专利名称：一种基于氧化/还原探针的抗体/抗原或dna杂化检测装置及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基于氧化/还原探针的抗体/抗原或DNA杂化检测装置与方法。本发明的主要应用领域包括生化、环保以及食品安全等。
背景技术：
免疫检测技术是利用抗原和抗体之间的特异性反应来对抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术，其中包括酶免疫分析技术，荧光免疫测定技术，免疫胶体金标记技术，免疫磁珠技术等。但是，大多数的免疫传感器还需要额外的带标记的抗体把抗原和抗体的结合转化为可检测的信号，这样就增大了检测的复杂度，因此很有必要开发无需标记的免疫检测传感器。目前已经开发出一些无需标记的免疫传感器，它们从原理上分可以分为石英晶体免疫传感器，表面等离子体共振免疫传感器和电化学免疫传感器等。在这之中，电化学免疫传感器由于结构简单，使用方便而引起了人们的极大重视。
无需标记的电化学免疫传感器的基本原理如下。在电极表面，先固定上抗体，然后放入溶液中。同时，在被测溶液中加入氧化/还原探针，如[Fe(CN)6]3-/4-作为探针(在这里，氧化/还原对其实就相当于标记，只不过这个标记是直接添加在溶液中，而不需要固定在抗体上)。当溶液中存在被测对象，例如大肠杆菌时，它就会和电极表面的抗体结合。抗原和抗体都是一些生物电介质，不导电，也就是说它们相当于是电极表面的一层绝缘物质，这样就会阻碍氧化/还原对在电极表面的电化学反应速度，从而达到检测目的。这一检测原理不仅可用于基于免疫法的致病菌检测，也可以用于DNA的杂交、biotin-avidin结合等的检测，因为这些检测从原理上来讲和抗原/抗体的反应是一样的，都是介电生物分子的结合。
传统的电化学免疫传感器主要通过测量工作电极(在本发明中相当于产生电极)上在抗原/抗体反应前后的电化学动力学参数，如电化学阻抗、氧化还原电流等的变化来实现抗原的检测。但在测量时间、灵敏度等方面还存在一些问题，发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种能提高灵敏度的基于氧化/还原探针的抗体/抗原或DNA杂化结合检测装置。为此，本发明采用以下技术方案它包括参比电极、产生电极、收集电极以及对电极，所述产生电极和收集电极之间的距离小于等于100微米，在产生电极和收集电极表面固定有被测对象的抗体或单链的DNA分子，它还设有检测收集电极上的电极动力学参数的双电极恒电流电位仪。
由于采用本发明的技术方案，本发明将生物材料的介电特性和产生电极/收集电极之间的耦合效应结合起来，以[Fe(CN)6]3-/4-为例，二价的铁离子首先在产生电极上被氧化，然后通过扩散到达收集电极上，再在收集电极上被还原。在产生电极和收集电极上的电化学反应都会受到生物反应的影响，因此，在溶液中的生物反应之后，收集电极上的电化学反应参数会有更大的变化，从而能够进一步提高检测灵敏度。在本发明的技术方案中，产生电极和收集电极之间的距离越小，其检测灵敏度越高，只要保证产生电极和收集电极之间不接触即可。考虑工艺难度并综合考虑灵敏度，产生电极和收集电极之间的距离在大于等于80纳米至小于等于100微米之间，是比较经济并且保证测量结果高精度的选择。
本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度的基于氧化/还原探针的抗体/抗原或DNA杂化检测装置的检测方法。为此，本发明采用以下技术方案，在生物反应前后分别进行以下操作以参比电极为电位参考点，在产生电极上施加一氧化电压，收集电极上施加一还原电压，然后测量流经收集电极上的电流；在上述操作结束后对比收集电极上的电流得到测量结果；或在生物反应前后分别进行以下操作以参比电极为电位参考点，在产生电极上施加一还原电压，收集电极上施加一氧化电压，然后测量流经收集电极上的电流；在上述操作结束后对比收集电极上的电流得到测量结果。
上述检测方法还可以采用以下技术方案，以参比电极为电位参考点，在产生电极上施加一氧化电压，收集电极上施加一还原电压，然后再叠加一幅度较小的交流电压，然后测量收集电极上的电化学反应阻抗；在上述操作结束后对比收集电极上的电化学反应阻抗得到测量结果；或在生物反应前后分别进行以下操作以参比电极为电位参考点，在产生电极上施加一还原电压，收集电极上施加一氧化电压，然后再叠加一幅度较小的交流电压，然后测量收集电极上的电化学反应阻抗；在上述操作结束后对比收集电极上的电化学反应阻抗得到测量结果。
本发明采用测量收集电极上的电化学反应参数的方法进行测量，参数变化范围大，能获得更高的检测灵敏度。
图1为本发明结构的俯视示意图。
图2为本发明结构的侧视示意图。
图3为采用叉指电极实施方式的本发明结构俯视示意图。
具体实施例方式
实施例1大肠杆菌的检测参照附图1和2。本发明包括参比电极1、产生电极2、收集电极3以及对电极4，所述产生电极和收集电极之间的距离小于等于100微米，以及检测收集电极上的电极动力学参数的双电极恒电流电位仪8。附图3为本发明采用叉指电极形式的实施示意图，在图中，参比电极、对电极的附图标号与图1和2相同，产生电极的附图标号为6，收集电极的附图标号为7。
根据检测对象的不同，若是抗原或致病菌检测，在产生电极和收集电极表面固定有被测对象的抗体。
在这里，参比电极的作用主要是用来提供电压基准，对电极用来提供电极旁路，使得电流从对电极而不是从参比电极流过，以避免电流对参比电极的电压的影响。产生电极和收集电极是本发明中起主要作用的电极。
本实施例用于对大肠杆菌的检测。在本实施例中，产生电极6和收集电极7采用叉指电极的结构(如图3所示)，其目的主要是在保持产生电极和收集电极微小间距的前提下同时增大两电极的工作面积。参比电极、产生电极，收集电极以及对电极都采用标准集成电路加工工艺，通过溅射或蒸镀的方法在玻璃基底上形成，其中参比电极所采用的材料为银，而产生电极，收集电极以及对电极所采用的材料为金。产生电极和收集电极的叉指宽度为10微米，叉指间的距离也为10微米。在电极表面通过常用的生物化学方法固定商品化的大肠杆菌抗体。在实际检测中，首先将装置浸入含有[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中，一般控制[Fe(CN)6]3-/4-浓度小于100mM，本实施例[Fe(CN)6]3-/4-的浓度为10mM，以参比电极为基准，在产生电极上施加0.4V电压，而在收集电极上施加-0.2V电压，分别测试加入含有大肠杆菌的被测溶液前后收集电极上流经的电流，实现大肠杆菌的检测。对生物反应前后收集电极上的电流进行比较，当溶液中不存在大肠杆菌时，在收集电极上测得电流为800微安，而当溶液中大肠杆菌的浓度为107cfu/ml时，在收集电极上测得电流为300微安。而当溶液中大肠杆菌的浓度为1010cfu/ml时，在收集电极上测得电流为50微安。
上述检测方法也可以是以参比电极为电位参考点，在生物反应前分别在产生电极上施加一还原电压，收集电极上施加一氧化电压，然后测量流经收集电极上的电流；在生物反应结束后再重复上述操作；在上述操作结束后对比收集电极上的电流得到测量结果。
实施例2大肠杆菌的检测本实施例所提供的检测装置与实施例1相同。在检测过程中首先将装置浸入含有10mM[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中，以参比电极为基准，在产生电极上施加0.4V电压，而在收集电极上施加-0.2V直流电压叠加一幅度较小的交流电压，一般，交流电压小于10mV，本实施例的采用频率从1Hz到1MHz幅值为10mV的正弦交流电压，分别采用标准电化学阻抗法测试加入含有大肠杆菌的被测溶液前后收集电极上电化学反应阻抗，对比实现大肠杆菌的检测。对生物反应前后收集电极上阻抗进行比较，当溶液中不存在大肠杆菌时，在收集电极上测得电极阻抗为400欧姆，而当溶液中大肠杆菌的浓度为107cfu/ml时，在收集电极上测得电极阻抗为900欧姆安。而当溶液中大肠杆菌的浓度为1010cfu/ml时，在收集电极上测得电极阻抗为2000欧姆。
上述检测方法也可以是以参比电极为电位参考点，在生物反应前分别在产生电极上施加一还原电压，收集电极上施加一氧化电压，然后再叠加一幅度较小的交流电压，然后测量收集电极上的电化学反应阻抗；在生物反应结束后再重复上述操作；在上述操作结束后对比收集电极上的电化学反应阻抗得到测量结果。
实施例3DNA杂化的检测本实施例的检测装置结构和实施例一基本相同，只是在电极表面固定单链DNA而不是大肠杆菌抗体。在实际检测中，首先将装置浸入含有10mM[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中，以参考电极为基准，在产生电极上施加0.4V电压，而在收集电极上施加-0.2V直流电压，分别测试加入含有对应DNA单链的被测溶液前后收集电极上电化学反应阻抗，对反应前后收集电极上阻抗进行比较，实现DNA杂化的检测。
权利要求
1.一种基于氧化/还原探针的抗体/抗原或DNA杂化检测装置，其特征在于它包括参比电极、产生电极、收集电极以及对电极，所述产生电极和收集电极之间的距离小于等于100微米，在产生电极和收集电极表面固定有被测对象的抗体或单链的DNA分子，它还设有检测收集电极上的电极动力学参数的双电极恒电流电位仪。
2.基于氧化/还原探针的抗体/抗原或DNA杂化检测装置的检测方法，其特征在于在生物反应前后分别进行以下操作以参比电极为电位参考点，在产生电极上施加一氧化电压，收集电极上施加一还原电压，然后测量流经收集电极上的电流；在上述操作结束后对比收集电极上的电流得到测量结果；或在生物反应前后分别进行以下操作以参比电极为电位参考点，在产生电极上施加一还原电压，收集电极上施加一氧化电压，然后测量流经收集电极上的电流；在上述操作结束后对比收集电极上的电流得到测量结果。
3.基于氧化/还原探针的抗体/抗原或DNA杂化检测装置的检测方法，其特征在于在生物反应前后分别进行以下操作以参比电极为电位参考点，在产生电极上施加一氧化电压，收集电极上施加一还原电压，然后再叠加一幅度较小的交流电压，然后测量收集电极上的电化学反应阻抗；在上述操作结束后对比收集电极上的电化学反应阻抗得到测量结果；或在生物反应前后分别进行以下操作以参比电极为电位参考点，在产生电极上施加一还原电压，收集电极上施加一氧化电压，然后再叠加一幅度较小的交流电压，然后测量收集电极上的电化学反应阻抗；在上述操作结束后对比收集电极上的电化学反应阻抗得到测量结果。
全文摘要
本发明提供一种基于氧化/还原探针的抗体/抗原或DNA杂化结合检测装置。它包括参比电极、产生电极、收集电极以及对电极，所述产生电极和收集电极之间的距离小于等于100微米，在产生电极和收集电极表面固定有被测对象的抗体或单链的DNA分子，它还设有检测收集电极上的电极动力学参数的双电极恒电流电位仪。本发明所提供的检测装置能提高检测灵敏度。本发明还提供了一种基于氧化/还原探针的抗体/抗原或DNA杂化检测装置的检测方法。它通过测量和对比生物反应前后收集电极上的电流或电化学反应阻抗得到测量结果。本发明采用测量收集电极上的电化学反应参数的方法进行测量，参数变化范围大，能获得更高的检测灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK101059509SQ20071006851
公开日2007年10月24日 申请日期2007年5月11日 优先权日2007年5月11日
发明者吴坚 申请人:浙江大学