专利名称：重组金黄色葡萄球菌肠毒素m及制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程，涉及一种重组金黄色葡萄球菌肠毒素M(Staphylococcal Enterotoxin M，SEM)的制备以及在制备用于刺激淋巴细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。
背景技术：
1989年，超抗原的概念由瑞典科学家White提出，它是一类由细菌、病毒、寄生虫产生的对淋巴细胞有强大刺激功能的蛋白质，由于其对T淋巴细胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍，故称为超抗原。金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin，SE)是目前全世界范围内广泛研究的一种超抗原。其中研究最为深入的主要包括A型金黄色葡萄球菌肠毒素(StaphylococcalEnterotoxin A，SEA)、B型金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal EnterotoxinB，SEB)、C2型金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin C2，SEC2)等。
与普通抗原不同，肠毒素超抗原首先以完整分子结合于抗原提呈细胞(APC)表面的II类主要组织相容性复合体(MHC)的抗原结合沟槽外侧，而后与T细胞表面的抗原受体分子(TCR)的Vβ区结合，形成SE-MHC-TCR三分子复合物后大量激活T细胞。由此激活的T细胞可直接杀伤表达MHC-II类分子的肿瘤细胞，而对不表达MHC-II类分子的肿瘤细胞也可产生间接的杀伤效应。同时，被SE激活的CD4+T细胞可分泌大量细胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用。IL-2等因子亦可激活NK细胞，使其发挥自然杀伤作用，IFN-γ、TNF-α等细胞因子还可促进肿瘤细胞的MHC-II类分子的表达，增强T细胞的识别。因此，经SE激活的T细胞能对肿瘤细胞和肿瘤组织产生高效的直接或者间接的杀伤作用。如Perabo等人证实经SEB刺激的外周血单核细胞(PBMC)能高效诱导人膀胱癌细胞株RT112细胞和RT4细胞调亡。Hedlund等人进行的体内实验表明，SEA激活T细胞使之增殖作用在每只小鼠0.1-100μg范围内呈剂量依赖关系，注射后1天出现最大效应，增殖效应维持4天。为提高在肿瘤治疗中的靶向性和特异性，人们针对不同肿瘤细胞表面特异性抗原，制备了多种相关抗原的单抗—超抗原融合蛋白或将单抗与超抗原偶联，大大增强了所激活的T细胞对肿瘤细胞和肿瘤组织的靶向性，使其能特异地杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。此外，人们还利用肿瘤细胞表面过度表达的受体的配体制备了配体—超抗原融合蛋白，有效地提高了由此激活的T细胞对肿瘤组织的靶向性。另外，将超抗原基因转染肿瘤细胞，将超抗原修饰的肿瘤细胞作为瘤苗继而免疫动物，亦获得了令人满意的抵抗肿瘤细胞再次攻击的效果。
在我国，以金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)为主要有效成分的金黄色葡萄球菌滤液制剂作为肿瘤防化疗治疗的辅助药物应用于临床已有近十个年头，大量的临床数据证明使用后肿瘤患者的免疫能力获得了显著的提高，患者的食欲、睡眠以及全身状况均得到了明显好转。如罗锋等对35例浅表转移性肿瘤应用金葡菌滤液制剂进行局部治疗，治疗一个月后总有效率达82.9％。汤炜等通过对早期口腔癌采用局部金葡菌滤液制剂治疗及对晚期口腔癌应用金葡菌滤液制剂联合化疗，发现其可使大量淋巴细胞及纤维组织聚集在癌巢附近，并能观察到肿瘤细胞显著减少甚至部分病例肿瘤细胞消失。吴洁等将金葡菌滤液制剂作为化疗的辅助药物应用于食管癌治疗，结果显示与对照组相比，可明显升高白细胞，减轻胃肠道反应。
尽管目前以SEC为主要有效成分的金葡菌滤液制剂已取得广泛的应用，但由于制剂中存在着大量的蛋白质以及多肽类杂质，而主要有效成分肠毒素相对含量极低，使得一部分肿瘤患者在该制剂临床使用过程中出现了一定程度的相似副反应。如，李洪等报道了分别有28％和24％的肿瘤患者在使用金葡菌滤液制剂并联合卡铂治疗恶性胸腔积液过程中出现了发热和局部疼痛等副反应。刘秀英等在对鼻咽癌患者使用金葡菌滤液制剂联合放疗治疗的过程中观察到的主要副作用为中、低度发热，约占治疗组患者总数的5％。黎佳全等也报导了患者在应用金葡菌滤液制剂联合顺铂治疗恶性胸水过程中出现的主要副作用为发热，约占治疗组患者总数的65.5％。虽然这些副反应基本是暂时性的，症状可以自行缓解或者通过对症治疗进行消除，但仍然对肿瘤患者的治疗和康复造成了不良的影响。因此，对于目前金葡菌滤液制剂在临床应用中遇到的问题，需要制备高纯度的肠毒素并建立严格可控的质量标准逐步克服解决，以求减少在使用过程中产生的毒副作用并增强其肿瘤抑制疗效。目前，已经有人利用基因工程手段制备金黄色葡萄球菌肠毒素超抗原，如姜永强等将SEA、SEB、SEC1基因片段克隆至pBV220，在大肠杆菌中经热激诱导获得表达，但这些方法中纯化步骤均采用了离子交换的方法，存在吸附选择特异性差等弱点。徐明恺等将SEC2基因克隆至pET-28a中表达，但表达的重组产物比天然蛋白增加36个氨基酸，因此抗原决定簇及产物活性改变的可能性均较大。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种利用基因工程手段制备获得的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M(Staphylococcal Enterotoxin M，SEM)，该蛋白属于一种超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本发明利用其超抗原活性应用于体外促脾淋巴细胞增殖和以及体外抑制肿瘤细胞生长，并与金黄色葡萄球菌肠毒素C(Staphylococcal Enterotoxin C，SEC)进行超抗原活性比较。
本发明的另一个目的是提供重组金黄色葡萄球菌肠毒素M(SEM)的制备方法，本发明构建一种可用于表达金黄色葡萄球菌肠毒素M的重组质粒，该质粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列经过重组构建而成，质粒见说明书附图4。
本发明方法具体通过以下步骤实现(1)设计一对分别带有BamH I和Xho I酶切位点的上下游引物SEQ IDNO.45’-cag gat cct ttt gct att cgc aaa atc ata tcg ca-3′(上游引物，划线部分为BamH I酶切位点)，SEQ ID NO.55’-gcc tcg agt caa ctt tcg tcc tta taa gat att tct ac-3’(下游引物，划线部分为Xho I酶切位点)，以金黄色葡萄球菌(FRI 1230)基因组为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得编码SEM蛋白的基因片段，利用T-A克隆将其连入至pGEM-T质粒载体上的多克隆位点，成功构建pGEM-T-SEM重组质粒。通过测序证实获得的编码SEM蛋白的基因片段序列(见SEQ ID NO.2)与SignalP 3.0 Server预测的SEM成熟肽蛋白质的基因序列(见SEQ ID NO.3)相比，仅在N端多出2个氨基酸残基。
(2)将上述步骤中得到的含内切酶位点的编码SEM蛋白成熟肽的基因片段用相应内切酶切割后与用相同内切酶处理后的pGEX-4T-1质粒相连接，成功构建表达质粒pGEX-4T-1-SEM。
(3)将pGEX-4T-1-SEM表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达带谷胱甘肽转移酶(GST)标签的GST-SEM融合蛋白。收获菌体并破碎后离心并收集上清。将菌体上清液与能特异结合GST的亲和填料充分混合，用洗脱液洗脱GST-SEM融合蛋白并收集，将收集到的融合蛋白与凝血酶在合适条件下充分反应，反应后的混合物再次与能特异结合GST的亲和填料充分混合，分离并收集经过纯化的SEM蛋白，取样电泳检测。能特征性地结合GST的亲和填料，优选偶联有谷胱甘肽的Glutathione Sepharose 4 Fast Flow。经检测获得电泳纯的纯化产物后，将该纯化产物经过脱盐、冷冻干燥即得重组SEM冻干粉。
初始获得的蛋白为带有GST(谷胱甘肽转移酶)标签的融合蛋白GST-SEM，先利用亲和填料纯化该融合蛋白，进一步去除该标签后再次利用亲和填料纯化重组SEM蛋白。
初始获得的GST-SEM融合蛋白占细菌总蛋白含量的15-25％。
(4)获得电泳纯的SEM蛋白后，采用单核细胞直接细胞毒性测定法(MTT法)，以有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)为阳性对照，建立合适的体外模型以观察重组SEM蛋白对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以及受SEM刺激增殖的小鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。应用此模型同时观察金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)的超抗原活性并与重组SEM蛋白的活性进行比较，结果显示重组SEM蛋白具有典型的超抗原活性，并与SEC的作用相当。
本发明的又一个目的是提供重组金黄色葡萄球菌肠毒素O在制备刺激淋巴细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。
本发明方法的特点是(1)提供了一种高纯度的重组SEM蛋白，利用体外小鼠脾淋巴细胞增殖实验和肿瘤细胞抑制实验证实该重组蛋白具有典型的超抗原活性，且较SEC更强。该重组蛋白在未被凝血酶切割前带有GST标签，适合亲和纯化，经凝血酶处理后的该蛋白质氨基酸序列及相应的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，与相应的天然蛋白相比，该重组蛋白在N端增加了2个氨基酸残基；(2)提供了一种含有SEM基因的重组表达质粒pGEX-4T-1-SEM，该质粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2所示核苷酸融合构建而成，可转化入合适的表达宿主，它含有强启动子，在诱导剂诱导下可高效表达带有GST标签的GST-SEM融合蛋白；(3)使用含有由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸构建而成的表达质粒的工程菌，表达产物带有GST标签，并使用含有能特异结合GST的亲和填料来纯化该产物；(4)提供了一种工程菌，该菌株含有表达质粒pGEX-4T-1-SEM，在合适的诱导剂作用下可高效表达带有GST标签的GST-SEM融合蛋白。(5)适用于高效制备具有超抗原活性的高纯度肠毒素以及超抗原制剂的开发。
本发明方法对重组SEM进行了高效表达，表达强度占全菌蛋白的15-25％左右，且为可溶性表达，便于后续分离纯化。融合蛋白经凝血酶高效切割后，所得到的重组蛋白与相应的天然蛋白相比，只在N端多出2个氨基酸。本发明方法采用亲和层析对目的蛋白进行纯化，具有步骤简单，纯化速度快的特点，相比从金葡菌培养滤液中分离提取以及利用离子交换层析或分子筛层析等方法能获得高纯度的重组SEM蛋白。体外应用该蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长，结果证明该目的蛋白具有典型的超抗原活性。鉴于在临床获得应用的金葡菌滤液制剂的主要有效成分为SEC，本发明通过比较证实重组SEM蛋白的超抗原活性与SEC相当，因此该重组SEM蛋白有望开发成为一种新的超抗原制剂用于肿瘤患者的临床康复和治疗。
在本说明书上下文中，除非特别指明，否则所引用的任何技术术语具有本领域普通技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明的实验方法是按照常规实验方法进行或按照供应商所建议的操作说明进行。
图1为PCR扩增所得含酶切位点的编码SEM蛋白成熟肽基因琼脂糖凝胶电泳图。
图2为PCR扩增后所测编码SEM基因序列测序结果图。
图3为重组pGEX-4T-1-SEM质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图。
图4为重组SEM表达质粒pGEX-4T-1-SEM示意图。
图5为重组SEM在BL21(DE3)大肠杆菌中诱导表达电泳图。
图6为GST-SEM纯化电泳图。
图7为重组SEM纯化电泳图。
图8为重组SEM与SEC对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用(48h)。
图9为重组SEM与SEC对耐阿霉素慢性髓原性白血病细胞(K562-AD)的抑制作用(48h)。
具体实施例方式
以下实施例提供了实现本发明的优选实施方案。本领域技术人员可以理解的是，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。下面的实施例中所公开的技术表示由本发明人所发现的技术，这些技术能有效实施本发明。不过，本领域技术人员可以理解，在不超出本发明的构思的前提下，可以对这些具体实施方案进行多种改变，仍然能获得相似的结果。
实施例1SEM的基因克隆和pGEM-T-SEM重组质粒的构建编码含酶切位点的SEM蛋白的成熟肽基因序列的PCR扩增设计如下一对引物序列
SEQ ID NO.4(上游引物，划线部分为BamH I酶切位点)5’-cag gat cct tttgct att cgc aaa atc ata tcg ca-3′SEQ ID NO.5(下游引物，划线部分为Xho I酶切位点)5’-_gcc tcg agt caa ctttcg tcc tta taa gat att tct ac-3’以金黄色葡萄球菌(FRI 1230)基因组模板，按照以下条件进行PCR扩增，扩增获得703bp的DNA片段，PCR结果凝胶电泳图参见图1，其中泳道1核酸标准对照(Marker)；泳道2含酶切位点的编码SEM蛋白成熟肽基因PCR产物。
PCR体系H2O 60μLBuffer(10×) 10μLMg2+(25mmol/L) 8μLBSA(5mg/mL) 10μLPrimer-up(25μmol/L) 4μLPrimer-down(25μmol/L)4μLdNTP(20mmol/L)2μLTemplate(Genome of FRI 1230，10ng/μL)1μLTaq Polymerase(5U/μL)1μLPCR程序1、95℃预变性3min2、95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min3、依步骤2循环34次4、72℃延伸10min含编码SEM蛋白的成熟肽基因序列的pGEM-T-SEM重组质粒的构建将PCR扩增所得的SEM成熟肽基因克隆入pGEM-T质粒，转化至大肠杆菌DH5α中扩增。提取该重组质粒，经酶切鉴定后送样测序，结果显示获得的编码SEM蛋白的成熟肽基因序列与SignalP 3.0 Server预测的蛋白质的基因序列相比，仅在N端增加了2个氨基酸。测序结果参见图2。
含编码SEM成熟肽基因的pGEX-4T-1-SEM重组表达质粒的构建用BamH I和Xho I分别酶切上述步骤中得到的含内切酶位点的编码SEM蛋白成熟肽的基因片段和pGEX-4T-1质粒。分别回收酶切后的含酶切位点的编码SEM成熟肽的基因片段以及pGEX-4T-1质粒酶切产物的大片段，并将两者连接，构建了表达质粒pGEX-4T-1-SEM。将该重组质粒转入大肠杆菌DH5α扩增并提取质粒，经过BamH I和Xho I酶切鉴定，结果表明目的基因片段已插入载体质粒，电泳结果参见图3，其中泳道1核酸Marker；泳道2重组pGEX-4T-1-SEM质粒；泳道3重组pGEX-4T-1-SEM质粒BamH I与Xho I双酶切产物。pGEX-4T-1-SEM质粒示意图参见图4，标示的“SEM”即为编码SEN蛋白基因序列插入位置。目的基因在pGEX-4T-1-SEM质粒上的详细序列见SEQ IDNO.1。
实施例2重组SEM的表达SEM表达菌株的构建从含有pGEX-4T-1-SEM重组质粒的大肠杆菌DH5α中提取该质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，通过抗生素抗性筛选阳性克隆，获得可以大量表达GST-SEM融合蛋白的工程菌菌株。
融合蛋白GST-SEM的表达将上述工程菌单菌落接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养6h，作为种子液。将该种子液以1-5％的接种量接种于含氨苄青霉素的2×YT培养基中，37℃振荡培养4h，按0.01％-0.1％的体积比加入0.1mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达5h。
实施例3重组SEM的纯化样品的预处理经IPTG诱导的菌液4℃10000rpm离心，弃上清收集沉淀。沉淀用原菌液体积的1/10量的磷酸盐缓冲溶液(PBS)重悬，将混悬液置FRENCH细胞破碎仪中，于700psi下破碎，悬液呈粘稠状。后用超声破碎仪继续超声破碎2min使核酸降解，菌体裂解液粘度降低。超声后向菌体裂解液中加入20％的Triton-100至终浓度为1％，充分混匀，冰浴静置30min。静置完毕后将菌体裂解液4℃12000rpm离心30min，取上清液低温保存待用。上清液取样进行SDS-PAGE检测，在分子量50kD处有较浓的条带，此即为诱导表达的GST-SEM融合蛋白。Quantity One图像分析软件显示该条带浓度大约占总蛋白浓度的15-25％。经诱导后菌体裂解液蛋白电泳结果参见图5，其中泳道1蛋白质Marker；泳道2未经诱导表达的菌体总蛋白；泳道3经过诱导表达的菌体总蛋白。
GST-SEM融合蛋白的纯化取1mL经过预处理的蛋白溶液，经0.45μm膜过滤后加入至预平衡的1mL Glutathione Sepharose 4 Fast Flow柱中，轻轻混匀，结合30min后流尽液体。用PBS冲洗柱子3次，每次10mL，流尽液体。向柱中加入0.5mL还原型谷胱甘肽洗脱液，轻轻混匀。反应20min后收集溶液，用紫外分光光度计测蛋白浓度。重复上步的洗脱步骤直至蛋白浓度低于0.1mg/mL停止收集，结果显示各洗脱液组分中蛋白浓度呈正态分布。将各收集组分用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检验纯度与浓度，结果显示纯化得到的GST-SEM融合蛋白为单一条带，分子量约53kD，电泳结果参见图6。
融合蛋白的切割将上述纯化得到的GST-SEM融合蛋白收集组分合并，经过脱盐柱或者用10000截留分子量的透析带透析，将溶液置换成含1.5mol/LNaCl、2.5mmol/LCaCl2的凝血酶缓冲溶液并同时去除溶液中的谷胱甘肽。每1mL蛋白溶液加入20mg/mL凝血酶2μL，25℃反应24h，取样电泳，检测酶切反应程度，电泳结果参见图6，其中泳道1凝血酶(thrombin)和重组SEM蛋白；泳道2Thrombin切割后的GST-SEM蛋白；泳道3纯化后的GST-SEM融合蛋白；泳道4蛋白质Marker。
重组SEM的纯化将反应后的蛋白溶液加入至预平衡的GlutahioneSepharose 4 Fast Flow柱子中，轻轻混匀，静置20min后使液体流尽并收集。SDS-PAGE检测溶液中蛋白纯度与浓度。结果显示融合蛋白的GST标签已去除，在26KD分子量附近有单一条带，即为纯化的SEM蛋白，将纯化后的蛋白溶液脱盐后冻干保存。SEM纯化蛋白电泳结果参见图7，其中泳道1蛋白质Marker；泳道2Thrombin切割后纯化的重组SEM蛋白。
实施例4MTT法测定重组SEM对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用以ICR小鼠的脾淋巴细胞为靶细胞，将其悬浮于含10％小牛血清的RPMI1640培养液中，调整细胞浓度为5×106个/mL，每孔100μL铺于96孔板中，设调零孔(仅含培养基)、空白孔(脾淋巴细胞+培养基)、阳性对照孔(培养基+脾淋巴细胞+Con A)和实验孔(培养基+脾淋巴细胞+三个不同浓度梯度的SEM)，每种设四个复孔。其中，ConA终浓度为10μg/mL，SEM终浓度分别为1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL。于铺板后44h在待测孔中加入10μL/孔的MTT溶液，小心吹打混匀后，培养箱中继续培养4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的二甲基亚砜(DMSO)，吹打助溶后培养箱中放置10min，酶标仪双波长法(570nm为测定波长，630nm为参考波长)测定各孔OD570nm-OD630nm值，计算淋巴细胞增殖指数(供试品组平均吸光度值/空白对照组平均吸光度值)(增殖指数≥1.5认为结果呈阳性)，作图分析作用肠毒素对淋巴细胞的增殖作用，并用student t检验做统计分析。
与阴性对照组相比，在阳性对照Con A和1μg·mL-1SEM作用48h后，小鼠脾淋巴细胞均有极显著增加(P＜0.001)；0.1μg·mL-1rSEM作用48h后，小鼠脾淋巴细胞有非常显著的增加(P＜0.01)；0.01μg·mL-1rSEM作用48h后，小鼠脾淋巴细胞有显著增加(P＜0.05)，同时随着作用蛋白浓度的增加作用效果也更加显著，参见图8(与空白对照组相比***P＜0.001；**P＜0.01；*P＜0.05)。按相同实验方案检测SEC对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，经比较，在实验浓度范围内，重组SEM对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用较SEC更强。
实施例5MTT法测定重组肠毒素SEM的体外抑瘤活性设调零孔(仅含培养基)、肿瘤细胞对照孔(培养基+肿瘤细胞)、淋巴细胞本底释放孔[含空白孔(培养基+脾淋巴细胞)、阳性对照孔(培养基+脾淋巴细胞+ConA)和实验孔(培养基+脾淋巴细胞+四个不同浓度梯度的SEM)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培养基+脾淋巴细胞+肿瘤细胞)、阳性对照孔(培养基+脾淋巴细胞+肿瘤细胞+Con A)和实验孔(培养基+脾淋巴细胞+肿瘤细胞+四个不同浓度梯度的SEM)]，每种设三个复孔。其中，Con A终浓度为10μg/mL，SEM终浓度分别为1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL，本底释放孔中5×106个/mL脾淋巴细胞以100μL/孔加入，肿瘤作用孔中5×106个/mL脾淋巴细胞和2.5×105个/mL耐阿霉素慢性髓原性白血病细胞(K562-AD)的混合悬液以100μL/孔加入到实验孔中，最后按用10％FCS RPMI 1640培养基稀释药物至要求浓度，50μL/孔加入各孔，并小心吹打混匀。
铺板后44h在待测孔中加入15μL/孔的MTT溶液，小心吹打混匀后，培养箱中继续培养4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的DMSO，吹打助溶后培养箱中放置10min，酶标仪双波长法(570nm为测定波长，630nm为参考波长)测定各孔OD570nm-OD630nm值，仅含培养基的调零孔调零。按下式计算抑瘤率抑瘤率(％)＝100-[(抑瘤作用孔-淋巴细胞本底释放孔)/肿瘤细胞对照孔]×100，作图分析肠毒素对肿瘤细胞的抑制作用，并用student t检验做统计分析。
MTT法测定SEM体外抑瘤活性实验，SEM以K562-AD作靶细胞，与抑瘤阴性对照孔相比，在阳性对照Con A和0.01～1μg/mL的SEM作用48h后抑瘤率均有极显著的增高(P＜0.001)；并且随着SEM浓度的增加作用效果也更加显著，参见图9(与空白对照组相比***P＜0.001)。按相同实验方案检测SEC对K562-AD细胞的抑制作用，经比较，在实验浓度范围内，重组SEM对K562-AD细胞的抑制作用与SEC相当。
本发明涉及的序列<110>浙江大学<120>重组金黄色葡萄球菌肠毒素M的制备及应用<160>5<210>1<211>690<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(690)<223>克隆所得含部分凝血酶酶切位点序列的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M<440>1gga tcc ttt tgc tat tcg caa aat cat atc gca acc gct gat gtc45Gly Ser Phe Cys Tyr Ser Gln Asn His Ile Ala Thr Ala Asp Val1 5 10 15gga gtt ttg aat ctt agg aac tat tat ggt agc tat cca att gaa90Gly Val Leu Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Tyr Pro Ile Glu16 20 25 30gac cac caa agt att aat cct gaa aat aat cat ctt tcg cat caa135Asp His Gln Ser Ile Asn Pro Glu Asn Asn His Leu Ser His Gln31 35 40 45tta gtt ttt tct atg gat aat tcg aca gta aca gct gaa ttt aag180Leu Val Phe Ser Met Asp Asn Ser Thr Val Thr Ala Glu Phe Lys46 50 55 60
aac gtt gat gat gta aag aaa ttc aaa aat cat gct gta gat gta225Asn Val Asp Asp Val Lys Lys Phe Lys Asn His Ala Val Asp Val61 65 70 75tat ggt cta agt tat agt gga tat tgt ttg aaa aac aaa tat ata270Tyr Gly Leu Ser Tyr Ser Gly Tyr Cys Leu Lys Asn Lys Tyr Ile76 80 85 90tac ggt gga gtt aca tta gca ggt gat tat tta gag aaa tct aga315Tyr Gly Gly Val Thr Leu Ala Gly Asp Tyr Leu Glu Lys Ser Arg91 95 100105cgt att cct att aat ctt tgg gtt aat gga gaa cat caa act ata360Arg Ile Pro Ile Asn Leu Trp Val Asn Gly Glu His Gln Thr Ile106 110 115120tct act gac aaa gta tca act aat aaa aag tta gta aca gct caa405Ser Thr Asp Lys Val Ser Thr Asn Lys Lys Leu Val Thr Ala Gln121 125 130135gaa att gat act aaa tta aga aga tat cta caa gaa gaa tat aat450Glu Ile Asp Thr Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Glu Tyr Asn136 140 145150att tat ggc ttt aat gat aca aat aaa gga aga aat tat ggt aat495Ile Tyr Gly Phe Asn Asp Thr Asn Lys Gly Arg Asn Tyr Gly Asn151 155 160165aag tca aaa ttt agt tct gga ttt aat gca gga aaa ata tta ttt540Lys Ser Lys Phe Ser Ser Gly Phe Asn Ala Gly Lys Ile Leu Phe166 170 175180
cat ttg aat gat ggt tca tca ttt tct tat gac tta ttt gat act585His Leu Asn Asp Gly Ser Ser Phe Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Thr181 185 190195gga aca gga caa gct gaa agt ttc tta aaa ata tat aat gac aac630Gly Thr Gly Gln Ala Glu Ser Phe Leu Lys Ile Tyr Asn Asp Asn196 200 205210aaa act gtc gaa act gaa aaa ttc cat tta gat gta gaa ata tct675Lys Thr Val Glu Thr Glu Lys Phe His Leu Asp Val Glu Ile Ser211 215 220225tat aag gac gaa agt690Glu Ser Tyr Lys Asp226 230<210>2<211>690<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(690)<223>含部分内切酶酶切位点序列的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M<440>2gga tcc ttt tgc tat tcg caa aat cat atc gca acc gct gat gtc45Gly Ser Phe Cys Tyr Ser Gln Asn His Ile Ala Thr Ala Asp Val1 5 10 15gga gtt ttg aat ctt agg aac tat tat ggt agc tat cca att gaa90Gly Val Leu Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Tyr Pro Ile Glu16 20 25 30
gac cac caa agt att aat cct gaa aat aat cat ctt tcg cat caa135Asp His Gln Ser Ile Asn Pro Glu Asn Asn His Leu Ser His Gln31 35 40 45tta gtt ttt tct atg gat aat tcg aca gta aca gct gaa ttt aag180Leu Val Phe Ser Met Asp Asn Ser Thr Val Thr Ala Glu Phe Lys46 50 55 60aac gtt gat gat gta aag aaa ttc aaa aat cat gct gta gat gta225Asn Val Asp Asp Val Lys Lys Phe Lys Asn His Ala Val Asp Val61 65 70 75tat ggt cta agt tat agt gga tat tgt ttg aaa aac aaa tat ata270Tyr Gly Leu Ser Tyr Ser Gly Tyr Cys Leu Lys Asn Lys Tyr Ile76 80 85 90tac ggt gga gtt aca tta gca ggt gat tat tta gag aaa tct aga315Tyr Gly Gly Val Thr Leu Ala Gly Asp Tyr Leu Glu Lys Ser Arg91 95 100105cgt att cct att aat ctt tgg gtt aat gga gaa cat caa act ata360Arg Ile Pro Ile Asn Leu Trp Val Asn Gly Glu His Gln Thr Ile106 110 115120tct act gac aaa gta tca act aat aaa aag tta gta aca gct caa405Ser Thr Asp Lys Val Ser Thr Asn Lys Lys Leu Val Thr Ala Gln121 125 130135gaa att gat act aaa tta aga aga tat cta caa gaa gaa tat aat450Glu Ile Asp Thr Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Glu Tyr Asn136 140 145150
att tat ggc ttt aat gat aca aat aaa gga aga aat tat ggt aat495Ile Tyr Gly Phe Asn Asp Thr Asn Lys Gly Arg Asn Tyr Gly Asn151 155 160165aag tca aaa ttt agt tct gga ttt aat gca gga aaa ata tta ttt540Lys Ser Lys Phe Ser Ser Gly Phe Asn Ala Gly Lys Ile Leu Phe166 170 175180cat ttg aat gat ggt tca tca ttt tct tat gac tta ttt gat act585His Leu Asn Asp Gly Ser Ser Phe Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Thr181 185 190195gga aca gga caa gct gaa agt ttc tta aaa ata tat aat gac aac630Gly Thr Gly Gln Ala Glu Ser Phe Leu Lys Ile Tyr Asn Asp Asn196 200 205210aaa act gtc gaa act gaa aaa ttc cat tta gat gta gaa ata tct675Lys Thr Val Glu Thr Glu Lys Phe His Leu Asp Val Glu Ile Ser211 215 220225tat aag gac gaa agt690Glu Ser Tyr Lys Asp226 230<210>3<211>684<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(684)<223>克隆所得金黄色葡萄球菌肠毒素M<440>3
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gac aaa gta tca act aat aaa aag tta gta aca gct caa gaa att405Asp Lys Val Ser Thr Asn Lys Lys Leu Val Thr Ala Gln Glu Ile121 125 130135gat act aaa tta aga aga tat cta caa gaa gaa tat aat att tat450Asp Thr Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Glu Tyr Asn Ile Tyr136 140 145150ggc ttt aat gat aca aat aaa gga aga aat tat ggt aat aag tca495Gly Phe Asn Asp Thr Asn Lys Gly Arg Asn Tyr Gly Asn Lys Ser151 155 160165aaa ttt agt tct gga ttt aat gca gga aaa ata tta ttt cat ttg540Lys Phe Ser Ser Gly Phe Asn Ala Gly Lys Ile Leu Phe His Leu166 170 175180aat gat ggt tca tca ttt tct tat gac tta ttt gat act gga aca585Asn Asp Gly Ser Ser Phe Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Gly Thr181 185 190195gga caa gct gaa agt ttc tta aaa ata tat aat gac aac aaa act630Gly Gln Ala Glu Ser Phe Leu Lys Ile Tyr Asn Asp Asn Lys Thr196 200 205210gtc gaa act gaa aaa ttc cat tta gat gta gaa ata tct tat aag675Val Glu Thr Glu Lys Phe His Leu Asp Val Glu Ile Ser Iyr Lys211 215 220225gac gaa agt684Asp Glu Ser226 228
<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>从金黄色葡萄球菌基因组中扩增含酶切位点的金黄色葡萄球菌肠毒素M基因所用的上游引物<440>4cag gat cct ttt gct att cgc aaa atc ata tcg ca<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>从金黄色葡萄球菌基因组中扩增含酶切位点的金黄色葡萄球菌肠毒素M基因所用的下游引物<440>5gcc tcg agt caa ctt tcg tcc tta taa gat att tct ac
权利要求
1.一种重组金黄色葡萄球菌肠毒素M，该蛋白为一种超抗原，具有SEQ IDNO.1的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M的制备方法，具体通过以下步骤实现(1)以金黄色葡萄球菌基因组作为模板，在目的基因两端添加BamH I和Xho I酶切位点，按照常规方法进行PCR扩增，通过基因测序证实获得的目的基因片段序列与SignalP 3.0 Server预测的SEM成熟肽蛋白质的基因序列相比，仅在N端多出了2个氨基酸，将获得的目的基因片段序列连入pGEM-T载体；(2)利用亚克隆技术构建pGEX-4T-1-SEM重组质粒，将该质粒转入大肠杆菌后，采用常规方法IPTG诱导蛋白表达；(3)利用能特异性地结合谷胱甘肽转移酶(GST)的亲和纯化填料纯化重组SEM蛋白，电泳鉴定结果显示获得了高纯度的重组SEM蛋白；其特征是步骤(1)用于扩增含BamH I和Xho I酶切位点的编码肠毒素SEM成熟肽基因的上下游引物是SEQ ID NO.45’-cag gat cct ttt gct att cgc aaa atc ata tcgca-3′，划线部分为BamH I酶切位点，SEQ ID NO.55’-gcc tcg agt caa ctt tcg tcctta taa gat att tct ac-3’，划线部分为Xho I酶切位点，pGEX-4T-1-SEM重组质粒是由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列经过重组构建而成；步骤(2)适合质粒pGEX-4T-1-SEM原核表达系统表达蛋白的宿主，选用大肠杆菌BL21。
3.根据权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M的制备方法，其特征是重组金黄色葡萄球菌肠毒素M的原核表达系统是由pGEX-4T-1质粒和重组金黄色葡萄球菌肠毒素M蛋白的基因序列重组构建而成，可用于带谷胱甘肽转移酶标签的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M蛋白的表达。
4.根据权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M蛋白的制备方法，其特征是通过PCR扩增从金黄色葡萄球菌菌株基因组中获得添加了酶切位点的编码金黄色葡萄球菌肠毒素M蛋白的目的基因片段，将其克隆至pGEX-4T-1质粒，构建了原核表达系统pGEX-4T-1-SEM，并将该质粒转化至合适的大肠杆菌宿主用于表达重组金黄色葡萄球菌肠毒素M蛋白。
5.根据权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M蛋白的制备方法，其特征是初始获得的蛋白为带有谷胱甘肽转移酶标签的融合蛋白GST-SEM，先利用亲和填料纯化该融合蛋白，进一步去除该标签后再次利用亲和填料纯化重组SEM蛋白。
6.根据权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M蛋白的制备方法，其特征是初始获得的GST-SEM融合蛋白占细菌总蛋白含量的15-25％。
7.根据权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M蛋白的制备方法，其特征是最终经过亲和层析纯化得到的重组SEM蛋白纯度大于95％。
8.根据权利要求2所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M蛋白的制备方法，其特征是所述的亲和填料是结合谷胱甘肽转移酶的亲和填料，优选偶联有谷胱甘肽的。
9.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M在制备刺激淋巴细胞增殖药物中的应用。
10.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素M在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。
全文摘要
一种重组金黄色葡萄球菌肠毒素M，该蛋白属于一种超抗原，具有SEQ IDNO.1的氨基酸序列，是利用来源于金黄色葡萄球菌的编码SEM的基因与一种质粒载体重组，并将其转化至合适宿主进行表达，通过亲和纯化获得。本发明利用体外小鼠脾淋巴细胞增殖实验和肿瘤细胞抑制实验证实该重组蛋白具有典型的超抗原活性，且较SEC更强，可在制备刺激淋巴细胞增殖、抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。适用于高效制备具有超抗原活性的高纯度肠毒素以及超抗原制剂的开发。本发明设计合理，对重组SEM进行高效表达，表达强度占全菌蛋白的15－25％左右，且为可溶性表达，便于后续分离纯化；采用亲和层析对目的蛋白进行纯化，步骤简单，纯化速度快。
文档编号C12N1/21GK101066993SQ200710067890
公开日2007年11月7日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者陈枢青, 潘映秋, 丁丁 申请人:浙江大学