人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法

专利名称：人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明属生物技术，涉及一种外源性表达人端粒酶的骨髓间充质干细胞构建和筛选的新技术。这种技术能使骨髓间充质干细胞高效表达外源人端粒酶，由此提高骨髓间充质干细胞的生命周期。
背景技术：
目前常用可用于延长细胞生命周期、使细胞永生化的技术大致可归为四种Epstein-Barr病毒(EBV)感染技术，转猴病毒40(SV40)大T抗原技术，转16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6/E7技术，转端粒酶基因技术。EB病毒与细胞共培养使细胞永生应用最多的是B淋巴细胞。EB病毒永生化B淋巴细胞的一个最显著特点就是端粒酶活性提高，这是导致B淋巴细胞永生的主要原因。SV40是简单的真核细胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，将其整合人靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。但是Shay等(1989)研究结果表明，在大多数情况下，SV40转染细胞的永生化率非常低。乳头瘤病毒E6、乙型肝炎病毒(HBV)可以使一些特殊细胞的增殖能力加强，但它们并不是使细胞永生的常用病毒。人乳头瘤病毒E6蛋白通过对端粒酶催化亚基(hTERT)的转录调控而激活端粒酶；hTERT启动子上游HBV增强子的整合可顺式激活hTERT基因转录，这种顺式激活作用是hTERT基因转录及端粒酶调节的原发机制。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体，为一种特殊的DNA聚合酶，合成DNA到染色体末端。端粒酶一旦被激活，将维持端粒缩短和延长的动态平衡，从而使细胞获得无限增殖的能力，使之永生。病毒转化的各种人永生化细胞试验结果证明端粒酶活化可能是细胞永生化的共同步骤。延长细胞生命周期，使细胞永生化最常用的技术就是通过构建含端粒酶催化亚基(hTERT)的表达载体，通过各种方法来转染细胞。

发明内容
本发明的目的是提供一种人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法，是通过转基因技术，对人骨髓间充质干细胞转导人端粒酶基因，提高人骨髓间充质干细胞中这种蛋白的表达水平，达到提高骨髓间充质干细胞的生命周期的目的。通过以下方案实现(1)构建pLXSN-hTERT表达载体，pGRN145质粒(Geron Corportion，Menlo Park，CA)采用Hpa I和Not I限制性内切酶(Takara)酶切，经琼脂凝胶电泳分离提纯得到hTERT cDNA片段，并与采用相同限制性内切酶酶切的pLXSN载体(Stratagene，La Jolla，CA)相连，构建成pLXSN-hTERT重组表达载体。
本发明对pGRN145质粒采用Hpa I和Not I限制性内切酶酶切，经琼脂凝胶电泳分离提纯得到hTERT cDNA片段，第一步行hTERT cDNA片段提纯。
本发明对pLXSN载体(Stratagene，La Jolla，CA)采用Hpa I和Not I限制性内切酶酶切，经琼脂凝胶电泳分离提纯得到pLXSN载体片段，第二步行表达载体片段提纯。
本发明所用的人反转录病毒载体是采用pLXSN载体，获得高效表达hTERT的pLXSN-hTERT重组表达载体。
(2)构建高效表达外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞，依据LipofectAMINE脂质体转导试剂盒(Life Technologies，Grand Island，NY)指导说明书，通过兼噬性包装细胞系PA317(ATCC，Rockefeller，MA)制备pLXSN-hTERT重组表达载体悬浮液后，在1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene，Sigma，St.Louis，MO)辅助下对人骨髓间充质干细胞(邱丽燕等，2004)进行8个小时的pLXSN-hTERT表达载体转导。由此构建高效表达外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞。
(3)采用低浓度(20微克/毫升和50微克/毫升)潮霉素(Hygromycin)(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)进行双重筛选转导外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞的技术，提高转导外源hTERT基因的骨髓间充质干细胞的存活能力。
本发明的有益效果是(1)本发明提供的技术中采用hTERT和pLXSN载体相接的高效表达hTERT的pLXSN-hTERT表达载体转导，达到了构建高效表达hTERT外源性基因的人骨髓间充质干细胞的效果。
(2)本发明技术构建的外源性表达hTERT的人骨髓间充质干细胞在低溶度Hygromycin(Amresco，USA)双重筛选培养体系中，除去了培养体系中未转导hTERT的人骨髓间充质干细胞，提高了构建外源性表达hTERT的人骨髓间充质干细胞的成功率。


图1高效表达hTERT的表达载体pLXSN-hTERT。
图2用RT-PCR技术，Northern blotting技术检测hTERT基因的表达和用Western blotting技术检测hTERT蛋白的表达。
图3用流式细胞仪分析第95代hTERT-hMSCs细胞的表面抗原图4用流式细胞仪分析第275代hTERT-hMSCs细胞的表面抗原图5用流式细胞仪分析正常第13代hMSCs细胞的表面抗原。
图6用G-显带分析细胞的核型。
图7骨髓间充质干细胞永生系的生命周期分析。
图8骨髓间充质干细胞永生系向脂肪，软骨，成骨细胞分化的潜能分析。
图9软琼脂培养克隆形成试验结果。
图10免疫缺陷小鼠致瘤实验结果。
具体实施例方式
本发明结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1本发明技术采用Hpa I和Not I限制性内切酶酶切pGRN145质粒，经琼脂凝胶电泳分离提纯得到hTERT cDNA片段，与采用相同限制性内切酶酶切的人反转录病毒载体pLXSN载体相连，构建成高效表达hTERT的pLXSN-hTERT重组表达载体，参见图1。
具体步骤如下一，pGRN145质粒的大量制备(碱裂解法)1)将洗过的500毫升细菌(含pGRN145质粒)培养物沉淀重悬于18毫升溶液I(含50毫摩尔/升葡萄糖，25毫摩尔/升Tris.Cl(pH 8.0)，10毫摩尔/升EDTA(pH 8.0))中。
2)加2毫升新配制的溶菌酶溶液[10毫克/毫升，溶于10毫摩尔/升Tris·Cl(pH 8.0)](当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。)3)加40毫升新配制的溶液II
，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
4)加20毫升用冰预冷的溶液III(5摩尔/升乙酸钾60毫升，冰乙酸11.5毫升，水28.5毫升)。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。
5)于4℃以4000转/分离心15分钟，使转头自然停转。(若细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠液体。(未能形成致密沉淀的原因通常是由于溶液III与细菌裂解物混合不充分。)6)用4层干酪包布把上清过滤至一个250毫升离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，与室温放置10分钟。
7)于室温以5000转/分离心15分钟，回收核酸(若4℃离心，盐也会沉淀。)8)小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗沉淀和管壁。倒出乙醇，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
9)用3毫升TE(pH 8.0)溶解核酸沉淀。
10)用聚乙二醇纯化质粒DNA.
二，hTERT cDNA片段的制备采用Hpa I，Not I酶切，反应体系如下pGRN 145质粒1微升Hpa I 0.5微升Not I 0.5微升10×Bufer 1微升乙酞化BSA 1微升去离子水6微升总体积10微升37℃温育16小时，1％琼脂糖电泳，长波紫外线下观察，直到插入的目的带和载体带清楚的分离后，使用手术刀片切下回收电泳片段，采用凝胶回收试剂盒回收目的条带。
三，pLXSN载体的制备pLXSN质粒大量制备的基本程序，除了使用的液体和固体LB培养基加入的筛选抗菌素为氨卞青霉素代替了氯霉素外，提取程序与pGRN145质粒的大量制备相同。采用Hpa I，Not I酶切，反应体系如下pLXSN质粒 1微升
Hpa I0.5微升Not I0.5微升10×Bufer1微升乙酞化BSA1微升去离子水 6微升总体积 10微升37℃温育16小时，1％琼脂糖电泳，长波紫外线下观察，直到插入的目的带和载体带清楚的分离后，使用手术刀片切下回收电泳片段，采用凝胶回收试剂盒回收目的条带。
四，hTERT cDNA片段同pLXSN载体的连接，形成hTERT-pLXSN质粒载体和目的片段(hTERT)连接反应体系pLXSN 1微升hTERT cDNA 1微升T4 ligase Bufer(10×) 1微升T4 ligase 0.5微升去离子水6.5微升总体积 10微升上述反应的加样顺序是，首先将载体和目的片段和去离子水加入到反应管中，65℃水浴5分钟，立即冰浴使粘性末端暴露，然后加入T4连接酶和连接酶缓冲液。连接反应在16℃条件下进行，连接18小时。
五，制备感受态细菌以下实验均在无菌条件下完成。(1)接种0.1毫升TOP10菌种到6毫升无抗菌素LB液体培养基中，以200r/min速度在37℃摇床振荡培养，当液体的OD 600值达到0.4后将培养管置于冰水浴中。(2)在超净工作台内，无菌分装菌液，每管1.5毫升，4℃ 4000rpm离心5分钟，弃上清。(3)每管加入0.5毫1冰预冷的0.1摩尔/升CaCl2悬浮菌体。(4)4℃ 4000rpm离心5分钟，弃上清后加入0.1毫升冰预冷的0.1摩尔/升CaCl2重悬菌体后，置4℃冰箱次日使用。
六，制备含青霉素的固体平板培养基(1)称取胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl 10克，加蒸馏水1000毫升，使其充分溶解，加入5摩尔/升NaOH调PH至7.0。(2)取250毫升三角烧瓶10只，每只加入琼脂1.5克后加入溶解后的液体LB培养基100毫升。1.034×105帕高压灭菌20分钟，常温保存备用。(3)制备固体LB平板时，取出100毫升的无抗菌素固体LB，在微波炉内加热使其融化后，置室温等待其温度降低到50-55℃时，加入氨苄青霉素(50毫克/毫升)0.3毫升，混均后倒入无菌的平皿中，常温下等其凝固后置4℃。
七，转化感受态细胞(1)取前一天制备的感受态细胞一支，加入第三步的连接质粒产物hTERT-pLXSN 5微升，混均后冰浴30分钟。(2)42℃水浴90秒，热休克后立即冰浴2分钟。(3)加入无抗菌素的液体LB培养基400微升，37℃温育1小时。(4)4000rpm离心10分钟，弃上清400微升液体，取余下的100微升重悬转化菌，全部铺于含有抗菌素的LB固体平板上，37℃温育16小时，可见转化菌落生长。
八，转化菌的小量培养、扩增和质粒提取采用v-gene公司的少量质粒抽提试剂盒。(1)取含有氨苄青霉素的LB固体平板上的单个转化菌落，接种到6毫升含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，以200r/min速度在37℃摇床振荡培养16小时后，取菌液1.5毫1置于离心管中，4000rpm离心5分钟，弃上清。(2)加入250微升的溶液I，充分悬浮菌体。(3)加入250微升溶液II，注意混匀，此时液体变得澄清和粘稠，置室温放置2分钟。(4)加入400微升溶液III，置室温放置2分钟。(5)12000rpm离心10分钟，回收上清。(6)将上清置于质粒回收柱中，5500rpm离心1分钟。(7)弃废液，加入500微升washing buffer，5500rpm离心1分钟。(8)重复步骤7一次。(9)12000rpm离心1分钟，加入60微升TE缓冲液置室温2分钟。12000rpm离心1分钟，所得质粒溶液置于-20℃备用。
九，重组菌的筛选取固体平板上的单个转化菌落，接种到0.1毫升含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，以200r/min速度在37℃摇床振荡培养16小时后，用PCR方法筛选目的质粒。人端粒酶基因上游引物序列5’-CTC TCC CCC TTG AAC CTCCTC GTT C；下游引物序列5’-AGG ACA CCT GGC GGA AGG AG。
具体反应体系上游引物序列(10微摩尔/升) 1微升下游引物序列(10微摩尔/升) 1微升MgCl(25毫摩尔/升) 1.2微升菌液 0.5微升
dNTP(4毫摩尔/升) 1微升Taq DNA polymerase(10单位/微升)0.4微升Buffer(10×) 2微升去离子水 12.9微升总体积 20微升操作过程首先在无菌0.2毫升离心管中，依次加入除了Taq聚合酶之外的各种反应物质，置94℃水浴中预变性5分钟，立即置入冰水浴中。加入Taq聚合酶后进PCR循环。条件如下94℃变性30秒；52℃退火30秒；72℃延伸80秒；周期25个循环。PCR周期结束后，置72℃延伸7分钟。将PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭染色，手提式紫外分析仪下观察，获得阳性克隆。用碱裂解法提取阳性克隆的质粒。
十，pLXSN-hTERT重组质粒鉴定采用酶切图谱法，使用Hpa I；Not I作酶切。
pLXSN-hTERT的Hpa I ；Not I酶切体系pLXSN-hTERT1微升Hpa I 0.5微升Not I 0.5微升10×Bufer 1微升乙酞化BSA 1微升去离子水 6微升总体积 10微升以上反应体系的酶切反应在37℃温育2小时，1％琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭染色，短波紫外分析仪下观察和投射紫外分析仪下拍照。
实施例2本发明技术采用LipofectAMINE脂质体转导试剂盒，按试剂盒使用方法进行重组表达载体悬浮液的制备和对人骨髓间充质干细胞的转导。按照试剂盒说明书，采用兼噬性包装细胞系PA317制备重组病毒载体悬浮液，并用200微克/毫升潮霉素进行筛选重组表达载体4天。在8微克/毫升的1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene；Sigma，St.Louis，MO)辅助下，于10-cm的培养皿(Maxisorp，Nunc，Denmark)中对2.0×105个人骨髓间充质干细胞进行8个小时的重组表达载体转导。然后用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞，并用20微克/毫升潮霉素进行第一次筛选细胞7天。7天后以正常培养液洗涤细胞，并继续用50微克/毫升潮霉素进行第二次筛选细胞7天。之后，用正常完全培养液进行传代培养。
实施例3本发明技术采用RT-PCR技术和Northern blotting技术检测转导的人骨髓间充质干细胞中hTERT基因的表达水平。结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞有效表达了hTERT基因，参见图2A、2B，图中显示了(A)用RT-PCR检测hTERT基因的表达，其中包括Marker(3kb)泳道，泳道1第95代hTERT-hMSCs细胞的hTERT基因和β-actin基因的表达，泳道2第275代hTERT-hMSCs细胞的hTERT基因和β-actin基因的表达，泳道3正常第13代hMSCs细胞的hTERT基因和β-actin基因的表达，泳道4用水做对照的RT-PCR。(B)用Northern blotting检测hTERT基因的表达，其中包括泳道1第95代hTERT-hMSCs细胞的hTERT基因和β-actin基因的表达，泳道2第275代hTERT-hMSCs细胞的hTERT基因和β-actin基因的表达，泳道3正常第13代hMSCs细胞的hTERT基因和β-actin基因的表达。
1、RT-PCR技术检测设计外源人端粒酶基因RT-PCR检测的引物序列(上游5’-CTC TCCCCC TTG AAC CTC CTC GTT C；下游5’-AGG ACA CCT GGC GGA AGGAG)，产物片断408bp。对照β-actin的引物序列(上游5’-CAT CTC TTG CTCGAA GTC CA-3’；下游5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A)，产物片断318bp。进行RT-PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后观察和检测外源端粒酶基因mRNA的表达。
2、RNA提取步骤(采用Invitrogen公司的TRIZOL总RNA提取试剂盒，按使用说明书进行)(1)以10cm2的培养瓶底面积加入1毫升Trizol(Invitrogen，Beijing，China)的比例加入Trizol进行匀浆。
(2)4℃下12000g离心10分钟，将上清转移到一洁净无RNA酶(RNase)的离心管中(RNA存在于上清中)。
(3)室温放置5分钟。每1毫升Trizol加入0.2毫升氯仿，盖好试管，剧烈摇动15秒钟，室温温浴3分钟，4℃12000g离心15分钟。离心后混合物分为三层，底部红色的酚-氯仿层，中间相和无色的上层水相，RNA只存在于上层水相中。
(4)转移水相至一洁净的试管中，加0.5毫升异丙醇洗涤沉淀，4℃下12,000g离心5分钟。
(5)稍微干燥RNA沉淀(空气干燥5-10分钟)，用适量的去离子水溶解RNA，电泳检测RNA的质量(RNA不能彻底干燥，否则很难溶解)。
3、逆转录的步骤(按照逆转录酶试剂盒的说明书进行)1)cDNA的合成反应体系(1)在一个0.2毫升的离心管中混合引物，RNA和四种脱氧核糖核酸混合物(dNTP Mix)，用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水调整体积至11微升。
成分 数量50μM Oligo(dT)18引物 0.5微克总RNA 0.1-5微克去离子水(无核酸酶)至11微升(2)上述混合物于70℃温浴5分钟，然后立即置于冰上。
(3)使用前振荡5×cDNA合成缓冲液5秒钟。
(4)往上述离心管中加入以下成分成分 数量5×反应缓冲液 4微升10mM dNTP Mix 2微升核糖核酸酶抑制剂(Ribonuclease inhibitor) 20单位去离子水(无核酸酶)至19微升于37℃下温浴5分钟，添加200单位的逆转录酶。将上述混合物短暂离心混匀后，立即放于42℃反应60分钟合成cDNA。
反应完成后，立即置于70℃10分钟，灭活逆转录酶。
合成的cDNA第一链于-20℃保存备用。
2)外源端粒酶基因cDNA的PCR扩增PCR反应体系(总体积50微升)反应成分 一个反应10×PCR缓冲液 5微升2毫摩尔dNTP Mix5微升引物1(10微摩尔)1微升引物2(10微摩尔)1微升Taq DNA多聚酶 1微升(共5个单位)
模板DNA2微升25豪摩尔MgSO4 2微升去离子水 33微升终体积 50微升PCR扩增反应的条件预变性94℃、120秒钟，然后94℃、30秒钟，退火58℃、45秒钟，延伸72℃、45秒钟，共30个循环，取15微升PCR产物于2％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果。
3)Northern-blotting技术检测RNA电泳a.配制1％琼脂糖甲醛变性胶称取琼脂糖3克，加入30毫升10×MOPS(3-[N-吗啉]-丙磺酸)、255毫升0.1％DEPC-H2O加热至琼脂糖完全熔化后在室温放置冷却至60℃，加入16.2毫升37％甲醛溶液，混匀后制胶。
b.加样及电泳取RNA样品20微克，加20微升RNA上样缓冲液，混匀后65℃水浴变性5分钟，同时将胶放入装有1×MOPS电泳缓冲液的电泳槽中，预电泳10分钟，然后加样，在100伏电压下电泳至样品跑出加样孔后电压调至60伏电泳至溴酚蓝染料迁移至胶下游的3/4处，电泳结束后，用0.25微克/毫升溴乙锭EB染色，将胶移至紫外图像分析仪上进行分析。
c.转膜含甲醛的凝胶须用DEPC水淋洗数次，去除甲醛；切去凝胶上的左上角，作为标记。用纸巾毛细孔虹吸作用，将凝胶上RNA转移到尼龙膜上。转移时间16小时，然后将尼龙膜于80℃真空干燥2小时后，贮存于室温。
d.标记探针取25纳克探针，变性后用随机引物标记试剂盒和[32P]dCTP进行标记，-20℃保存，用之前再次变性处理。
e.杂交和放射自显影1)预杂交和杂交把膜放在含有6×柠檬酸缓冲液(SSC)，5×Denhardt缓冲液，0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)和100微克/毫升变性鲑鱼精DNA的预杂交液中，58℃预杂交1小时。倒出预杂交液，换入含有6×SSC，0.5％SDS和100微克/毫升变性鲑鱼精DNA的杂交液和50微升同位素标记的探针，于58℃杂交16小时。
2)洗膜、放射自显影尼龙膜在1×SSC，0.1％SDS溶液中室温洗膜20分钟；用0.2×SSC，0.1％SDS于68℃洗膜3次，每次20分钟。膜在室温中自然干燥后，用保鲜膜包好，在暗室中用X光片进行放射自显影，于-70`曝光7天后，常规显影、定影。
实施例4本发明采用Western blotting技术检测转导的人骨髓间充质干细胞中hTERT蛋白的表达。结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞有效表达了hTERT蛋白，参见图2C，图中(C)用Western blotting检测hTERT蛋白的表达，其中包括泳道1第95代hTERT-hMSCs细胞的hTERT蛋白和β-actin蛋白的表达，泳道2第275代hTERT-hMSCs细胞的hTERT蛋白和β-actin蛋白的表达，泳道3正常第13代hMSCs细胞的hTERT蛋白和β-actin蛋白的表达。
a.蛋白质样品准备移去单层贴壁生长至90％汇合的骨髓间充质干细胞和转基因骨髓间充质干细胞中的培养液。加入4毫升4℃预冷的PBS缓冲液洗涤细胞3次后，弃去PBS缓冲液并将培养瓶置于冰上；按1毫升细胞裂解液(Roche，NewJersey，USA)加10毫升苯甲基磺酰氟(PMSF)(100毫摩尔/升)，摇匀置于冰上。每瓶细胞加400毫升含PMSF的裂解液，于冰上裂解30分钟后，将细胞碎片和裂解液移至1.5毫升离心管中；于4℃下12,000转/每分钟离心5分钟。将离心后的上清分装转移到0.5毫升的离心管中放于-20℃保存备用。
b.蛋白质含量测定(见表1)制作标准曲线从-20℃取出1毫克/毫升BSA，室温融化后，备用。取18个1.5毫升离心管，3个一组，分别标记为0毫克，2.5毫克，5.0毫克，10.0毫克，20.0毫克，40.0毫克。按下表在各管中加入各种试剂。混匀后，室温放置2分钟。在生物分光光度计上比色分析。
表1蛋白质含量的测定

检测样品蛋白含量取足量的1.5毫升离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1毫升。室温放置30分钟后用于测蛋白。取一管考马斯亮蓝加0.15摩尔/升NaCl溶液100毫升，混匀放置2分钟做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下测空白样品。弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次，再用无菌水洗1次。取一管考马斯亮蓝加95毫升0.15摩尔/升NaCl溶液和5毫升待测蛋白样品，混匀后静置2分钟测样品。
c.SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)安装完凝胶装置后以8％分离胶灌胶，加一层水，等待液封后的胶凝胶凝，倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干；灌制5％的浓缩胶，将梳子插入浓缩胶中，浓缩胶凝固后，拔出梳子；上样前将样品煮5分钟使蛋白变性加入，5×SDS上样缓冲液后，上样50微克蛋白样品；以60伏的电压电泳3-4小时，观察溴酚蓝位置终止电泳，进行转膜。
d.蛋白质的转膜硝酸纤维素膜(Immobilon-NC膜，Millipore，USA)的处理甲醇中浸泡15秒钟，然后灭菌水冲洗2分钟，最后转移到转移缓冲液中平衡5分钟；凝胶的处理用灭菌水冲洗胶，然后浸泡于转移缓冲液中平衡15分钟；转膜组装转移装置，冷却条件下60伏电压转膜2小时；转膜效果检查转膜后用1×丽春红染液染色5分钟，检查膜上的蛋白。将膜晾干备用。
e.免疫反应将膜用Tris盐缓冲液(TBS)从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，封闭1小时；将一抗用Tween-Tris盐缓冲液(TBST)稀释至适当浓度(以1∶20,000溶于TBST)，室温下孵育3-4小时，或4℃下过夜；然后用TBST在室温下脱色摇床上漂洗2次，每次10分钟；再用TBS漂洗10分钟；准备二抗稀释液(以1∶5,000溶于TBST)并与膜接触，室温下孵育2小时后，然后用TBST在室温下脱色摇床上漂洗2次，每次10分钟；再用TBS漂洗1次，持续10分钟，进行化学发光反应。
f.化学发光显色反应抗体反应后的膜转移到TSM溶液(0.1mol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mol/LNaCl，0.01mol/L MgCl2)，5分钟×2；然后加入显色底物5-溴-4-氯-3-吲跺磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)，室温暗处显色；TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTAPH8.0)终止反应。
实施例5本发明采用流式细胞术方法检测转导的人骨髓间充质干细胞的表面标志。结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞同正常人骨髓间充质干细胞的表面标志是一致的。第95代hTERT-hMSCs细胞的表面抗原参见图3，第275代hTERT-hMSCs细胞的表面抗原参见图4，正常第13代hMSCs细胞的表面抗原参见图5。它们的细胞表面抗原都显示CD29(图D)、CD44(图A)、CD105(图B)和CD166(图C)为阳性(+)，CD34(图H)、CD45(图G)、CD117(图E)和HLA-DR(图F)为阴性(-)。
检测流程1、不同代次的hTERT-hMSCs生长到大约60-80％融合时，胰酶消化液(Trysin-EDTA消化液，吉诺，杭州，中国)消化细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞3次；2、收集的细胞重悬于PBS缓冲液中，400目尼龙筛网过滤细胞团块，收集分散良好的单细胞群；3、分别加入各种荧光素标记的单克隆抗体，混匀细胞悬液，于4℃下避光孵育30min；4、用乙二胺四乙酸-小牛血清白蛋白-磷酸缓冲液(EDTA-BSA-PBS，上海生工，上海，中国)洗涤细胞液2次，300×g离心细胞悬液5分钟，洗去未结合的单抗。细胞重悬于EDTA-BSA-PBS缓冲液中；5、用EDTA-BSA-PBS缓冲液重悬细胞群，400目尼龙筛网过滤细胞，调节细胞密度为2×106细胞/毫升，总体积为1毫升，500微升用于流式分析，500微升备用；6、实验设计如下未标记的细胞群(空白对照)，小鼠IgG(同型抗体)，各种细胞群单染色的待测样品(实验组)，FITC-单抗(荧光补偿1)，PE-单抗(荧光补偿2)；7、上样空白对照和小鼠IgG同型抗体调节荧光检测器(FL2)的电压；8、用PE-单抗和FITC-单抗调节FL2的荧光补偿；9、最后上样单染色的各个细胞群，设门圈定细胞群分析流式细胞结果。
实施例6本发明采用Giemsa染色方法[2]分析转导的人骨髓间充质干细胞的细胞核型。结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞同正常人骨髓间充质干细胞的细胞核型是一致的，参见图6，用G-显带分析细胞的核型(A)第95代hTERT-hMSCs细胞的细胞核型，(B)第275代hTERT-hMSCs细胞的细胞核型，(C)正常第13代hMSCs细胞的细胞核型。它们的细胞染色体长度、着丝粒位置、次缢痕、随体的有无、臂比值、着丝粒指数以及相对长度表明hTERT-hMSCs细胞同正常hMSCs细胞的细胞核型是一致的，在转染，传代过程中没有发生转化以及其它污染。
检测流程1.35mm培养皿常规培养48小时(指数生长期)，换新鲜培养液2毫升，加秋水仙素(配制工作液10微克/毫升)至终浓度0.2微克/毫升，轻轻混匀，常规培养4小时。
2.胰酶消化细胞，收集入离心管，生理盐水冲洗培养皿数次，确认所有细胞均收集入管。
3.1000转/每分钟离心10分钟。
4.弃上清液，加0.5毫升低渗液(0.4％氯化钾0.4％柠檬酸钠1∶1配制)滴入离心管，弹匀，再补足1毫升，混匀，37℃水浴低渗5分钟。1000转/每分钟离心10分钟，弃上清液。
5.加入固定液(甲醇∶冰醋酸3∶1)2毫升，1000转/每分钟离心3分钟。
6.弃上清，加固定液4毫升，吹匀，加盖室温固定40分钟。1000转/每分钟离心3分钟。
7.弃上清，加固定液2毫升，吹匀，加盖室温固定20分钟。1000转/每分钟离心3分钟。
8.去上清，留混合液约0.3毫升，打匀，滴片，50-100厘米高度滴下。(玻片按实验室玻璃物品常规冲洗，4℃冰箱水浴待用)9.将玻片放65℃烤箱过夜
10.烤箱中取出玻片，Giemsa染色10分钟。
11.自来水冲洗，自然风干。
实施例7本发明采用细胞传代的方法检测转导的人骨髓间充质干细胞的生命周期，结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞在培养了290代之后仍然有旺盛的生命力。而原代hMSC只能传代25代，参见图7，传导了hTERT的骨髓间充质干细胞的生命周期分析。hTERT-hMSCs培养了290代(矩形框表示)，原代hMSCs培养了25代(圆点表示)。
传代流程1.原代培养的细胞或转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞铺满培养瓶90％底面积后，细胞进行传代培养；2.吸出培养瓶内的培养液，PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，加入Trypsin-EDTA消化液2mL，轻轻前后摇动培养瓶，室温下消化细胞3分钟；3.倒置显微镜下观察细胞形态变化，当细胞由梭形回缩时，加2mL MEM-α完全培养液(Gibco BRL，USA)终止消化反应；4.用吸管轻轻吹打粘贴在底面的细胞，直到所有细胞悬浮在培养液中；5.1,000rpm离心5min收集细胞，重悬于MEM-α完全培养液中；6.计数细胞总数，以1∶3的比例进行接种传代培养，细胞记为P1代；7.细胞长满90％汇合度时，继续以1∶3的比例传代培养，每3d更换等体积的新鲜MEM-α完全培养液，依次记为P2代、P3代、P4代、......。
实施例8本发明采用脂肪诱导液诱导的方法分析转导的人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的潜能。结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞在脂肪诱导液的诱导作用下能够向脂肪细胞分化，参见图8A、8B、8C，是骨髓间充质干细胞永生系向脂肪，软骨，成骨细胞分化的潜能分析。骨髓间充质干细胞永生系第95代(A)和第275代(B)细胞经脂肪诱导液诱导14天后经油红O染色在倒置相差显微镜下可见橙红色脂滴沉着的细胞，对照组未诱导细胞只是细胞核由苏木素染成蓝色(C)。
诱导流程取第25代和第65代的hTERT-hMSCs细胞，消化后制成单细胞悬液，以2×104个/培养皿接种于直径35毫米的培养皿，共计12个。待细胞达到80-90％融合后，其中实验组6皿加入脂肪细胞诱导液(α-MEM培养液，10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素，100克/毫升链霉素，10纳克/毫升胰岛素样生长因子-I(IGF-I)，1微摩尔地塞米松，0.5毫摩尔1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤，100微摩尔吲哚美辛)，对照组6皿用常规培养液。每3-4天换液，3周后油红O染色。
诱导细胞的油红O染色于21天后取实验组、对照组6皿进行油红O染色。弃培养液后，培养皿用PBS清洗3次，室温下10％甲醛固定10分钟，饱和油红O染液孵育2-3小时，60％异丙醇洗去多余染液，蒸馏水清洗2分钟，Mayer氏苏木素液染15-30分钟，1％盐酸(70％乙醇配制)分化2秒钟，蒸馏水清洗几分钟，碱酒精蓝化，中性树胶封固，观察。
实施例9本发明采用成软骨诱导液诱导的方法分析转导的人骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的潜能。结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞在成软骨诱导液的诱导作用下能够向成软骨细胞分化，参见图8D、8E、8F、8G、8H、8I，骨髓间充质干细胞永生系经软骨诱导液诱导28天，阿尔新蓝染色见第95代(D)和第275代(E)细胞胞浆和胞外基质的蓝色颗粒，而对照组未诱导细胞只是细胞核被染成红色(F)。免疫组化法检测II型胶原表达。可见第95代(G)和第275代(H)诱导组的胞浆和胞内基质被染成红色，而对照组(I)只是细胞核被染成蓝色。
诱导流程采用高密度滴状培养法，将传代的细胞悬液以2.5×106/0.5微升培养基的密度转移到15毫升聚丙烯离心管，500转/每分钟离心5分钟.使其聚集于锥形离心管的底部，形成‘小滴’状而进行诱导，各实验管加入成软骨诱导培养液，隔日换液一次，每次换液总量的4/5。
成软骨细胞的阿尔新蓝染色终止诱导后，用PBS(pH 7.2)洗3次，每次1分钟，4％多聚甲醛固定标本，蒸馏水冲洗，阿尔新蓝8GX(Amresco USA)染色30分钟，3％醋酸和蒸馏水冲洗。用核真红液染核4分钟。树脂封片，镜下观察。
免疫组化法检测II型胶原表达按照EnVision二步法[3]免疫组化操作步骤。一抗为鼠抗人II型胶原单克隆杭体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)显色，中性树胶封片。
实施例10本发明采用成骨诱导液诱导的方法分析转导的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能。结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞在成骨诱导液的诱导作用下能够向成骨细胞分化，参见图8J、8K、8L、8M、8N、8O，骨髓间充质干细胞永生系经成骨诱导液诱导28天，Von Kossa染色显示磷酸钙沉积。可见第95代(J)和第275代(K)诱导组的胞浆和胞内基质的磷酸钙沉积部位被染成黑色。而对照组(L)没有被染成黑色。NBT/BCIP法显示碱性磷酸酶活性。可见第95代(M)和第275代(N)诱导组的胞浆和胞内基质被染成深蓝色。而对照组(O)只是细胞核被染成浅蓝色。标尺100微米。
诱导流程将第25代和第65代的hTERT-hMSCs，消化成单细胞悬液，以3×104个/毫升的密度接种于细胞瓶中，共计12瓶，待细胞达到80％-90％融合后，实验组6瓶加入含有0.1微摩尔地塞米松，50微克/毫升抗坏血酸，10毫摩尔β-磷酸甘油培养液(10％FBS)进行诱导，对照组6瓶用常规培养液培养。每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察。
von kossa染色终止诱导后，用PBS(pH 7.2)洗3次，每次1分钟，4％多聚甲醛固定标本，5％硫代硫酸钠孵育30分钟，蒸馏水冲洗，然后用1％硝酸银溶液紫外线下染色30分钟，蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质，继续用5％硫代硫酸钠染色2分钟，蒸馏水漂洗后观察。
碱性磷酸酶染色终止诱导后，用PBS(pH 7.2)洗3次，每次1分钟，在室温下用含7.5％蔗糖的1％多聚甲醛固定10～20分钟，然后用碱性磷酸酶试剂盒染色.根据厂家说明，先用底物缓冲液平衡，在新鲜配制的5-溴-4-氯-3-吲跺磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)染色液中室温避光的条件下染色30分钟以上，水洗.在100倍倒置显微镜下观察分化细胞。
实施例11本发明采用软琼脂克隆形成试验的方法分析转导的人骨髓间充质干细胞的致瘤性。结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞没有致瘤性，参见图9，图中A正常骨髓间充质干细胞第13代培养第1天，B正常骨髓间充质干细胞第13代培养第4天，C正常骨髓间充质干细胞第13代培养第10天，D骨髓间充质干细胞永生系第95代培养第1天，E骨髓间充质干细胞永生系第95代培养第4天，F骨髓间充质干细胞永生系第95代培养第10天，G骨髓间充质干细胞永生系第275代培养第1天，H骨髓间充质干细胞永生系第275代培养第4天，I骨髓间充质干细胞永生系第275代培养第10天，JNIH-3T3细胞培养第1天，KNIH-3T3细胞培养第4天，LNIH-3T3细胞培养第10天。标尺100微米。
软琼脂克隆形成试验流程(1)取对数生长期细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20％胎牛血清的细胞基本培养液调整细胞密度至1×106细胞/升。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2％和0.7％两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
(3)按1∶1比例使1.2％的琼脂糖和2×完全培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3毫升混合液注入直径6厘米平皿中，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
(4)按1∶1比例让0.7％的琼脂糖和2×完全培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2毫升的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2％琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温箱中培养10～14天。
(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。
实施例12本发明采用免疫缺陷小鼠的方法分析转导的人骨髓间充质干细胞的致瘤性。结果显示转导了hTERT基因的骨髓间充质干细胞没有致瘤性，参见图10，图中A侧部皮下注射骨髓间充质干细胞永生系(六个月后照相)，B侧部皮下注射阳性细胞人类子宫颈癌细胞系Hela细胞(六十天后照相)，经免疫缺陷小鼠侧部皮下注射骨髓间充质干细胞永生系，阳性细胞人类子宫颈癌细胞系Hela细胞，在两周后观察肿瘤的形成情况。对照组阳性细胞成瘤率为15/15，而皮下注射骨髓间充质干细胞永生系的小鼠经六个月的观察。没有发现肿瘤的形成。
基本步骤(1)取对数生长期细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，用含血清的培养基中和胰蛋白酶，用无血清培养基离心洗涤2次，将细胞悬浮于PBS中，作活细胞计数，调整细胞浓度均为1×107细胞/毫升，备用。非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠，体重20-22克，4-6周龄，用注射器抽取0.3毫升细胞悬液接种于小鼠侧部，每种细胞各接种15只。观察与测量接种细胞后，每周观察肿瘤的出现情况，以及肿瘤体积的变化，照相。
实例总结(1)本表达载体构建技术有效地构建了能表达hTERT基因的反转录病毒载体pGRN145质粒经Hpa I和Not I限制性内切酶酶切，琼脂凝胶电泳分离提纯得到hTERT cDNA片段，与采用相同限制性内切酶酶切的人反转录病毒载体pLXSN载体相连，构建成高效表达hTERT的表达载体pLXSN-hTERT。
(2)pLXSN-hTERT转导的人骨髓间充质干细胞具有高效表达hTERT的优势经本转导技术转导的人骨髓间充质干细胞具有显著的表达hTERT能力。转导的人骨髓间充质干细胞中的hTERT基因表达为175±85纳克/105个细胞/24小时。
(3)pLXSN-hTERT转导的人骨髓间充质干细胞有效地提高了细胞的生命周期，在脂肪，软骨，成骨细胞诱导液的作用下，转导的人骨髓间充质干细胞能够向脂肪，软骨，成骨细胞方向分化。具有同正常人骨髓间充质干细胞的分化潜能。
本发明涉及的序列<110>浙江大学<120>人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法<160>8<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(25)<223>根据人端粒酶基因序列(GenBank，GI109633030)设计的上游引物序列<400>1ctctccccct tgaacctaat cgttc
<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(20)<223>根据人端粒酶基因序列(GenBank，GI109633030)设计的下游引物序列<400>2aggacacctg gcggaaggag<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(20)<223>根据人β-actin基因序列(GenBank，，GI5016088)设计的上游引物序列<400>3catctcttgc tcgaagtcca<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(25)<223>根据人β-actin基因序列(GenBank，GI5016088)设计的下游引物序列<400>4atcatgtttg agaccttcaa ca
权利要求
1.一种人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法，其特征是通过以下方案实现(1)构建pLXSN-hTERT重组表达载体，将pGRN145质粒用Hpa I和NotI限制性内切酶酶切，经琼脂凝胶电泳分离提纯得到hTERT cDNA片段，并与采用相同限制性内切酶酶切的pLXSN载体相连，构建成pLXSN-hTERT重组表达载体；(2)构建高效表达外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞，依据LipofectAMINE脂质体转导试剂盒指导说明书，通过兼噬性包装细胞系PA317制备pLXSN-hTERT重组表达载体悬浮液后，在1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物辅助下对人骨髓间充质干细胞进行8小时的pLXSN-hTERT表达载体转导，构建高效表达外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞；(3)采用低浓度的潮霉素进行双重筛选转导外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法，其特征是步骤(1)所述的pLXSN载体是采用Hpa I和Not I限制性内切酶酶切，经琼脂凝胶电泳分离提纯得到。
3.根据权利要求1所述的人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法，其特征是步骤(3)所述的潮霉素的浓度选用20微克/毫升和50微克/毫升。
全文摘要
本发明提供一种人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法将pGRN145质粒用Hpa I和Not I限制性内切酶酶切，得到hTERT cDNA片段，并与采用相同限制性内切酶酶切的pLXSN载体相连，构建pLXSN－hTERT重组表达载体；用LipofectAMINE脂质体转导试剂盒通过兼噬性包装细胞系PA317制备pLXSN－hTERT重组表达载体悬浮液后，对人骨髓间充质干细胞进行转导，构建高效表达外源hTERT基因的人骨髓间充质干细胞；用低浓度的潮霉素进行双重筛选人骨髓间充质干细胞。本发明对人骨髓间充质干细胞转导人端粒酶基因，提高细胞中这种蛋白的表达水平，达到提高骨髓间充质干细胞的生命周期的目的。
文档编号C12N15/52GK101063150SQ200710068218
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者王金福, 黄国平 申请人:浙江大学