一种全长cDNA均一化消减杂交方法

专利名称：一种全长cDNA均一化消减杂交方法
技术领域：
本发明涉及一种全长cDNA均一化消减杂交(fiill-length normalization subtmctive hybridization, FNSH)方法，应用于富集、筛选、克隆和鉴定差 异性表达的基因。(二) 背景技术生物体各种组织或细胞、以及同一种组织或细胞在不同发育时期等所表 达的基因在种类及数量上不尽相同，这些表达量或表达时期不同的基因称为 差异表达的基因(differentially expressed gene )。差异表达的基因在生物的发 育、分化、癌变等过程中起着重要的作用，因此克隆和鉴定这些差异表达的 基因能够有力地推动我们研究和揭示这些生命过程的机理。目前筛选差异表 达基因的方法主要有差异显示(differential display, DD)，代表性差异分 牙斤(representational difference analysis, RDA), 基因表达系歹ll分冲斤(serial analysis of gene expression, SAGE )和才卬制'l"生消;咸杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)。上述方法有一个共同的缺点即所得到的是cDNA的部分片段；要获得 全长cDNA序列还需要利用快速扩增cDNA末端(mpid amplification of cDNA ends, RACE)或者从cDNA文库筛选，但是在基因具有选择性的启动子、剪 切和多聚腺苷酸化信号序列时，以及当基因属于多基因家族时，用RACE获 得一个正确的全长cDNA序列将十分困难，而构建cDNA文库以及筛选本身 又都是耗时费力的事。此外，上述方法还分别具有一些其他的缺点DD—次最多只能获得少数几个基因的cDNA部分序列，不能运用于高通量筛选，而且假阳性率较高； RDA不能有效地将非目的分子消减掉，假阳性率也较高，而且更利于表达 量高的基因的富集，容易丟失低表达量的基因的信息；SAGE需要大量地测 序，分析大量的序列信息，费用较高；SSH虽然高效而且能均一化表达量不 同的cDNA的含量，但也有一定的假阳性，并且抑制性PCR的强弱受多种 因素控制，对结果影响很大，另外SSH中双链的driver使消减杂交效率无法 进一步地提高。因此，我们需要一种直接富集差异性表达的基因的方法，这种方法不但 能够均一化丰度不同的差异性基因，而且可以得到全长cDNA。
发明内容本发明既是为了提供一种能够均一化丰度不同的差异性基因、得到全长 cDNA的直接富集差异性表达的基因的方法。 为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤 (1)第一链cDNA的合成选取含有差异表达基因的两组样品特有的 或差异表达基因表达较高的样品为tester,没有或差异表达基因表 达较低的样品为driver (目的是筛选和克隆那些在tester里面有表 达或表达量较高而在driver里无表达或表达量较低的基因，筛选到 的这些基因将为研究两组样品之间产生区别的分子机制提供基础， FNSH原理及流程参见图1)，抽提样品的总RNA (不需要抽提 mRNA)，利用模板转换技术(template-switching)进行逆转录，分 别合成tester和driver的第一链cDNA (first-strand cDNA),使第一 链cDNA的两端分别带有一段已知的序列(见图1中白色和灰色长 方才匡)，分别命名为tester 1和driver 1;(2 )又又链cDNA的合成4夺testerl分为两纟且testerl-l 、 testerl-2, testerl-l 利用引物3，AP和5'磷酸化引物PH5，CP，通过PCR扩增合成双链 cDNA,得到有义链上5，末端磷酸化的双链cDNA: tester2画l; testerl-2利用引物5'CP和3'磷酸化引物PH 3'AP，通过PCR扩增 合成双链cDNA,得到反义链上5'末端磷酸化的双链cDNA: tester 2-2; driverl利用引物5'BK和3，BK或者引物5'CP和3，AP,通过 PCR扩增合成双链cDNA: driver2,所述引物5'CP和PH5，CP的 序列一致且都与步骤(1)中的TSCAP相对应，3'AP和PH3，AP 的序列一致且都与步骤(1)中的TSPA相对应，5'BK的3'末端含 有与5'CP相同的序列，能够分别和第一链cDNA的两端相配对引 物3'BK的3'末端含有与3'AP相同的序列，5'BK和3'BK的5，端 序列比第一链cDNA的两端突出，可为后续PCR扩增差异表达基 因的cDNA时减少背景提供了帮助，引物5'BK和3'BK也可直接 用引物5，CP和3，AP替代，但是最终的消减效率可能会有所下降；(3 )选择性连接和引物延伸将tester2-l和tester2-2分别用非磷酸化的 接头ADP I和ADP II进行连接，得到连接产物tester3-l和 tester3-2; driver2分为两组driver2-l、 driver2-2，所述的driver2-1、 driver2-2分别采用引物5'BK和3'BK,在PCR条件下进行3~5个 循环，分别得到单链cDNA富集的driver3-l和driver3-2;由于 tester2-l和tester2-2分别有相对的一端是磷酸化的，所以与非磷酸 化的接头(adaptor)连接时，tester2-l和tester2-2分别只有一端能 与接头选择性地连接，这里，tester2-l的一端与接头ADPI连接， 而tester2-2的相对另 一端与接头ADP II连接；driver2分为两组driver2-l 、 driver2-2，所述的driver2-l 、 driver2-2分别采用引物5'BK 和3，BK，在PCR条件下进行3~5个循环，分别得到单链cDNA富 集的driver3-l和driver3-2;单链富集的driver能够通过减少消减杂 交过程中driver cDNA自身相互杂交而维持driver的有效浓度，因 此提高了消减杂交的效率。(4) 消减杂交分别将tester3-l和tester3-2与过量的driver3-l和 driver3-2在杂交緩沖液中混合，并加入51物TSCAP2和TSPA ，热 变性后，65~68°C下放置4~12小时，使tester和driver的cDNA进 行充分杂交；由于driver相比tester是过量的，所以第一次杂交过 后，tester里面只有差异表达的目的cDNA (target differentially expressed cDNA)还存在单链形式，大多数非差异cDNA与driver 的cDNA形成异源杂交子(heterohybrids )，也有少部分自身杂交。 此外由于杂交的二级反应动力学的特性(second order kinetics of hybridizations),那些单链的差异表达的目的cDNA被均一化了 即本来丰度不同的差异表达基因(差异表达的基因之间存在量的差 别)的单链cDNA在第一次杂交之后变得相对相等。将杂交产物混 合在一起，65 68。C下继续放置8~16小时，得到含有两端各自为接 头ADP I和ADP II的异源杂交子的杂交产物；这些新形成的目的 杂交子(差异性的cDNA)具有独一无二的特征，即它们的两端都 有接头(adaptor),其中一端是接头ADPI，另一端是ADPII。利 用这一特征，就可以用和ADP I及ADP II相匹配的引物选4奪性地 扩增那些差异表达的目的cDNA。(5) PCR扩增差异表达的cDNA:将杂交产物补平末端后，利用与ADPI和ADP II相匹配的引物进行选择性的PCR扩增，富集差异表达 的cDNA;所涉及引物序列如下(BstXI酶切位点用方框表示，I-Ppo I的酶切位 点用下划线表示，引物5'CP的序列用阴影表示，引物3，AP的序列用阴影 和下划线表示，下同)5，CP: 5，-TGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3， PH5 ,CP: 5 ，-pTGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3 ， 3'AP: 5，-TGGTTGGACTCGGTTTGGACG國3， PH3，AP: 5,-pTGGTTGGACTCGGTTTGGACG画3，ADP 1: 5 ，-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAGAATTCTTAAGGTAGCT-3' ADP II: 5，-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTCTCTTAAGGTAGCT-3 ，5，BK:5，-AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3, 3，BK:5，國AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3，TSCAP2: 5'-TGGTTGCCATAAGCGGATCATCCATAGAATTGGGTSPA: 5，-TGGTTGGACTCGGTTTGGACGCCATAGAATTGG(T)15VN-3，利用差异性的cDNA的特征，就可以用和ADP I及ADP II相匹配的引 物选择性地扩增这些差异表达的目的cDNA。只有差异性的cDNA可以指数 扩增，因为那些非差异的cDNA由于没有或者只有一端有接头。与接头相匹 配的一对巢式引物(nested primer)可以进一步富集差异表达的cDNA。此 外，ADP I及ADP II的5'端序列是一致的，在目的cDNA的上形成末端方 向重复序列(invert terminal repeats, ITR), ITR在PCR过程中会产生的PCR 抑制效果。研究表明，可以通过控制引物浓度，退火温度等因素来调节PCR抑制效果的强弱，克服PCR对小分子的偏好性，使大分子cDNA优先扩增 或达到与小分子cDNA同等效率地扩增。所述步骤(1)中逆转录按如下方法进行分别将1 ~2吗总RNA， lpL 10mM的dNTPs， lpL 10pMTSCAP1,及lpL 10|iMTSPA混合，在65。C下 放置3分钟后，在冰上冷却后加入2^L 5x第 一链合成緩沖液，0.25pL RNase Inhibitor以及0.75pL逆转录酶MMLV-RT H-,加灭菌的DEPC处理水补足 到10pL总体积后在42。C放置1.5小时使逆转录完成，最后加入0.5^1 0.2mM EDTA来螯合Mr^+，并加入70(iL无菌去离子水；所述5x第一链合成緩沖液组成为250mMTris-ClpH8.3， 375mMKCl，30mMMgCl2， 10mMMnCl2, 50mMDTT, 所涉及引物序列如下TSCAP1: 5，-TGGTTGCCATAAGCGGATCATCCATAGAATTGGG國p-3，TSPA: 5，-TGGTTGGACTCGGTTTGGACGCCATAGAATTGGKT) 15VN-3，优选的，所述步骤(4)中杂交緩沖液组成如下20mMTrispH9.2，0.5 M NaCl， 5 mM EDTA， 0.1g/mL PEG8000。具体的，将杂交产物补平末端后，加入与ADPI和ADP II相匹配的巢式引物Pl,并加入阻截引物5，BK和3，BK，进行第一步PCR扩增；再以第一步PCR扩增产物为模板，只加入引物Pl,进行第二步PCR扩增；第二步PCR扩增产物加入引物P2和AD2P，进行第三步PCR扩增，高效富集差异表达的cDNA;涉及的引物序列为 P1: 5 ，-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' P2: 5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA誦3'AD2P: 5 ,-CTGCAGGGAACCAATCCTCT-3'。见图2，在PCR过程中，所有分子在变性(denature)后都形成了单链，小部分非目的cDNA有可能在退火和延伸(annealing and extension)过程中偶然地形成杂交子，这种杂交子一旦形成就会^t指数扩增出来，因此会提高背景(图2中左边)；这一问题的解决方案是在第一步PCR反应液中除了引物P1，另外加入一对阻截引物(blockingprimer): 5'BK和3，BK。由于高浓度的引物5'BK和3'BK与那些非目的cDNA碰撞并结合的几率远远高于非目的cDNA之间形成异源杂交子，这些引物既对非目的cDNA有竟争抑制，又会改变非目的cDNA的分子结构而使其只能线性扩增(图2中右边)。这样以第一步PCR产物为模板，只用引物P1进行第二步扩增时，就只有差异性的目的cDNA可以指数扩增，再配合内部的巢式引物进行第三步PCR扩增就可以高效地富集差异表达的cDNA。由于本发明方法的独特性，这一步消除背景的技术不能运用到诸如"抑制性消减杂交"(SSH)等方法上。所述步骤(5 )将杂交产物用PCR反应液在75。C放置5 min补平末端。本发明还涉及一对用于全长cDNA均一化消减杂交的非磷酸化接头，其引物序列为 ADPI:5,-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAGAATTCTTAAGGTAGCT-3'ADPII:5，-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTC TCTTAAGGTAGCT-3 ，。为了获得罗氏沼虾(Macra6rac/n'wm msew6e^")雄性生殖系统特异性表 达的基因，可以促雄性腺所在的组织及其相邻的部分输精管样品作为tester, 卵巢样品作为driver,按照本发明方法进行消减杂交，可筛选出至少40个雄性生殖系统特异性的基因(不在卵巢中表达),其中37个特异性基因的cDNA 是全长的。消减杂交的PCR产物可以直接克隆到载体上，构建差异表达基因富集 的cDNA文库，利用这些文库分析基因表达，也可以制备基因芯片，还可以 标记为探针，从已有文库中筛选差异表达的基因。此外如果消减效率不够高， 还可以把消减杂交的PCR产物重复进行消减杂交，提高均一化和消减效率。本发明所述的全长cDNA均一化消减杂交(FNSH)方法的有益效果主 要体现在对差异基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，高效均 一化，并且得到全长cDNA。(四)


图1为FNSH流程示意图；图2为PCR扩增消减杂交产物背景的产生及其解决方案示意图； 图3为FNSH与SSH的比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并 不仅限于此实施例1:为了获得罗氏沼奸(Macra6rac/2/wm mse"&rgz7)雄性生殖系统特异性表达的基因，将促雄性腺所在的组织及其相邻的部分输精管样品作为tester,将卵巢样品作为driver,分别用TRIzol (Invitrogen)按产品说明书上的方法提取总RNA进行消减杂交所涉及引物或接头序列如下 5'CP: 5，-TGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3'PH5，CP: 5，-pTGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3， 3'AP: 5 ，-TGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3, PH3，AP: 5,-dTGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3， ADPI:5,-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAG AATTCTTAAGGTAGCT曙3' 3 ，-AGAATTCCATCG-5'ADPII:5,-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTC TCTTAAGGTAGCT-3' 3 ,-AGAATTCCATCG-5'5，BK:5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGT(3GTTGCCATAAGCGGATCATC-3' 3，BK:5，-AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3，TSCAP1: 5，-TGGTTGCCATAAGCGGATCATCCATAGAATTGG|G-p-3，TSCAP2: 5，國TGGTTGCCATAAGCGGATCATCCATAGAATTGGG-3,TSPA: 5，-TGGTTGGACTCGGTTTGGACGCCATAGAATTGG(T)15VN-3，P1: 5 ，-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' P2: 5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA國3'AD2P: 5，-CTGCAGGGAACCAATCCTCT-3,。其中接头ADP I和ADP II分别由相应的两条合成的DNA链在TN緩冲 液(10mM Tris, 10mM NaCl, pH8.0)中各以10^M的浓度混合后，在70 。C两分钟，然后緩慢冷却至室温而形成。 (1)第一链cDNA合成分别1寻1 ~2pg tester和driver的总RNA， l(xL 10mM的dNTPs, l^L10|xM TSCAP1,及lpL 10pM TSPA混合，在65°C下放置3分钟使RNA的 二级结构打开，在水上冷却后加入2pL 5x第一链合成緩冲液(250mM Tris-Cl pH8.3, 375mM KC1， 30mM MgCl2, 10mM MnCl2, 50mM DTT )， 0.25|_iLRNase Inhibitor( 40U/pL, TaKaRa)以及0.75pL逆转录酶MMLV - RT H- ( 200U/pL， Promega)或Superscript II(200U/(xL， Invitrogen),加灭菌的DEPC处理水补 足到10pL总体积后在42。C放置1.5小时使逆转录完成，最后加入0.5nL0.2M EDTA来螯合Mn2+,并加入70pL无菌去离子水，得到tester 1和driver 1 。(2) 双链cDNA合成testerl分两组， 一组取6pL testerl作为模寺反加上6)iiL引物PH5，CP和6pl 引物3，AP混合得到300pL PCR反应液[其他成分是1 OmM Tris pH9.0, 50mM KC1， 1.5mMMgC12， 0.1% ( w/v )triton X-IOO， 0.2mMdNTPs, 7.5UTaq&PfU 聚合酶(Promega) ( Taq: Pfu= 160: 1 )],另外一组取6pL testerl作为模 板但用6|iL引物5'CP和6|iL引物PH3，AP混合得到PCR反应液；与此同 时取6pL driverl作为模板加上6pL引物5，BK和6pL引物3'BK混合得到 PCR反应液；PCR反应液分装成50 ~ lOO^iL每管放置在PCR仪上反应，反 应程序如下先95。C l分钟预变性，接着进行20个循环的95°C 30秒，64 °C 30秒和68。C 6分钟；最后在68。C再延伸10分钟。反应产物用PCR纯 化试剂盒(Qiagen)纯化后分别得到tester2-l 、 tester2-2和driver2。(3) 选择性连接和引物延伸将200ng tester2-l和ADP I(lOixM)混合，另外将200ng tester2-2和1^1 ADP II(lO(aM)混合，分别加入lpL 10x连接緩沖液(400mM Tris-Cl pH7.8， 100mMMgC12, lOOmMDTT, 5mMATP)、 lpL50% ( w/v) PEG4000和1 jxL T4 DNA连接酶(Fermentas) ( 5U/|iL )，加灭菌水补足到10jxL后在16。C反应过夜(~ 16小时)，分别得到tester3-l和tester3-2;将2jag的driver2和l(xL 的3，BK混合，另外将2吗的driver2和lpL的5'BK混合在25pL的PCR反 应液中进行3个循环的反应95。C 30秒，64°C 30秒和68。C 6分钟。分别 得到driver3-l和driver3-2。(4) 均一化消减杂交第 一步杂交分两管，每管先加入1.25pL 4x杂交液(1 OOmM Tris-Cl pH9.2, 2MNaCl， 20mMEDTA, 0.4g/ml PEG8000 )， 0.25pL TSCAP2/TSPA混合物 (各5jxM)，然后在其中一管加入1.5|xLtester3-l和2|xLdriver3-l，在另一管 中则加入1.5pL tester3-2和2pL driver3-2,接着在95。C变性1.5分钟，然后 在66。C杂交6小时。第二步杂交是把第一步杂交的产物直接混合到一个管中 在66。C继续杂交16小时，然后加入200pL稀释液(20mM Tris pH9.2, 50mM NaCl)在68。C放置10分钟。(5) PCR扩增差异性cDNA:第一步PCR:取lpL如步骤(4 )所述稀释了的消减杂交产物估支模板， 在PCR反应液中加入引物P1 0.5jiL， 5'BK和3'BK各0.25^,加入其它的 PCR反应液(除Taq&PfU外)之后，先让PCR反应液达到75°C,加入0.625U 的Taq&PfU (Promega)在最终体积25pL的反应体系中75。C反应5分钟补 平末端，然后进行IO个循环的95°C 30秒，64°C 30秒和68°C 6分钟，最 后68°C延伸IO分钟。第二步PCR:取lpL第一步PCR产物做模板，加入0.5pL引物P1和其 他PCR反应液，进行PCR,反应程序是95。C l分钟，接着25循环95。C 30 秒，64°C 30秒和68。C 6分钟，最后68°C延伸10分钟。第三步PCR:取1jiL 1/10稀释的第二步PCR产物做模板，加入各0.5pL的引物P2和AD2P以及其他PCR反应液，再进行PCR,反应程序除了循环 数是15外，其他与第二步PCR的相同。(6) 消减文库的获得将步骤(5)第三步PCR产物连接到pCR 2.1载体(Invitrogen)上后， 转化到大肠杆菌TOPIO (Invitrogen)中得到一个消减文库。(7) 筛选差异表达的cDNA:从步骤(6)所得的文库中随机挑选了 120个克隆，用和pCR⑧2.1载体 (Invitrogen)上的引物M13F和M13R以PCR扩增出插入载体的cDNA片 段，把扩增产物点在带正电荷的尼龙膜上，按常规的方法处理后分别与tester 和driver的混合探针杂交。Tester和driver的混合探针分别用步骤(2 )所得 的双链cDNA用Roche公司的地高辛采用随机引物标记法标记，此外也可以 用步骤(5 )所得的消减杂交的PCR扩增产物代替步骤(2 )所得的双链cDNA 来标记。杂交的信号如果tester比driver的深则表明可能在tester样品中的表 达量高。我们将部分在和tester杂交信号强于driver的克隆测序并用Northern blot的杂交方法验证后，确认从中筛选出至少40个雄性生殖系统特异性的 基因(不在卵巢中表达)，这些序列已经递交到GenBank(序列号是 EF364516-EF364539和EF364541-EF364556 ),其中37个特异性基因的 cDNA是全长的。实施例2: FNSH与SSH的比较以罗氏沼奸(Macra6rac/n'ww mse"6ergz7)卵巢的cDNA作为SSH及 FNSH的driver,同时也作为SSH及FNSH的tester中的非差异表达的基因。 以N74的cDNA (GenBank序列号为EF364538,由实施例1所得并最终确 认为雄性生殖系统特异性表达)为tester中的差异表达的cDNA。不同量的N74的cDNA加入到tester分别进行SSH( SSH的tester用PH5，CP和PH3，AP 扩增然后与接头连接，driver用5'CP和3，AP扩增后用BstXI酶切，具体步 骤参见Diatchenko L., Lau Y,F.C., Campbell A.R, Chenchik A., Moqadam F., Huang B.， Lukyanov S., Lukyanov K,, Gurskaya N., Sverdlov E.D.， et al. 1996. Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 6025-6030.)和FNSH (方法同实施例1 ),最后PCR产物跑电泳、转膜并分 别与N74和actin的探针杂交。其中N74探针用来检测富集和均一化效率， 持家基因actin探针(见Zhu,X,J" Dai,Z.-M., Liu,J. and Yang,W.画J. (2005) Actin gene in prawn, MacraZ)rac/H,M附rasew^erg//: characteristics and differential tissue expression during embryonic development. Comp. _B/oc/zem.尸/2ys/0/. B Mo/.140: 599-605.)用来4全测消减效率。电泳结果见图3, 30 ng tester cDNA中所加N74 cDNA的量分别为30 pg ( 1和5 )， 3 pg ( 2和6 ), 0.3 pg(3和7 )及0.03 pg ( 4和8 ), FNSH-1表示第 一轮FNSH, FNSH-2表示 第二轮FNSH;其中9~12分别是5 8的第二轮FNSH的产物。结果，SSH只能有效地富集多于0.3 pg的差异性基因(在30 ng总tester cDNA中占0.001 % );而FNSH可以有效的富集多于0.03 pg的差异性基因(在30 ng总tester cDNA中占0.0001 % ,即百万分之一 )；而同时FNSH的 非差异基因actin的消减效果也优于SSH。第二轮FNSH对低表达量的差异 性cDNA更进一步富集的同时也减弱背景。序列表.ST25SEQUENCE LISTING〈110〉浙江大学〈120> —种全长cDNA均一化消减杂交方法〈130〉<160> 14〈170> Patentln version 3. 2<210> 1<211〉 22<212> 腿<213〉 Unknown<220><223>人工序列 〈400〉 1tggttgccat aagcggatca tc 22<210> 2<211> 22<212> DNA<213> Unknown<220><223>人工序列〈400〉 2tggttgccat aagcggatca tc 22<210> 3<211> 21<212> 腿<213〉 Unknown<220><223〉人工序列<400〉 3tggttggact cggtttggac g 21<210> 4<211〉 21<212〉 DNA<213> Unknown〈220〉<223〉人工序列<400> 4tggttggact cggtttggac g 21<210〉 5<211〉 57<212〉 腿<213> Unknown<220〉<223>人工序列<400> 5gtaatacgac tcactatagg gctgtagcgt ga卿cgaca gaattcttaa ggtagct 57<210> 6 <211> 53 <212> DNA<213〉 Unknown <220〉<223>人工序列 <400〉 6gtaatacgac tcactatagg gctgcaggga accaatcctc tcttaaggta get 53<210>7<211>42<212>DNA<213〉Unknown<220><223>人工序列<400>7aattaaccct cactaaaggg tggttgccat aageggatea tc 42<210>8<211〉41<212>DNA<213>Unknown<220〉<223〉人工序列<400〉8aattaaccct cactaaaggg tggttggact cggtttggac g 41<210> <211> <212〉 <213>934 腿Unknown<220〉<223>人工序列 <400〉 9tggttgccat 3agcgg3tca tccatagaat tggg 34<210>10<211>34<212〉DNA<213>Unknown<220><223〉人工序列<400〉10tggttgccat aageggatea tccat卿at tggg 34<210> 11〈211> 36<212> DNA<213〉 Unknown〈220〉<223> 人工序列〈220〉〈221〉raisefeature<222〉(36):_. (36)<223>n isa， c， g，<400>11tggttggact cggtttggac gecatagaat tggtvn 36<210>12<211>22<212>腿<213>Unknown<220><223>人工序列<400>12gtaatacgac tcactatagg gc 22<210> 13<211> 21<212> 腿<213〉 Unknown<220〉<223>人工序列<400〉 13tgtagcgtga agacgac卿a 21〈210〉 14<211> 20<212> DNA<213〉 Unknown<220>〈223>人工序列<400〉 14ctgcagggaa ccaatcctct 20
权利要求
1. 一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤(1) 第一链cDNA的合成选取含有差异表达基因的两组样品特有 的或差异表达基因表达较高的样品为tester,没有或差异表达基 因表达较低的样品为driver,抽提样品的总RNA，分别利用模板 转换技术进行逆转录，分别合成tester和driver的第 一链cDNA, 分别命名为tester 1和driver 1;(2) 双链cDNA的合成将testerl分为两组testerl-l、 testerl-2, testerl-1利用引物3'AP和5，磷酸化引物PH5，CP，通过PCR扩 增合成双链cDNA,得到有义链上5'末端磷酸化的双链cDNA: tester2-l; testerl-2利用引物5'CP和3，磷酸化引物PH 3'AP,通 过PCR扩增合成双链cDNA,得到反义链上5'末端磷酸化的双链 cDNA: tester 2-2; driver 1利用引物5'BK和3'BK或者引物5，CP 和3'AP,通过PCR扩增合成双链cDNA: driver2,所述引物5，CP 和PH5，CP的序列一致且都与步骤(1 )中的TSCAP相对应，3，AP 和PH3，AP的序列一致且都与步骤(1 )中的TSPA相对应，5，BK 的3'末端含有与5'CP相同的序列，引物3'BK的3'末端含有与 3'AP相同的序列；(3 )选择性连接和引物延伸将tester2-l和tester2-2分别用非磷酸化 的接头ADPI和ADP II进行连接，得到连接产物tester3-l和 tester3-2; driver2分为两组driver2画l、 driver2-2，所述的driver2-l、 driver2-2分别采用引物5'BK和3'BK,在PCR条件下进行3~5个循环，分别得到单链cDNA富集的driver3-l和driver3-2;(4) 消减杂交分别将tester3-l和tester3-2与过量的driver3-l和 driver3-2在杂交緩沖液中混合，并加入引物TSCAP2和TSPA， 热变性后，65 68"C下放置4 12小时，使tester和driver的cDNA 进行充分杂交；将杂交产物混合在一起，65 68。C下继续放置8~16 小时，得到含有两端各自为接头ADPI和ADP II的异源杂交子 的杂交产物；(5) PCR扩增差异表达的cDNA:将杂交产物补平末端后，利用与ADPI和ADP II相匹配的引物进行选择性的PCR扩增，富集差异表达的cDNA; 所涉及引物序列如下5'CP: 5，-TGGTTGCCATAA(5CGGATCATC-3， PH5,CP: 5，-pTGGTTGCCATAAGCGGATCATC-3， 3，AP: 5，-TGGTTGGACTCGGTTTGGACG-3， PH3，AP: 5 ,画pTGGTTGGACTCGGTTTGGACG誦3 ，ADP I: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAGAATTCTTAAGGTAGCT-3' ADP II: 5，國GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTCTCTTAAGGTAGCT-3'5，BK:5 ，-AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGTTGKXATAAGCGGATCATC-3' 3'BK:5，腸AATTAACCCTCACTAAAGGGTGGTTGGACTCGGTTTGGACG画3 ，TSCAP2: 5 ,醫TGGTTGCCATAAGCGGATCAT CCATAGAATTGGG隱TSPA: 5 ,-TGGTTGGACTCGGTTTGGACGlCCATAGAATTGG^T) 15VN-3 ，。
2.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(l)中逆转录按如下方法进行分别将1 2吗总RNA, 1mL 10mM的dNTPs， lpL 10|iMTSCAP，及l(iL lO)aMTSPA混合，在65。C下放置3分钟后，在冰上冷却后加入2(xL 5x第 一链合成緩冲液，0.25(iL RNase Inhibitor以及0.75(iL逆转录酶MMLV-RT H-，加灭菌的DEPC处理水补足到10|oL总体积后在42。C放置1.5小时使逆转录完成，最后加入0.5(il 0.2mM EDTA来螯合Mi^+，并加入70jJL无菌去离子水；所述5x第一链合成緩冲液组成为250mM Tris-Cl pH8.3, 375mM KC1，30mMMgCl2, 10mMMnCl2， 50mMDTT， 所涉及引物序列如下TSCAP1: S'-TGGTTQCCATAAGCGGATeAT^^MMII^lG-P-3'TSPA: 5，-TGGTTGGACTCGGTTTGGACGCCATAGAATTGG(T)15VN
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中杂交i爰冲液组 成如下20 mM Tris pH 9.2, 0.5 M NaCl， 5 mM EDTA, 0.1g/mL PEG8000。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(5)为将杂交产物补平末端后，加入与ADPI和ADP II相匹配的巢式引物Pl,并加入阻截引物5，BK和3，BK，进行第一步PCR扩增；再以第一步PCR扩增产物为模板，只加入引物Pl,进行第二步PCR扩增；第二步PCR扩增产物加入引物P2和AD2P，进行第三步PCR扩增，高效富集差异表达的cDNA( 涉及的引物序列为Pl: 5，-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3， P2: 5,-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3'AD2P: 5 ,-CTGCAGGGAACCAATCCTCT-3'。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5 )将杂交产物用PCR反 应液在75"C^t置5min补平末端。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法以罗氏沼虾(Macra6rac/H'wm m^"&^//)促雄性腺所在的组织及其相邻的部分输 精管样品作为tester,卵巢样品作为driver。
7. 用于全长cDNA均一化消减杂交的非磷酸化接头，其引物序列为 ADPI:5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAG AATTCTTAAGGTAGCT-3， ADPII:5，-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTC TCTTAAGGTAGCT-3 。
全文摘要
本发明提供了一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤(1)第一链cDNA的合成；(2)双链cDNA的合成；(3)选择性连接和引物延伸；(4)消减杂交；(5)PCR扩增差异表达的cDNA。消减杂交的PCR产物可以直接克隆到载体上，构建差异表达基因富集的cDNA文库，利用这些文库分析基因表达，也可以制备基因芯片，还可以标记为探针，从已有文库中筛选差异表达的基因。此外如果消减效率不够高，还可以把消减杂交的PCR产物重复进行消减杂交，提高均一化和消减效率。本发明所述的全长cDNA均一化消减杂交(FNSH)方法的有益效果主要体现在对差异基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，高效均一化，并且得到全长cDNA。
文档编号C12N15/10GK101311266SQ20071006901
公开日2008年11月26日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者戴忠敏, 朱晓静, 杨卫军 申请人:浙江大学