专利名称：生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建和应用方法
技术领域：
本发明涉及生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建和应用方法。
背景技术：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)广泛存在于生物体中，是合成血红素、叶绿素、维生素B12等四吡咯化合物的共同前体。ALA作为一种光动力学剂(photodynamic agent，PDT)，在农用化学品和医学领域具有广泛的用途。在农业领域，ALA具有除草、杀虫、增加植物抗逆性和促进植物生长等多种功能，并且易降解无残留、对人畜无毒性，成为极具发展前途的无公害绿色农用化学品。在医学领域，作为新一代光动力学药剂其具有毒性小，选择性高等显著优点，被用来治疗皮肤癌、膀胱癌、结肠癌和胰腺癌等多种癌症，在光化疗领域正逐步展现其巨大的应用性。基于ALA的功能和广阔的应用前景，其合成研究已经引起广泛的重视。
目前ALA的生产较多采用化学合成法，其步骤繁琐、副产物多且产率低；而生物诱变法生产ALA，主要是优化类球红细菌突变株，所报道ALA的最高产量为27mmol/L，但其培养周期长，成本较高。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法。
本发明的另一个目的是应用上述构建的工程菌实现一种工艺相对简单，产量高，对环境友好的生产5-氨基乙酰丙酸的方法。
本发明的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，是含有放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coli Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.1938。
生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，其步骤如下1)从保藏编号为CGMCC No.1332的工程菌中获得重组子pET28a-A.R-hemA，所说的CGMCC No.1332工程菌的中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coliBL21(DE3)-pET28a-A.R-hemA；
2)将重组子pET28a-A.R-hemA转化至宿主菌Rosetta(DE3)(商业化菌株，从德国Novagen公司购买)中，得到工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，其保藏编号为CGMCC No.1938。
本发明的应用保藏编号为CGMCC No.1938工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法，包括以下步骤1)用接种针从保藏编号为CGMCC No.1938工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30-40μg/ml卡那霉素和30-40μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，置于37℃烘箱中过夜培养；2)将平板上的单克隆接种于含30-50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为200-220rmp，在37℃培养7-10h得到一级种子；3)取2ml-4ml一级种子接种于含100-150ml发酵培养基的500ml的摇瓶中培养3-4h，得到二级种子；4)将100-150ml二级种子接种于含8-10L发酵培养基的15L发酵罐中进行发酵培养，使罐上的初始菌液密度OD600为0.08-0.15，发酵罐转速为400-500rpm，空气流量为3-4.5L/min，起始培养温度为37℃，2h后降至27-29℃，再用0.050.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导；5)诱导培养4-8h后流加补料培养基，在菌体密度OD600达到7-10时，分批补加葡萄糖作为5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂；6)发酵培养初始pH采用10％-20％体积分数的稀硫酸控制在5.8-6.0；诱导培养4-8h通过流加补料培养基控制pH为6.1-6.3。
本发明生产5-氨基乙酰丙酸中，所说的初始发酵培养基是由质量体积比分别为1％-2％蛋白胨、0.5％-1％酵母粉、0.3％-0.6％琥珀酸、0.2％-0.4％甘氨酸和0.1％-0.5％葡萄糖组成，其pH值为6.0-6.3。所说的补料培养基中含有50-70g琥珀酸和30-50g甘氨酸，体积为800-1000ml。所说的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂为4-6g/L D-葡萄糖。
本发明工艺简单、可控性高、成本低、发酵过程对环境友好，所得的胞外ALA产量高，具有广阔的工业化前景。
图1是工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA诱导表达示意图。
图2胞外ALA浓度及菌体密度OD600与发酵时间的关系曲线。
具体实施例方式
以下结合实施例进一步说明本发明实施例1获得的5-氨基乙酰丙酸工程菌，其构建包括以下步骤1.重组质粒pET28a-A.R-hemA的提取1)将保藏编号为CGMCC No.1332的工程菌接种到液体培养基中，37℃振荡培养12hr，到细菌对数生长期即可收获；2)取3ml细菌培养液(分2次，每次1.5ml)于Eppendorf管中，13,000rpm离心30s，弃上清液(尽可能完全)；3)加入100ul冰预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L TrisCl(pH8.0)；10mmol/LEDTA(pH8.0)，可成批配制，蒸汽灭菌15min，贮存于4℃)，剧烈振荡使细胞完全重悬，室温下静置5～10min；4)加入200ul新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH；1％SDS)，快速颠倒4次，轻轻混合以混匀内容物，冰浴5min；5)加入150ul冰预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾60ml；冰乙酸11.5ml；水28.5ml；所配成的溶液终浓度钾离子是3mol/L，乙酸根是5mol/L)，温和振荡10秒钟使溶液III均匀地分散在细菌裂解物中，冰浴5～10min；6)13,000rpm离心5～10min，将上清液移入另一离心管中；7)加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25/24/1)，振荡混匀，13,000rpm离心5min，上清移入另一干净离心管；8)先加入1/10体积3M NaAc，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，颠倒混合，-20℃冰箱内静置10分钟，沉淀DNA；9)13,000r/min离心5min；10)小心倒弃上清，将离心管倒置于滤纸上将剩余液体滴尽；11)用1ml70％乙醇洗涤DNA沉淀一次，13,000r/min离心5min获得DNA沉淀；去上清，使液体流尽，在空气中使沉淀干燥10分钟；12)将沉淀溶解于50ul TE缓冲液(含RNase A 20ug/ml)，55℃下消化15min，即可获得重组质粒pET28a-A.R-hemA；储存于-20℃冰箱内备用。
2.将获得的重组质粒pET28a-A.R-hemA转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态即可获得工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，其用IPTG诱导过量表达ALA合成酶如图1所示。
实施例2用工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法，包括以下步骤
1.用接种针从保藏编号为CGMCC No.1938工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取少量菌液，在含30μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线，于37℃烘箱中过夜培养；2.挑取单克隆接种于含50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为200rmp，在37℃培养8h，得到一级种子；3.取2ml一级种子接种于含100ml发酵培养基的500ml的摇瓶中，在37℃，200rpm条件下培养3h，得到二级种子。其中初始发酵培养基是由质量体积比分别为1％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.3％琥珀酸、0.2％甘氨酸和0.2％葡萄糖组成，用氢氧化钠调节pH值为5.9；4.将100ml二级种子接种于含9L上述发酵培养基的15L发酵罐中，使罐上的初始菌液密度OD600近似为0.1，发酵罐转速为400rmp，空气流量为3L/min，起始培养温度为37℃，2h后降至28℃，用0.05mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导；5.诱导培养4h流加含有63g琥珀酸和36g甘氨酸，体积为850ml的补料培养基，用菌体的密度监测菌体生长情况，当菌体密度OD600达到7时，开始每隔3h添加4g/L D-葡萄糖作为5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂，总共添加3次葡萄糖。
6.发酵培养初始pH采用10％-20％体积分数的稀硫酸控制在5.9；诱导培养4h通过流加补料培养基控制pH为6.2。采用Mauzerall和Granick的分析方法(参照Mauzerall D，Granick S.J.Bio.Chem.，1956，219435-442)测定ALA的浓度。由图2可见胞外ALA的浓度22h时即可达到6.5g/L。
权利要求
1.生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于此菌是含有放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coli Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.1938。
2.根据权利要求1所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，其步骤如下1)从保藏编号为CGMCC No.1332的工程菌中获得重组子pET28a-A.R-hemA，所说的CGMCC No.1332工程菌的中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coliBL21(DE3)-pET28a-A.R-hemA；2)将重组子pET28a-A.R-hemA转化至宿主菌Rosetta(DE3)中，得到工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA，其保藏编号为CGMCC No.1938。
3.用权利要求1所述的工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征是包括以下步骤1)用接种针从保藏编号为CGMCC No.1938工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30-40μg/ml卡那霉素和30-40μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，置于37℃烘箱中过夜培养；2)将平板上的单克隆接种于含30-50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为200-220rmp，在37℃培养7-10h得到一级种子；3)取2ml-4ml一级种子接种于含100-150ml发酵培养基的500ml的摇瓶中培养3-4h，得到二级种子；4)将100-150ml二级种子接种于含8-10L发酵培养基的15L发酵罐中进行发酵培养，使罐上的初始菌液密度OD600为0.08-0.15，发酵罐转速为400-500rpm，空气流量为3-4.5L/min，起始培养温度为37℃，2h后降至27-29℃，再用0.05-0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导；5)诱导培养4-8h后流加补料培养基，在菌体密度OD600达到7-10时，分批补加葡萄糖作为5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂；6)发酵培养初始pH采用10％-20％体积分数的稀硫酸控制在5.8-6.0；诱导培养4-8h通过流加补料培养基控制pH为6.1-6.3。
4.根据权利要求3所述的生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所说的初始发酵培养基是由质量体积比分别为1％-2％蛋白胨、0.5％-1％酵母粉、0.3％-0.6％琥珀酸、0.2％-0.4％甘氨酸和0.1％-0.5％葡萄糖组成，其pH值为6.0-6.3。
5.根据权利要求3所述的生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所说的补料培养基中含有50-70g琥珀酸和30-50g甘氨酸，体积为800-1000ml。
6.根据权利要求3所述的生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所说的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂为4-6g/L D-葡萄糖。
全文摘要
本发明涉及生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建和应用方法。该菌种是含有放射形土壤杆菌的5－氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，保藏编号为CGMCC No.1938。用上述工程菌生产5－氨基乙酰丙酸的方法，步骤包括用LB培养基平板活化获得上述工程菌的单克隆，然后接种于摇瓶中培养，得到一级种子；再取一级种子接种于摇瓶中培养，得到二级种子；将二级种子接种于发酵罐中进行培养，用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷降温诱导，继续培养后进行补料培养。本发明获得的工程菌有较高ALA合成酶表达，生产工艺简单、成本低，所得胞外ALA产量高，具有良好的工业化前景。
文档编号C12N15/52GK101063105SQ200710068170
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月20日 优先权日2007年4月20日
发明者林建平, 傅维琦, 岑沛霖 申请人:浙江大学