多糖D的单糖组成可以分别作为隐孔菌菌丝体粉、隐孔菌发酵液粉和隐孔菌发酵物粉的质量控制指标。2、如权利要求1所述的一种隐孔菌发酵工艺的质量控制方法，其特征在于隐孔菌菌丝体粉和隐孔菌发酵液粉加水提取可采用超声提取，也可以采用回流提取、索氏提取和浸渍提取等方法。3、如权利要求1所述的一种隐孔菌发酵工艺的质量控制方法，其特征在于粗多糖的水解可以选择有机酸如三氟乙酸，三氯乙酸等，也可以选择无机酸如硫酸，盐酸等，也可以选择酶试剂如混合非淀4分多糖水解酶，复合酶及其它酶类。4、如权利要求1所述的一种隐孔菌发酵工艺的质量控制方法，其特征在于测定粗多糖的单糖组成的方法可以采用高效液相法也可以采用气相色谱法、薄层色语法、毛细管电泳法等方法。5、如权利要求1所述的一种隐孔菌发酵工艺的质量控制方法，其特征在于隐孔菌菌丝体粉、隐孔菌发酵液粉和隐孔菌发酵物粉可以用自身的多糖的单糖组成作为质量控制指标，隐孔菌发酵过程可以用隐孔菌发酵液中的多糖的单糖组成作为指标。6、如权利要求1所述的隐孔菌发酵液中多糖的单糖组成作为发酵质控指标在发酵过程中的应用。7、如权利要求l所述的隐孔菌菌丝体粉、隐孔菌发酵液粉和隐孔菌发酵物粉多糖的单糖组成在隐孔菌菌丝体粉、隐孔菌发酵液粉和隐孔菌发酵物粉鉴别和质量控制中的应用。全文摘要本发明提出了一种质量控制方法，可以用于隐孔菌发酵过程及发酵终产品质量控制。方法的主要特征是取隐孔菌发酵液或者发酵终产物隐孔菌菌丝体粉、隐孔菌发酵液粉，隐孔菌发酵物粉中的一种，加水适量提取，分离得到提取液，加乙醇至80％，分离得到粗多糖。分析粗多糖的单糖种类和比例，以此判断发酵的终点和鉴别终产品的质量。本方法的专一性强，能较好的体现出隐孔菌发酵过程中糖类物质组成的变化，终产品中多糖的单糖组成和同类其他发酵产品相比有比较显著的区别，为隐孔菌发酵产物的质量控制提供了方法和依据。文档编号C12N1/14GK101109007SQ20071006919公开日2008年1月23日申请日期2007年6月12日优先权日2007年6月12日发明者萍张,李艳伟,杨勇杰,柯传奎,柴黎燕,欧阳小军申请人:柯传奎;杨勇杰