专利名称：：环状芽孢杆菌wz-12及其在微生物分解处理二氯甲烷中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一抹可降解二氯甲烷的新菌抹一一环状芽孢杆菌WZ-12,及其在微生物分解处理二氯曱烷和制备二氯曱烷脱卣素酶中的应用。(二)背景才支术二氯甲烷(CH2C12)是一类使用非常广泛的化学试剂，主要在金属材料去油污、纺织、印染、油漆行业和制药工业等领域作溶剂使用。二氯曱烷属异生物合成物(Xenobiotics)，为难降解有机污染物的典型，当前被认为是大气污染中毒性较大的卣代烃类物质，其广泛使用带来一系列环境污染问题，严重危及人类健康，并且破坏臭氧层，被美国EPA列为优先污染物。Methylobacterium和Hyphomicrobium属的某些菌4朱能利用二氯曱烷作为唯一碳源进行生长，这些细菌含有参与反应的关键酶_一二氯曱烷脱卣素酶，此酶属于谷胱甘肽转移酶类，是诱导酶，能催化二氯甲烷矿化生成曱醛和无机氯。反应途径如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>难降解的有机污染物的生物法降解既是目前国际上环境污染控制
技术领域：
的研究热点，也是当前和今后我国经济和社会发展中需要解决的重要而迫切的科技问题，并具有广阔的应用前景。但由于以二氯曱烷为代表的卣代有机物水溶性不高，多不能直接被微生物酶系统所识别，甚至对微生物有代谢抑制作用。以现有微生物菌种的生物处理工艺难以奏效。其关键问题是高效降解途径的缺乏和现有已知途径的缺陷。发现微生物新品种和创建的新代谢途径，一则可以进行高效降解途径的设计、组装，以扩展降解菌利用底物的范围、避免有毒中间产物的形成，二则可以增加生物酶催化活性和稳定性,提高底物通量及其生物可利用性等，是解决当前这些问题的关键。自从1980年Rittmann等首次从工业废水中分离出能以二氯甲烷作为唯一碳源和能源的曱基杆菌(Methylobacterium),到1990年ScholtzR发现二氯曱烷高效降解菌林假单胞菌DM11,迄今有报道相继分离到包括生丝微菌(Hyphomicrobium)在内的10多抹分解二氯甲烷的细菌，并对这些菌中的脱卣素酶进行了研究，根据这些酶的性质，把它们分成两组，一组是活力较低的A组二氯曱烷脱囟素酶，另一组是活力较高的B组二氯曱烷脱卣素酶。迄今尚没有环状芽孢杆菌能以二氯曱烷作为碳源与能源的生物降解的报道。
发明内容本发明目的是为了提供一抹可降解二氯曱烷的新菌株一一环状芽孢杆菌WZ-12，及其在微生物分解处理二氯曱烷和制备二氯曱烷脱卣素酶中的应用。为达到发明目的本发明采用的技术方案是环状芽孢杆菌WZ-12(5ac说wcz>cw/awWZ-12),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏编号CCTCCNo:M207006。本发明所提供的二氯曱烷降解菌为自行分离筛选获得，代号WZ-12,鉴定为环状芽孑包杆菌(5ad〃wscz>cw/<ms),其16SrDNA全序歹'JGenBankaccessionno.EF100968。就目前所知，迄今尚没有环状芽孢杆菌能以二氯曱烷作为碳源与能源的生物降解的报道。本发明菌抹的获得从浙江各地有记录长期被二氯甲烷污染的土壤、废水中，如杭州华东制药厂暴气池、新昌制药厂暴气池和杭州农药厂废水污泥中采集样品36份，通过样品驯化，初筛，复篩，获得具有二氯甲烷降解能力的纯培养物。对该纯培养物进行了形态和生理生化鉴定，并对其16SrDNA全序列同源性作了分析，将其鉴定为环状芽孢杆菌(S""7/船c/ww/"w)。另外通过分子歸层析和离子交换层析等手段，分离纯化了该二氯曱烷降解菌WZ-12发酵液中的二氯甲烷脱卣酶组分。通过SDS-PAGE电泳测得分子量为30.8kD。菌林的鉴定1)菌林的细胞形态该菌呈杆状，大小为(0.40.6jum)x(o.91.5jum)，端生单根鞭毛(见图1)，革兰氏染色为阴性。在无碳查氏固体培养基30。C培养23d后，菌落呈乳白润泽，较小，圆形，边缘整齐，表面光滑，不易挑起。2)菌株的生理生化特性接触酶、过氧化氢酶阴性，可以葡萄糖、木糖、棉子糖、鼠李糖、蔗糖和麦芽糖发酵产酸，但不能利用肌糖、山梨醇和甘露糖。甲基红反应、V.P反应阴性，吲哚反应、淀粉水解和明胶液化阳性。DNA中的G+Cmol。/。为35.6。结果表明，菌林WZ-12的生理特征与芽孢杆菌属(Bacz'〃wgem/s)的细菌种极为相似。3)菌林16SrDNA序列测定与系统发育树分析16SrDNA扩增产物见图4，PCR产物测序结果得到长度为1490bp的16SrDNA全长序列，并基于相关属菌抹的16SrDNA序列构建系统发育树(见图2)。16SrDNAPCR产物测序结果得到长度为1490bp的全长序列(GenBankaccessionno.EF100968》如下151101151201GCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA2513019511001105111501201125113011351140114511490AGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTTCGT。菌林的生长特性培养条件在摇床上250ml三角烧瓶，以二氯曱烷为唯一碳源和能源的培养基，即在微量元素培养基(MSM)中添加二氯甲烷，二氯曱烷终浓度为32mM,分4次加入。温度30。C，起始pH7.5，检测生物量、pH和比酶活的变化，每12小时检测1次。结果如图3。MSM配法KH2P04,6.8mg/ml;(NH4)2S04,0.2mg/ml;MgS04,O.lmg/ml;glycerol,5g在121。C下灭菌18分钟后，补加0.25%Ca(NO3)4溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L。痕量元素溶液MnCl2*4H20,0.2g/l;CoCl2'6H20,0.34g/l;ZnCl2,0.2g/l;CaCl2*2H20，0.4g/l;H3B03,0.038g/l;MC12*6H20,0.1g/l;Na2M0O4*4H2O,0.04g/l;NH4V03,0.04g/l;KI,0.8g/l。菌种的保存获得的菌种分别采用斜面菌种在4。C冰箱it份、沙土管保存l份和制成冻干粉保存l份。所述的环状芽孢杆菌WZ-12可用于^f鼓生物分解处理二氯曱烷。所述的应用为以二氯甲烷为唯一碳源和能源，对环状芽孢杆菌WZ-12菌种进行扩大培养，以培养获得的菌液为酶源，使二氯甲烷矿化为氯离子和甲酸盐。所述应用为以二氯曱烷为唯一碳源和能源，对环状芽孢杆菌WZ-12菌种进行扩大培养，以培养获得的菌液浸没生物填料，挂膜后用于二氯曱烷分解处理，所述菌液细胞浓度为0.52Xl(^个/mL。所述菌液由如下方法得到将环状芽孢杆菌WZ-12接种到种子培养基中培养获得菌悬液，菌悬液以0.52x1()S个细胞/mL培养基的接种量接种到种子培养基中，30。C震荡培养，48h后终止培养，得菌液；种子培养基各组分终浓度为NaN03,0.5~3g/L;K2HP04,0.52g/L;KCl，0.2~1.0g/L;MgS04*7H20,0.31.0g/L;FeS04,0.0050.02g/L;pH7.0~7.2,在121。C下灭菌20分钟，气态碳源CH2Cl2终浓度为32mM，培养时分4次加入；具体的，所述应用按如下顺序步骤进行(l)斜面培养采用无碳查氏固体培养基，斜面涂布环状芽孢杆菌WZ-12菌种，定时滴加二氯曱烷，30。C下培养23天，获得的单菌落转入大试管斜面，在斜面的对侧试管壁上放置滴有二氯曱烷的棉花，获得斜面菌种；(2)将斜面菌种接种到种子培养基中培养获得菌悬液，菌悬液以0.52x105个细胞/mL培养基的接种量接种到种子培养基中，30。C震荡培养，48h后终止培养，得菌液；种子培养基各组分终浓度为NaN03,2g/L;K2HP04,1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04'7H20,0.5g/L;FeS04,0.01g/L;pH7.07.2，在121。C下灭菌20分钟，CH2C12终浓度为32mM,培养时分4次加入；(3)将菌液转入生物滴滤池，聚丙烯填料表面接种和挂膜，接种量为20%体积比，30天后，二氯曱烷气体和循环液(循环液可为常见适用于环状芽孢杆菌的营养液，本发明中采用循环液组成如下NaN03,0.5~3g/L;K2HP04,0.52g/L;KC1,0.21.0g/L;MgS04'7H20，0.3~1.0g/L;FeS04,0.005~0.02g/L;pH7.0~7.2)在滴滤池内逆流操作，在循环液pH值7.0士0.5、温度28.5士2。C、气体空床停留时间15.0~16.0s、二氯甲烷进口浓度为0.7~3.12g/m3W条件下进行二氯曱烷废气处理。所述的环状芽孢杆菌WZ-12也可直接用于制备二氯曱烷脱卣素酶。所述二氯甲烷脱卣素酶由如下方法制备得到(1)环状芽孢杆菌WZ-12在种子培养基中培养获得菌悬液，菌悬液以1x1(^个细胞/mL培养基接种到产酶培养基中，pH7.5、3(TC震荡培养48h,得产酶培养物；种子培养基各组分终浓度为NaN03，2g/L;K2HP04,1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04*7H20,0.5g/L;FeS04，0.01g/L;pH7.0~7.2,在121°C下灭菌20分钟，CH2Cl2终浓度为32mM，培养时分4次加入；产酶培养基各组分终浓度为KH2P04,6.8g/L;(NH4)2S04，0.2g/L;MgS04,O.lg/L;甘油，5g/L;在121。C下灭菌18分钟后，补加质量浓度0.25%的Ca(N03)2溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L;所述痕量元素溶液组成为MnCl2*4H20,0.2g/L;CoCl2*6H20,0.34g/L;ZnCl2,0.2g/L;CaCl2*2H20,0.4g/L;H3B03,0.038g/L;NiCl2*6H20,O.lg/L;Na2M0O4*4H2O,0,04g/L;NHtVCb,0.04g/L;KI,0.8g/L;(2)步骤(1)所得产酶培养物4°C,lOOOrpm离心15min，细胞沉淀用0.05MTris-HCl、pH7.5緩冲液水洗一次，得湿菌体，湿菌体悬浮于0.05MTris-HCl、pH7.5緩冲液中，超声波破碎2次，4°C、15000rpm离心2次，每次15min,取上清液，即为粗酶液，粗酶液经分离纯化，即得所述二氯曱烷脱闺素酶。本发明的有益效果主要体现在提供一林可降解二氯曱烷的新菌林一一环状芽孢杆菌WZ-12,该菌可在有氧条件下快速降解二氯曱烷，为以二氯甲烷为代表的卣代烃类有机污染物的生物降解机理的研究提供了重要的基础，亦可以直接应用在有机废气的生物处理工艺上。此外，该菌株为野生型，遗传背景非常清晰，适于进行遗传改良，有望大幅度提高对有才几废气的处理能力。图1为菌株WZ-12染色特征和JEOL-1230扫描电镜照片；图2为基于16SrDNA序列同源性的菌林WZ-12和其他相关菌抹的系统发育树；图3为菌林WZ-12的生长特性pH(■)，生物量(*)，比酶活(0);图4为菌抹WZ-12的16srDNA扩增产物(M:marker;B:样品条带)；图5为二氯曱烷脱囟素酶分子筛层析图谱；图6为二氯曱烷脱卣素酶Q-SepharoseHiprep16/10QXL柱层析图谱；图7为二氯甲烷脱卣素酶SepharoseF.F.柱层析图谱；图8为二氯曱烷脱卣素酶SDS-PAGE电泳图谱(M:标准蛋白；A和B:样品条带)；图9为菌抹WZ-12固体培养图示；1为培养基，2为含二氯甲烷的无菌棉花。环状芽孢杆菌WZ-12(Ba"7/ws">cw/araWZ-12),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏编号CCTCCNo:M207006。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:菌抹WZ-12来源二氯曱烷脱卣素酶的制备与分离纯化(1)菌林的产酶培养采用无碳查氏液体培养基，在种子培养基中培养获得菌悬液，10ml菌悬液(1x106)接种到装有100ml产酶培养基的250ml三角瓶中，用橡皮塞盖紧瓶口，30。C震荡培养，CH2Cl2的终浓度为32mmol/L,分4次加入，每次8mmol/L，pH7.5，48h终止培养，得产酶培养物。种子培养基各组份终浓度为NaN03,2g;K2HP04,1g;KC1,0.5g;MgS04*7H20,0.5g;FeS04，0.01g;H20,1000ml;pH7.07丄在121°C下灭菌20分钟。气态碳源CH2C12终浓度为32mM,培养时分4次加入。产酶培养基各组分终浓度为KH2P04，6.8g/L;(NH4)2S04,0.2g/L;MgS04,O.lg/L;甘油，5g/L;在121。C下灭菌18分钟后，补加质量浓度0.25%的Ca(NOs)2溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L;痕量元素溶液组成为MnCl2*4H20，0.2g/L;CoCl2*6H20，0.34g/L;ZnCl2，0.2g/L;CaCl2*2H20,0.4g/L;H3B03,0.038g/L;NiCl2*6H20,O.lg/L;Na2M0O4'4H2O,0.04g/L;NH4V03,0.04g/L;KI，0.8g/L;(2)新鲜湿细胞的获得产酶培养物4°C,lOOOOrpm离心15min,细胞沉淀用0.05MTris-HCl(pH7.5)洗一次，贝i存备用。(3)二氯甲烷脱卣素酶的分离纯化2g新鲜湿细胞悬浮于0.05MTris-HCl,pH7.5緩沖液中，超声波破碎两次，4°C,15000rpm离心两次，每次15min,上清液即为粗酶液。粗酶液中加入硫酸铵盐至40%(质量含量)饱和度，4。C下过夜。离心，去除杂蛋白，取上清液测酶活，于上清液中緩慢补加硫酸铵至80%(质量含量)饱和度，4。C过夜，收集沉淀，上清液测酶活，确定上清液中没有酶活。使用AKTAFPLC层析系统，先将经过预处理的粗酶液上SephadexG-75分子筛，酶蛋白得到初步分离，只有出现的第一个峰的前半部分具有很高的脱卣酶活(图5)。然后，收集上述具有酶活性的蛋白峰样品上样于以A液(0.05MTris-HCl,pH7.5緩冲液)预平衡的Q-SepharoseHiprep16/10QXL柱进行阴离子交换层析，用B液(含1.0MNaCl的A液)溶液进行线性梯度洗脱，得到2个蛋白峰，酶活力最高部分集中在第2个蛋白峰内(图6),将这部分蛋白经超滤浓缩，调pH至7.2,然后通过预先用0.05MTris-HCl,pH7.5緩冲液平衡的SepharoseF.F^i(1.0x5mL)进行第二次强阴离子交换层析，用1.0mol/LNaCl(于緩冲液中)线性梯度洗脱(2mL/min),得到一个酶活力蛋白峰(图7)。整个提纯过程如表1。经过以上分离纯化过程，只得到一个二氯曱烷脱卣素酶组分，对样品进行电泳分析表明，在SDS-PAGE胶上形成单一条带，确定其分子量约为30.8kD(图8)。表明该组分已达电泳纯。在整个提纯过程中，二氯曱烷脱面素酶被提纯8.27倍，收率34.83%(见表1)。表l:菌抹WZ-12二氯曱烷脱卣素酶的提纯<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例2:菌林WZ-12在生物过滤处理二氯曱烷中的应用(1)菌林培养采用无碳查氏固体培养基如图9方法培养，首先在固体培养基表面涂布菌种，然后在亚盖上加一大块无菌棉花，棉花中滴适量的二氯曱烷，置30。C下培养，定时补加二氯曱烷。对照平板的棉花中加无菌生理盐水，培养23天后，获得的单菌落转入大试管斜面，在斜面的对侧试管壁上放置滴有二氯曱烷的棉花，便可获得斜面菌种。(2)菌种扩大培养斜面菌种在种子培养基中培养获得菌悬液，50ml菌悬液(细胞浓度lxl()S个/mL)接种到装有1000ml种子培养基的5L三角瓶中，用橡皮塞盖紧瓶口，30。C震荡培养，48h终止培养。种子培养基各组分终浓度为NaN03,2g/L;K2HP04,1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04*7H20，0.5g/L;FeS04，0.01g/L;pH7.0~7.2，在121。C下灭菌20分钟，CH2C12终浓度为32mM,培养时分4次加入；(3)以上方法获得的菌悬液(浓度lxl()S个/ml),在050mm的有机玻璃生物滴滤池内，聚丙烯填料表面接种和挂膜，接种液(组成NaN03,2.5g/L;K2HP04,1.5g/L;KC1,0.6g/L;MgS04*7H20,0.8g/L;FeS04,0.015g/L;pH7.2)48L，接种菌悬液约9.6L,接种和挂膜约需30天。二氯曱烷模拟气体和循环液在滴滤池内逆流操作，循环液pH值为7.0±0.5,温度维持在28.5士2。C的条件下，在气体空床停留时间为15.7s、二氯曱烷进口浓度为0.73.12g/m3的范围内，去除效率为72.0%~89.1%。实施例3:采用工业微生物育种方法提高二氯曱烷降解效率以本发明菌抹WZ-12为出发菌抹，采用无碳查氏固体培养基如实施例1的方法获得菌种的扩大培养物，采用紫外辐照结合6QCoy射线诱变的工业微生物育种方法，获得遗传改良的降解菌抹，对该菌抹与它的出发菌株的降解能力进行对比试验，结果显示，对二氯曱烷的降解能力提高了24~32%。具体方法如下(1)菌种诱变程序出发抹—紫外线辐照—初篩、复筛—6GCoY射线辐照—初筛、复筛—二氯曱烷高降解效率菌株。(2)紫外线诱变处理取培养35d的新鲜斜面，用无菌生理盐水洗下菌莒制成菌悬液，经玻璃珠振荡打散和脱脂棉过滤后，调整菌悬液浓度1()s个/mL左右，吸取5mL菌悬液至无菌的小平皿中，在25W紫外灯(距离30cm)照射下，磁力搅拌，照射时间才艮据致死率确定，菌悬液在无菌室红灯下适当稀释涂平寿反，平板倒置于30。C恒温培养箱中培养7~8d。(3)^CoY射线辐照处理采用培养好的新鲜试管斜面直接进行辐照。分别以0.5kGy、2.0kGy剂量对试管中菌体进行^CoY射线辐照，用无菌生理盐水将经辐照处理后的斜面制成孢子悬液,并经适当稀释后涂平板，平板倒置于3(TC恒温箱中培养7~8d。(4)初篩和复筛采用无碳查氏固体培养基，以二氯甲烷为唯一碳源和能源，采用气态碳源提供方法进行选择性培养，挑选单菌落，转接液体培养基，上摇床通过检测降解效率进行复筛。(4)降解能力对比试验改良菌株与它的出发菌林的降解能力对比试验是在250mL三角瓶内上摇床分别检测降解效率。序列表[1].ST25SEQUENCELISTING<110〉浙江工业大学<120>环状芽孢杆菌WZ-12及其在微生物分解处理二氯甲烷中的应用<130><160〉1<170>Patentlnversion3,2<210〉1〈211>1490<212>DNA<213>Bacilluscirculans〈400>1ctgggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggactt犯aa60agcttgctttttaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaag120actgggat朋cttcgggaaaccggagct犯t8ccggata8tcctttcctactcatgtagg180aB3gctgaaagacggtttacgctgtcacttac卿tgggcccgcggcgcattagctagtt240ggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgageigggtgatcggcca300cactgggactg,cacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgca360atggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatg鄉gttttcggatcgtaaaa420ctctgttgttagggaag犯caagtacgagagtaactgctcgtetccttgacggtacct犯c480cagaaagccacggct犯cteicgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttg540tccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtcctttaagtctgatgtgaaagccc600acggctcaaccgtggagggtCattgg333Ctgggggacttgagtgcagaa660g犯ttccacgtgtagcggtga犯tgcgtag卿tgtggaggaacaccagtggcg犯ggcg720actctttggtctgtaactgacgctgaggcgcg,gcgtggggagcsaacaggattsg3t7803CCCtggt3gtccacgccgttgctaagtgtt柳gggtttccgcccttta840gtgctgcagca犯cgcattaagcactccgcctggggagtacggccgc卿gCtg333CtC900犯3gg33ttgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgc960gaagaaccttaccaggtcttgacatctcctgac^tcct3gagataggacgttccccttc1020ggggg織ggatg織ggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggt1080taagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactcta1140aggtgactgccggtgac3犯ccggagg鄉gtggggatgacgtcaaatcatcatgcccct1200tatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggcagcaaaaccgcgsgg1260tcgagccaatcccatsaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatg1320犯gctggaiEitcgct3gtaatcgcggstcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggcctt1380gtacacaccgcccgtcacaccacgsgagtttgtaacacccg卿tcggtggggt幼ccct1440tctgggagccagccgcct犯ggtggg由gatgattggggtg犯gttcgt1490权利要求1.环状芽孢杆菌WZ-12(BacilluscirculansWZ-12)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏编号CCTCCNoM207006。2.如权利要求1所述的环状芽孢杆菌WZ-12，其特征在于所述环状芽孢杆菌WZ-12菌落特征和生理生化特性为杆状，大小为0.40.6jumx0.91.5jim,端生单根鞭毛，革兰氏染色为阴性，在无碳查氏固体培养基30。C培养23d后，菌落呈乳白润泽，较小，圆形，边缘整齐，表面光滑，不易挑起；接触酶、过氧化氬酶阴性，曱基红反应、V.P反应阴性，p引哚反应阳性，淀粉水解阳性，明胶液化阳性。3.如权利要求1所述的环状芽孢杆菌WZ-12,其特征在于所述环状芽孢杆菌WZ-12的16SrDNA序列为501CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTA651GAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG751CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT1201TATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCAA1301AACCGCGAGGTCGAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTA1351GGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG1401CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAC1451CACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCTTCTGGGAGCC1490AGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTTCGT。4.如权利要求13之一所述的环状芽孢杆菌WZ-12在微生物分解处理二氯曱烷中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用为以二氯曱烷为唯一碳源和能源，对环状芽孢杆菌WZ-12菌种进行扩大培养，以培养获得的菌液为酶源，使二氯甲烷矿化为氯离子和曱酸盐。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为以二氯曱烷为唯一碳源和能源，对环状芽孢杆菌WZ-12菌种进行扩大培养，以培养获得的菌液浸没生物填料，挂膜后用于二氯曱烷分解处理，所述菌液细胞浓度为0.5-2Xl()6个/mL。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述菌液由如下方法得到将环状芽孢杆菌WZ-12接种到种子培养基中培养获得菌悬液，菌悬液以0.5~2x1(每个细胞/mL培养基的接种量接种到种子培养基中，30℃震荡培养，48h后终止培养，得菌液；种子培养基各组分终浓度为NaN03，0.5~3g/L;K2HP04,0.5~2g/L;KCl，0.2~1.0g/L;MgS04*7H20,0.31.0g/L;FeS04,0.0050.02g/L;pH7.07.2,在121。C下灭菌20分钟，气态碳源CH2Cl2终浓度为32mM，培养时分4次加入；8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用按如下顺序步骤进行:(1)斜面培养采用无碳查氏固体培养基，斜面涂布环状芽孢杆菌WZ-12菌种，定时滴加二氯甲烷，30。C下培养23天，获得的单菌落转入大试管斜面，在斜面的对侧试管壁上放置滴有二氯曱烷的棉花，获得斜面菌种；(2)将斜面菌种接种到种子培养基中培养获得菌悬液，菌悬液以0.5~2x106个细胞/mL培养基的接种量接种到种子培养基中，30。C震荡培养，48h后终止培养，得菌液；种子培养基各组分终浓度为NaN03,2g/L;K2HP04,1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04*7H20,0.5g/L;FeS04，0.01g/L;pH7.07.2，在121。C下灭菌20分钟，CH2C12终浓度为32mM,培养时分4次加入；(3)将菌液转入生物滴滤池，聚丙烯填料表面接种和挂膜，接种量为20%体积比，30天后，二氯曱烷气体和循环液在滴滤池内逆流才喿作，在循环液pH值7.0士0.5、温度28.5土2。C、气体空床停留时间15.0~16.0s、二氯曱烷进口浓度为0.73.12g/m3的条件下进行二氯甲烷废气处理。9.如权利要求1~3之一所述的环状芽孢杆菌WZ-12在制备二氯甲烷脱卣素酶中的应用。10.如权利要求9所述应用，其特征在于所述二氯曱烷脱囟素酶由如下方法制备得到(1)环状芽孢杆菌WZ-12在种子培养基中培养获得菌悬液，菌悬液以1x1()6个细胞/mL培养基接种到产酶培养基中，pH7.5、30。C震荡培养48h,得产酶培养物；种子培养基各组分终浓度为NaN03,2g/L;K2HP04，1g/L;KC1,0.5g/L;MgS04*7H20，0.5g/L;FeS04,0.01g/L;pH7.07.2,在121°C下灭菌20分钟，CH2Cl2终浓度为32mM,培养时分4次加入；产酶培养基各组分终浓度为KH2P04,6.8g/L;(NH4)2S04，0.2g/L;MgS04,O.lg/L;甘油，5g/L;在121。C下灭菌18分钟后，补加质量浓度0.25%的Ca(N03)2溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L;所述痕量元素溶液组成为MnCl2*4H20，0.2g/L;CoCl2*6H20,0.34g/L;ZnCl2，0.2g/L;CaCl2'2H20,0.4g/L;H3B03,0.038g/L;NiCl2*6H20,O.lg/L;Na2M0O4*4H2O，0.04g/L;NH4V03，0.04g/L;KI,0.8g/L;(2)步骤(1)所得产酶培养物4。C,lOOOrpm离心15min，细胞沉淀用0.05MTris-HCl、pH7.5緩冲液水洗一次，得湿菌体，湿菌体悬浮于0.05MTris-HCl、pH7.5緩冲液中，超声波破碎2次，4°C、15000rpm离心2次，每次15min,取上清液，即为粗酶液，粗酶液经分离纯化，即得所述二氯曱烷脱卣素酶。全文摘要本发明提供了一株可降解二氯甲烷的新菌株——环状芽孢杆菌WZ-12，及其在微生物分解处理二氯甲烷和制备二氯甲烷脱卤素酶中的应用。环状芽孢杆菌WZ-12(BacilluscirculansWZ-12)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏编号CCTCCNoM207006。本发明的有益效果主要体现在提供一株可降解二氯甲烷的新菌株——环状芽孢杆菌WZ-12，该菌可在有氧条件下快速降解二氯甲烷，为以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解机理的研究提供了重要的基础，亦可以直接应用在有机废气的生物处理工艺上。此外，该菌株为野生型，遗传背景非常清晰，适于进行遗传改良，有望大幅度提高对有机废气的处理能力。文档编号C12N1/20GK101200697SQ200710067510公开日2008年6月18日申请日期2007年3月2日优先权日2007年3月2日发明者吴成强,吴石金,张丽丽,朱润晔,王家德,陈建孟申请人:浙江工业大学;陈建孟;吴石金