专利名称：一种嗜酸乳杆菌的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种嗜酸乳杆菌的制备方法，属于微生物发酵工程技术领域。
背景技术：
微生态制剂是指将已知的有益微生物通过现代生物工程技术制备成应用于动物的生物制剂，它能有效补充畜禽体内的有益微生物，改善动物体内菌群平衡，提高机体抗病力和饲料吸收利用能力。由于微生态制剂无残留、不产生抗性，且具有预防疾病和促进动物生长的作用，可有效克服长期使用抗生素造成的一些不良影响，被认为是饲用抗生素潜在的、天然的、对环境和健康无害的替代物。九十年代以来，微生态制剂在畜禽养殖方面的应用发展很快，1989年全球饲用微生态制剂总销售额为7500万美元，1993年为1.22亿美元，2000年为1.86亿美元，2007年估计可达3.5亿美元。
微生态制剂按微生物种类可分为芽孢杆菌制剂、乳酸杆菌制剂及酵母制剂等。嗜酸乳杆菌是动物肠道内的重要益生菌，也是可以在肠道中成活和定殖的少数乳酸杆菌之一。嗜酸乳杆菌具有较强的耐酸和耐胆汁盐能力，不用经特殊处理就能顺利通过胃肠环境而有效定殖于动物肠道内形成优势种群；而且其产生的乳酸和乳酸菌素可直接作用于病原细菌，这是其它微生物活菌制剂无法比拟的。但制备嗜酸乳杆菌比较困难，未见良好的生产方法。嗜酸乳杆菌的培养比较困难，营养要求高，生长条件苛刻。其发酵培养基一般要求以牛奶为基质，再添加一些葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等营养成分；或由高浓度的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，再加上其他一些营养成分组成，然后在厌氧或微氧状态下培养。这种方法不但难于规模化，而且成本极高，产品无法在饲料中应用。因而嗜酸乳杆菌作为微生态制剂的研制开发，具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的是要提供一种新的嗜酸乳杆菌制备方法，该方法可大大降低生产成本，制备的嗜酸乳杆菌产品可望在畜禽养殖业中得到规模化应用。
为实现上述目的采取的技术方案 采用液体深层发酵培养技术，通过二步发酵生产嗜酸乳杆菌。一步发酵接种粘红酵母，通过发酵形成嗜酸乳杆菌培养的基本营养条件；二步发酵接种嗜酸乳杆菌，通过增殖培养形成嗜酸乳杆菌产品。
本发明的具体制备工艺如下 1.菌株鉴定 (1)粘红酵母ZHRh028 细胞卵形到球形，2.3-5.0×4.0-7.8微米，单个或几个细胞连结成串，多端出芽。在麦芽汁琼脂斜面上菌苔呈现珊瑚红到橙红色，菌落表面光滑、有光泽、粘稠有时发硬，其横切面扁平到有较宽的凸起，边缘不规则到整齐，不形成菌丝，无假菌丝。不发酵任何糖，同化硝酸钾，分解杨梅苷，不产生类淀粉。可同化葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、L-山梨糖、乙醇、D-果糖、松三糖、甘油等，不能同化乳糖、蜜二糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-木糖、菊糖、棉子糖、肌醇、可溶性淀粉、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-山梨醇和赤癣醇。无有性生殖现象，生长温度25-36℃，pH2.5-10.0范围均能生长。
(2)嗜酸乳杆菌 杆菌，两端圆，0.6-0.9×1.5-6微米，以单个、成双或短链出现。不运动，无鞭毛，菌落粗糙。在显微镜下观察，显示缠绕或微毛丝状物，从似暗影的菌堆的中心放射伸出。无特有的色素。可同化苦杏仁苷、纤维二糖、七叶苷、果糖、葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、海藻糖，不能同化阿拉伯糖、葡萄糖酸盐、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨醇、木糖。同型发酵，产生DL-乳酸。从精氨酸不产氨。15℃下不生长，45℃下生长，最适生长温度35-38℃，生长初始pH值为5-7，最适pH5.5-6.0。
2.制备工艺 (1)生产菌种 本发明所用的微生物菌种为粘红酵母ZHRh028(Rhodotorula，glutinis ZHRh028)，保藏于CGMCC，保藏号CGMCC NO.1745，保藏日期为2006年06月27日；嗜酸乳杆菌ZJLa055(Lactobacillus acidlophilus ZJLa055)，保藏于CGMCC，保藏号CGMCC NO.2008，保藏日期为2007年04月13日。
(2)培养基 ①种子斜面培养基 粘红酵母葡萄糖2％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.2％、琼脂2.0％。
嗜酸乳杆菌蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、葡萄糖2.0％、K2HPO4 0.2％、柠檬酸二铵0.2％、乙酸钠0.5％、吐温80 0.1％、MgSO4·7H2O 0.058％、MnSO4·4H2O 0.025％、琼脂2.0％，pH6.0。
②发酵培养基 培养基中的营养源采用常用的碳源和氮源。其中碳源可为玉米粉、淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、饴糖等；氮源可为玉米浆、尿素、硫酸铵、蛋白胨、黄豆饼粉、酵母膏等。在此基础上再添加一些其它营养成份，如食盐、磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐等。
(3)培养方法 本发明所述的嗜酸乳杆菌制备方法，采用液体深层发酵技术，通过分步接种粘红酵母和嗜酸乳杆菌进行二步发酵培养。首先接种粘红酵母，培养温度28-33℃，培养4-30小时后将温度提高到40-60℃，保温1-18小时，使粘红酵母自溶形成嗜酸乳杆菌培养的基本营养条件；然后将温度降至34-39℃，接种嗜酸乳杆菌，增殖培养15-100小时后放罐。
(4)产品后处理 培养液调制成一定的含菌量，干燥粉碎后分装，即为产品。
具体工艺流程见说明书附图。
本发明的显著优点 嗜酸乳杆菌的培养比较困难，营养要求高和生长条件苛刻。其发酵培养基一般要求以牛奶为基质，再添加一些葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏等营养成分；或由高浓度的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，再加上其他一些营养成分组成。原材料的高成本，决定现有制备嗜酸乳杆菌产品的成本很高。而本发明提供的嗜酸乳杆菌制备方法，通过发酵粘红酵母来形成嗜酸乳杆菌培养的基本营养条件；而粘红酵母营养要求很低，其发酵培养的培养基成分均为一些常见的、低价的农副产品。因此，采用本方法制备嗜酸乳杆菌，可大大降低生产成本。能极大地推动嗜酸乳杆菌作为微生态制剂的开发利用。
附图为本发明制备工艺流程图。
具体实施例方式 本发明有以下实施例 实施例一活菌总数大于50亿/ml粉剂产品的制备 在70L发酵罐中，按葡萄糖3％、硫酸铵0.8％、蛋白胨0.1％、磷酸氢二钾0.02％、碳酸钙0.02％配成50L培养液。按常规方法灭菌后冷却至28℃，接种1个茄子瓶的粘红酵母生产菌种，培养温度为28℃，转速250转/分；培养23小时后将温度提高到50℃保温15小时，使粘红酵母自溶；然后将温度降至36℃，接种1个茄子瓶嗜酸乳杆菌生产菌种，增殖培养75小时后放罐。喷雾干燥后加番薯淀粉调剂到总活菌数大于50亿/ml，分装即得产品。
实施例二总活菌数大于10亿/克粉剂产品的制备 在70L发酵罐中，按红糖2.0％、葡萄糖1％、西红柿汁6％、玉米浆0.5％、尿素0.3％、磷酸氢二钾0.02％、氯化钠0.2％配成45L培养液。按常规方法灭菌后冷却至30℃，接种2个茄子瓶的粘红酵母生产菌种，培养温度为30℃，转速220转/分；培养10小时后将温度提高到60℃保温10小时，使粘红酵母自溶；然后将温度降至38℃，接种2个茄子瓶嗜酸乳杆菌生产菌种，增殖培养30小时后放罐。加适量玉米芯粉吸附并调制到总活菌数大于10亿/克，沸腾干燥后分装即为产品。
权利要求
1、一种嗜酸乳杆菌的制备方法，采用液体深层发酵培养技术，其特征是通过二步发酵方法生产，一步发酵接种粘红酵母Rhodotorula glutinis，通过发酵形成嗜酸乳杆菌培养的基本营养条件；二步发酵接种嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidlophilus，通过增殖培养形成嗜酸乳杆菌产品。其制备工艺的特征如下
2、按权利要求1所述嗜酸乳杆菌的制备方法，其制备工艺的特征如下
(1)生产菌种
采用粘红酵母Rhodotorula glutinis ZHRh028和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidlophilusZJLa055，菌种保藏于CGMCC，保藏号分别为CGMCC NO.1745和CGMCC NO.2008；
(2)发酵培养基
培养基中的营养源采用碳源和氮源，其中碳源为玉米粉、淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖或饴糖；氮源为玉米浆、尿素、硫酸铵、蛋白胨、黄豆饼粉或酵母膏，并添加食盐、磷酸盐、钾盐、钙盐或镁盐；
(3)培养方法
采用液体深层发酵技术，通过分步接种粘红酵母和嗜酸乳杆菌进行二步发酵培养，首先接种粘红酵母，培养温度为28-33℃，培养4-30小时后将温度提高到40-60℃，保温1-18小时，使粘红酵母自溶形成嗜酸乳杆菌培养的基本营养条件；然后将温度降至34-39℃，接种嗜酸乳杆菌，增殖培养15-100小时后放罐；
(4)产品后处理
培养液调制后，干燥粉碎即为产品。
全文摘要
本发明涉及一种嗜酸乳杆菌的制备方法，采用液体深层发酵技术，通过分步接种粘红酵母和嗜酸乳杆菌进行二步发酵培养生产。首先接种粘红酵母，培养温度为28-33℃，培养4-30小时后将温度提高到40-60℃保温1-18小时，使粘红酵母自溶形成嗜酸乳杆菌培养的基本营养条件；然后将温度降至34-39℃，接种嗜酸乳杆菌，增殖培养15-100小时后放罐，调制后形成嗜酸乳杆菌产品。本方法能显著降低嗜酸乳杆菌的生产成本。
文档编号C12R1/23GK101096648SQ200710069019
公开日2008年1月2日 申请日期2007年5月31日 优先权日2007年5月31日
发明者竺利红, 施跃峰, 吴吉安, 梁建根, 桑金隆 申请人:浙江省农业科学院