一种制备骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的方法

专利名称：一种制备骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的方法
技术领域：
本发明涉及制备骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的方法，特别是获得与天 然BMP-2成熟肽氨基酸序列完全一致的BMP-2成熟肽的方法。(二) 背景技术骨形态发生蛋白-2 (BoneMorphogeneticProtein-2， BMP-2 )属于转化生 长因子超家族成员。BMP具有诱导未分化间充质细胞向软骨、骨分化，并且 对胚胎骨骼及多种器官的形成和发育起着重要调节作用。BMP独特的诱导成 骨活性使其在骨骼损伤与疾患，如骨折、骨缺损及口腔颇面外科中具有广阔的应用前景。近年来，通过DNA重组技术，十多种重组BMP蛋白在基础及 临床应用上均得到了广泛研究，对BMP在生物进化，发育和遗传等方面作用 的研究正不断深入。BMP在细胞内先以前体的方式产生，包括信号肽、前肽和羧基端的成熟 肽。成熟肽中含有7个高度保守的半胱氨酸，它们形成三个链内二硫键及一 个链间二硫鍵并将两条多肽链连接为二聚体，BMP前体蛋白经过N位糖基化， 蛋白水解酶裂解及二聚体化而形成BMP成熟肽，其活性形成多为其同源二聚 体，没有糖基化的同源二聚体仍然具有生物学活性。多种组织细胞在胚胎发 育的不同阶段表达BMP，并已从牛、鼠、兔、人等多种动物骨组织中分离出 了 BMP。另外，牙质、胎盘、骨肉瘤等组织中均含有丰富的BMP。应用放射 免疫技术能检测到血清中的BMP,成年人约14-18n/mlg,儿童为20-72ng/ml。天然BMP-2成熟肽的第一个氨基酸不是曱硫氨酸，常规的制备技术是在 成熟肽或截短型的N末端添加曱硫氨酸，利用大肠杆菌直接表达，包含体复 性法制备BMP-2，如华东基因技术研究所开发截短型的rhBMP-2，去除N端 7个氨基酸后，人为添加一个甲硫氨酸，以其密码子ATG作为起始密码子， 在大肠杆菌胞内高效表达，包含体蛋白复性得到有生物活性同二聚体。在本发明之前，现代医学33巻5期(2005/10)康春雨章庆国发表的《人 骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达》介绍了制备携带有 hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2的方法，通过脂质体法将所得 到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得 到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合SW:反应(RT-PCR)检 测骨髓基质细胞(MSCs)hBMP-2mRNA的表达。中国专利申请CN1484651介绍了将蛋白质在原核生物中表达，该械束达 蛋白质氨末端由一种TGF- 0超家族的蛋白质的前序列或其部分组成，将蛋白 质或另 一种TGF- P超家族蛋白质的成熟区域连接到该蛋白质上，所连接上的 蛋白质具有和成熟区BMP - 2至少35 %的同源性。蛋白质的表达在至少有一 部分蛋白质以包含体的形式而获得。众所周知，利用原核体系表达药用蛋白具有成本低廉，易于大规模生产 的优点。由于去糖基化的BMP-2仍然有生物学活性，这为原核体系表达BMP-2 创造了条件，华东基因技术研究所成功地利用大肠杆菌制备得到具有生物学 活性的重组人BMP-2。但是得到的产物与天然的BMP-2氨基酸序列不一致， 用于人体可能产生免疫原性。利用包含体制备目标蛋白虽然具有成本低的优 点，但是包含体中含有一定的杂蛋白和核酸，目标蛋白占总蛋白的80%左右。
发明内容本发明提供了一种制备骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的方法，该方法制 得的产物可与天然BMP-2成熟肽M酸序列完全一致，为实现本发明的目的， 本发明采用如下技术方案，本发明制备BMP-2成熟肽的方法包括如下顺序步 骤(1) 删除DsbA基因信号肽第2-18个氨基酸编码基因，保留第一个曱硫 氨酸的密码子作为起始密码子，得到编码不含信号肽的DsbA的 DNA片段，将该片段重组于表达载体中，获得重组质粒1;所述DsbA 基因可以大肠杆菌染色体的DNA作模板扩增出来，也可用pET等 含有DsbA基因的质粒作为模板扩增出来，用质粒做模板更容易一(2) 将编码骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟狀的DNA重组于重组质粒 l中DsbA基因的下游，获得重组质粒2;(3) 将重组质粒2转化入宿主菌株的菌体中，得到工程菌，所述宿主菌 为无疏氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主的DE3溶原菌；(4) 工程菌在含有抗生素的培养基中培养，添加诱导剂使目的基因表达； (5 )工程菌细胞经破菌，分离纯化得到BMP-2融合蛋白； 蛋白酶酶切BMP-2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。其中，所述步骤(l)中含有DsbA基因的质粒优选为pET39。大肠杆菌 基因组DNA中也含有该基因，可以用PCR方法扩增得到编码DsbA的基因。 所述步骤(3)中宿主菌抹优选为大肠杆菌BL21 (DE3)。所述步骤(4)中目 的基因的表达在缺乏氧化环境条件下进行。所述步骤(6)中蛋白酶为肠激酶 或重组肠激酶轻链。所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，所述步骤(2)中，重组质粒2中骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA与DsbA基因的下 游之间，还重组有编码 "Linker-6His-蛋白酶识别位点"的序列。所述6His部件也可位于DsbA基因的上游，蛋白酶识别位点为肠激酶。具体地说，例如， 取含有DsbA基因的质粒pET39,删除pET39中的DsbA信号肽基因，获得重 组质粒1: pET39 ( SP-);将编码"Linker-6His-Eksite"的DNA片段与编码骨 形态发生蛋白 BMP-2成熟肽的 DNA拼接，获得编码 "Linker-6His-Eksite-BMP-2 " 的 DNA 片段；再将编码 "Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片段通过限制性内切酶^/ TI和5awHI 重组于重组质粒1: pET39 (SP-)中DsbA基因的下游，获得重组质粒2: pET39 ( SP- BMP-2 )。所述方法推荐按如下顺序步骤进行 (1 )以含有DsbA基因的质粒pET39作为PCR模板，利用PCR技术删除 pET39中的DsbA信号肽基因第2~18个氨基酸编码基因，保留第一个曱 硫氨酸的密码子作为起始密码子，获得的DNA片段重组于表达载体中， 获得重组质粒1: pET39 ( SP-);(2) 将骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重组于重组质粒1中DsbA 基因的下游，获得重组质粒2: pET39 ( SP-BMP-2 );(3) 将重组质粒2: pET39(SP-BMP-2)转化入宿主菌林大肠杆菌的菌体中， 得到工程菌；(4) 工程菌在Luria-Bertani培养基中培养，使目标融合蛋白得到表达；(5) 工程菌细胞经破菌，分离纯化得到BMP-2融合蛋白；(6) 以肠激酶酶切BMP-2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白 BMP-2成熟肽。进一步，骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，优选按如下顺序步骤进行(1) 以含有DsbA基因的质粒pET39为模板，删除该质粒中的DsbA信号 肽基因第2~18个氨基酸编码基因，保留第一个曱硫氨酸的密码子作为起 始密码子，得到的片段重组于表达载体中，获得重组质粒1: pET39(SP-);(2) 将编码"Linker-6His-Eksite"的DNA片段与编码骨形态发生蛋白 BMP-2成熟肽的DNA拼接，获得编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA 片段；再将编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片段重组于重组质 粒1: pET39( SP-)中DsbA基因的下游，获得重组质粒2: pET39( SP-BMP-2 );(3 )将重组质粒2: pET39( SP- BMP-2 )转化入宿主菌抹￡.co// BL21 (DE3 ) 的菌体中，得到工程菌；(4) 工程菌在Luria-Bertani培养基中，30°C 、 200 r/min培养到ODgoo约 0.5时，添加终浓度为O.l-lmM诱导剂异丙基硫代-P-D-半乳糖苷，30-37 。C下继续培养2 10h，使目的基因表达；(5) 发酵结束后，离心收集工程菌细胞，破菌后，离心，收集上清液过 含N产的螯合柱，以50mM咪唑緩冲液预洗脱，以含咪唑120~150mM的 緩冲液洗脱目标蛋白，收集洗脱液；50mM咪唑緩冲液(pH7.3 )配制取 咪唑0.68g和氯化钠1.17g，加水使溶解成100ml,加入O.lmol/ml盐酸溶 液42.2ml，再加水稀释至200ml，即得。(6)往含BMP-2融合蛋白的洗脱液中，加入终浓度0.1 lmM的二乙胺四乙 酸，以及肠激酶5U/mL, 25。C下进行酶切，蛋白酶酶切融合蛋白，经分离 得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。U为酶活单位，定义为在23。C条 件下，8小时将50吗胰蛋白酶原95%转化为胰蛋白酶所需的酶量，下同。 再进一步，具体地说，骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法按如下 顺序步骤进行(1 )以含有DsbA基因的质粒pET39为模版，引物 DsbA-l: 5， -AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，， DsbA-2: 5' -TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3'， PCR参数94 。C 3min94°C 30s 40°C 30s 72°C lmin3个循环 94。C 30s 48°C 30s 72°C lmin 27个循环 72 °C lOmin 4°C lOmin以iV&I和5s/ TI酶切PCR产物和pET39质粒，使不含信号肽基因的 DNA片段置换pET39中原有的DsbA基因，获得不含DsbA信号肽基因的 重组质粒1: pET39 (SP-); (2 )将编码"Linker-6His-Eksite "的DNA片段 ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCATC ATGATGACGATGACAAA,其中CTTAAG为55pTI识别序列，与编码骨形态 发生蛋白BMP-2成熟肽的DNA拼接，获得编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2" 的DNA片段亏1物Linker-1: 5 ，-ATAQHMSCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTC ATCATCATC AT-3' 引物Linker-2: 5， -TTGCTTATGCTTTGCTTGTTTGTCATCGTCATCATGATGATGATGATGATGACC 3， 亏1物BMP2-1: 5 ，-GACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAA-3 ， 引物BMP2-2: 5，-TTCGGATCCTTAGCGACAGCCACAACCTT-3，取浓度为lOuM的引物Linker-1和Link-2各2uL,加入2uL dNTP, 5uL 10 x DNA Polymerase Buffer,补ddH20至50uL反应体系，沸水浴lOmin,放入50t:7JC浴冷却3min，补加2.5U Pfti DNA polymerase,转入72水浴 10min,使两个引物互为模板，形成DNA双链，得到反应产物A;以引物BMP2-1和BMP2-2作为正反向引物，以BMP-2基因为模板进 行PCR扩增，退火温度设为50。C，延伸时间30s,得到反应产物B;以产物A和产物B作为PCR模板，以引物Linker-l和BMP2-2作为正 反向引物进行基因拼接，获得编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片 段，反应体系和反应参数如下 PCR参数94 X: 3min94°C 30s 60°C 30s 72°C lmin 30个循环 72*C lOmin 化 lOmin ;(3) 将编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片,殳重组于重组质粒 pET39 (SP-)中DsbA基因的下游，获得重组质粒2: pET39 ( SP-BMP誦2 );(4) 将重组质粒2: pET39( SP- BMP-2 )转化入宿主菌抹￡.co//BL21(DE3) 的菌体中，得到工程菌；(5) 工程菌在Luria-Bertani培养基中经种子培养得工程菌种子液，培养 好的工程菌种子液按1%的接种量接种到摇瓶装液量为20%的 Luria-Bertani培养基发酵培养，30°C、 200 r/min培养到OD柳约为 0.5时添加诱导剂异丙基石危代-P -D-半乳糖苷至终浓度为0.2mM， 30 r温度下继续培养3h，使目的基因表达；(6) 发酵结束后，离心收集工程菌细胞，超声破菌后，离心，收集上清 液过含Ni2+的螯合柱，以50mM咪喳緩沖液预洗脱，以含150mM咪 唑的Tris-HCl (pH7.8)緩沖液洗脱，收集洗脱液；(7) 往含BMP-2融合蛋白的洗脱液中，加入终浓度lmM的二乙胺四乙 酸，以及肠激酶5U/mL， 25。C下进行酶切，蛋白酶酶切融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。 本发明首先要把DsbA信号肽基因的去除，以实现DsbA的胞内表达，二 石克键形成蛋白A (disulfide bond formation protein A, DsbA)是大肠杆菌周质胞 腔中辅助多种含有二疏键的蛋白质正确折叠并具有生物学活性的一种二石克键 异构酶.于1991年由Bardwe11发现,是该家族中第一个被发现的蛋白质，它存在 于E. coli周质空间(periplasm)中,具有最强的氧化性，分子量为21 kD. DsbA能 催化周质空间内的蛋白质形成二硫键，而且具有很好的溶解性。天然的DsbA 基因含有信号肽基因，指导DsbA分泌至具有氧化环境的周质空间。含有七个 半胱氨酸残基的BMP-2融合蛋白在具有氧化环境的周质空间表达会通过二硫 键形成多聚体。为了使DsbA融合蛋白在缺乏氧化环境的胞内表达，必须删除 其编码信号肽第2-18氨基酸残基的DNA片段，保留第一个氨基酸甲硫氨酸 密码子ATG作为翻译其始密码子。设计5，突变引物，以携带DsbA基因的pET39为模板，利用PCR技术 扩增得到不含信号肽基因的编码DsbA的DNA片段，利用限制性内切酶TWfeI 和ApTI将突变后DNA重组于pET39中，得到质粒pET39 ( SP-)构建编码 "DsbA-Linker-6His-Eksite-BMP-2"融合蛋白的工程菌为了使融合蛋白的两个 主要部分在空间上相互独立，在DsbA的C端设计GSGSG作为连接肽(G、 S分别是甘氨酸、丝氨酸的单字母缩写)。为了方便融合蛋白的分离纯化，在 Linker的C端设计6His亲和标签，为表达产物可用N严亲和层析分离纯化创 造条件。为了获得与天然BMP-2氨基酸序列完全一致的产物，在BMP-2的N 端设计肠激酶的识别位点(DDDDK)(D、 K分别是天冬氨酸、赖氨酸的单字 母缩写)。由于实验室已经拥有编码BMP-2的基因，为了构建该工程菌，在已经删除DsbA信号肽基因的J^出上，利用DsbA基因3，末端含有的^; TI 位点，设计编码"Linker-6His-Eksite"的DNA与编码BMP-2的基因拼接，利 用限制性内切酶^pTI和BamHI将突变后DNA重组于pET39 ( SP (-)中。 重组质粒转化表达宿主五.coZ/BL21 (DE3)得到工程菌。工程菌的表达与表达产物的分离纯化，工程菌在含有抗生素的LB培养基 中生长至OD6oo=0.5左右，加入终浓度为O.l-lmM的IPTG，使目的基因表达， 工程菌细胞经超声破菌后12000rpm离心，利用SDS-PAGE分析沉淀和上清， 确定融合蛋白的溶解性。可溶的融合蛋白经N严亲和层析一步分离纯化，可得到纯度大于95%的 BMP-2融合蛋白。BMP-2成熟肽单体的获得，用重组肠激酶酶切融合蛋白，由于BMP-2成 熟肽在水溶液中的溶解度很小，在酶切过程中出现沉淀现象，离心分离后， DsbA担体和肠激酶在上清液中，大部分BMP-2成熟肽单体在沉淀中，从而 成功得到BMP-2成熟肽单体，BMP-2成熟肽单体可用于复性法制备具有生物 学活性的二聚体。利用本发明方法，可以得到与天然BMP-2氨基酸序列完全一致的BMP-2 成熟肽。而且采用融合表达策略以后，融合蛋白溶解性好，含有亲和层析的 标签，可以用N产亲和纯化的方法分离纯化融合蛋白，纯度可达950/。以上。 酶切后BMP-2成熟肽单体由于在水溶液中的溶解度小而沉淀出来，可以用简 单的离心分离目标蛋白和融合伴侣(DsbA担体蛋白)。本发明与现有技术相比，其有益效果体现在用本发明方法制得的产物 与天然BMP-2成熟肽氨基酸序列完全一致；融合表达实现可溶性表达，融合 蛋白可以用N产亲和层析一步纯化，进一步简化了 BMP-2复性前的纯化步骤。(四)


图1为重组质粒pETDsbA-BMP的质粒图谱。(五)
具体实施例方式以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此实施例l: DsbA信号肽基因的去除引物设计DsbA-l: 5, AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT 3， 24bpDsbA-2: 5' TCGCTTAAGTATTTCACTGT 3' 20bp PCR模板pET39质粒 PCR参数 94 。C 3min94°C 30s 40匸30s 72°C lmin 3个循环 94°C 30s 48°C 30s 72°C lmin 27个循环 72 。C lOmin 4°C lOmin以AWel和5s; TI酶切PCR产物和pET39质粒，使不含信号肽基因的DNA 片段置换pET39中原有的DsbA基因，获得的重组质粒命名为pET39 ( SP-)。实施例2:编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2"基因的获得首先根据大肠杆菌偏爱密码子设计编码"Linker-6His-Eksite"的DNA片 段，序列如下ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCAT CATCATCATCATGATGACGATGACAAA，其中划线部分为仏/ TI识别序列。 为了使该DNA片段与BMP-2基因顺利拼接，设计以下四条引物，以SOE技术进行拼接。引物Linker-1:5， ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCAT 3， 46bp引物Linker-2:5， TTGCTTATGCTTTGCTTGTTTGTCATCGTCATCATGATGATGATGATGAT GACC3， 54 bp 引物BMP2-1:5， GACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAA 3， 30 bp 引物BMP2-2:5' TTCGGATCCTTAGCGACAGCCACAACCTT 3' 30 bp 操作方法由于引物Linker-l和引物Linker-2有18bp反向互补，取浓度为10uM 的引物Linker-1和Link-2各2uL，加入2uL dNTP， 5uL 10X DNA Polymerase Buffer,补ddH20至50uL反应体系，沸水浴10min，放入50。C水浴冷却 3min,补加2.5U Pfii DNA polymerase,转入72水浴10min，使两个引物 互为模板，形成DNA双链。反应产物命名为产物A。BMP-2基因的重新扩增以引物BMP2-1和BMP2-2作为正反向引物， 以实验室已经得到的BMP-2基因为模板进行PCR扩增，退火温度设为50 。C，延伸时间30s，得到的产物命名为产物B。基因拼接以产物A和产物B作为PCR模板，以引物Linker-l和BMP2-2 作为正反向引物进行基因拼接，反应体系和反应参数如下 PCR参数 94 X: 3min94"C 30s 60°C 30s 72°C lmin 30个循环72 °C 10min 4°C 10min得到的PCR产物命名为产物C,为编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的 DNA片段。实施例3:工程菌构建以j^/ TI和JSamffl酶切产物C，按常规分子生物学技术重组于pET39( SP-) 中，得到重组质粒pETDsbA-BMP(质粒图傳见图1 )，重组质粒pETDsbA-BMP 转化五.co&BL21 (DE3)，经测序鉴定后保存该工程菌。用于表达研究和生产。实施例4: "DsbA-Linker-6His-Eksite-BMP-2"融合蛋白的胞内表达试验用无菌牙签挑取阳性克隆的单菌落于含有50ug/mL卡那霉素的3mL LB培养基中，30 。C、 200r/min培养16小时，得工程菌种子液。培养好的工程菌种子液按1%的接种量接种到摇瓶装液量为20 %的Luria-Bertani培养基中，30 。C、 200 r/min培养到(9￡)600约0.5时，添加诱导剂 IPTG至终浓度为0.2mM,诱导外源基因表达，在30。C温度下继续培养3h。 收集菌体作全菌SDS-PAGE分析，可得到表观分子量为36kD的表达产物。实施例5:融合蛋白的溶解性分析以及分离纯化发酵结束后，以3000rpm转速离心收集工程菌细胞，以20mM Tris-HCl pH8.0緩冲液重悬菌体，超声破菌后，以离心12000rpm转速离心，分别收集 沉淀和上请，沉淀以4MUrea, O.lMNaCl溶液溶解，以SDS-PAGE分析沉淀 和上清夜目标蛋白的含量，本发明中，融合蛋白主要存在于上清液中，说明 融合蛋白以可溶的形式存在于工程菌细胞中。(1) 融合蛋白的分离纯化由于融合蛋白含有6His亲和纯化标签，融合蛋白可以特异性地吸附于Ni2+ 螯合柱上，以50mM咪唑緩冲液预洗脱，以含咪唑150mM的Tris-HCl、 pH7.8緩冲液洗脱目标蛋白，收集洗脱液；(2) 融合蛋白的酶切以及BMP-2成熟肽单体的获得在N严螯合亲和层析的含有融合蛋白的洗脱液中，加入终浓度为lmM 的EDTA和5U/mL的肠激酶，在25。C条件下进行酶切，在酶切过程中释 放出BMP-2成熟肽单体，由于BMP-2成熟肽单体的溶解性很小，酶切过 程中溶液由澄清逐渐变为浑浊。 酶切结束后，以大于5000rpm的转速离心收集沉淀，用20mM Tris-HCl 洗涤沉淀一次，沉淀为纯度大于90。/。的BMP-2成熟肽单体，该单体可用于进 一步复性以制备具有生物学活性的重组同源二聚体。BMP-2成熟肽单体的N-端15个氨基酸序列测定结果为N-Gln Ala Lys His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys，与天然的BMP-2成熟肽N-端氨 基酸序列完全一致。实施例6:以得到的BMP-2成熟肽单体体外复性获得同源二聚体用含有8M尿素、10mM 二硫苏糖醇(DDT )、 5mM EDTA的Tris-HCl pH8.5 的緩冲液溶解BMP-2单体沉淀，室温下磁力搅拌2小时，以稀释法复性，复 性体系主要物质的终浓度如下0.5ML-精氨酸、O.IM氯化钠、0.5M尿素、 lmM还原型谷胱甘肽GSH、 O.lmM氧化型谷胱甘肽GSSG。在4-10。C冰箱放 置24小时以上，以非还原性SDS-PAGE分析二聚体的形成情况，随着复性时 间的延长，表观分子量为25kD的蛋白质逐渐增多。以还原性SDS-PAGE分析 时该条带消失，可以推断表观分子量为25kD的蛋白质为BMP-2成熟肽的二聚体。实施例7:基因测序分析经检测，本发明所得BMP-2融合蛋白的基因序列如下(划线部分为BMP-2 成熟肽基因)ATGGCGCAGTATGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAAC CGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCTTTCTTCTGCCCG CACTGCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAA AAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATG GGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATG GCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTA CAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATC AACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGACGTGGAACAGCTTC GTGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTG CAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAA TCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGTTTGTTCAGCAGTATGCTGATATCATCATCATGATGACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAACGGAAGAGGCTGAAATCCTCCTGCAAAAGACATCCGCTGTATGTGGATTTTAGCGATGTGGGCTGGAACGATTGGATTGTGGCGCCGCCGGGCTATCATGCGTTTTATTGCCATGGCGAATGCCCGTTTCCGCTGGCGGATCATCTGAACTCCACCAACCATGCGATTGTGCAGACCCTGGTGAACTCTGTGAACAGCAAAATTCCGAAAGCGTGCTGTGTGCCGACCGAACTGAGCGCGATTTCGATGCTGTATCTGGATGAAAACGAAAAAGTGGTGCTGAAAAACTATCAGGATATGGTGGTGGAAGGTTGTGGCTGTCGCTAA:本发明所得BMP-2融合蛋白的氨基酸序列如下(划线部分为BMP-2成熟 肽氨基酸)MAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFCPHCYQFEEVLHISDNVKKKYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVOTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLD ENEKVVLKNYODMVVEGCGCR* :结论用本发明方法制得的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽与天然BMP-2 成熟肽氨基酸序列完全一致。序列表.ST25SEQUENCE LISTING<110><120〉<130><160><170><210> <211〉 <212> <213><220> <223>浙江工业大学一种制备骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的方法 8Patentlri version 3. 2 165 DNAUnknown 人工序列<400〉 1atacttaagc gagaaaaaag gttctggttc tggtcatcat catcatcatc ettgatgacga 60 tgaca 65<210〉 2<211〉 46<212> DNA <213〉人工序列<■〉 2atacttaagc gagaaaaaag gttctggttc tggtcatcat catcat 46<210> 3 <211〉 54 <212〉 DNA <213〉人工序列<400> 3 一—ttgcttatgc tttgcttgtt tgtcatcgtc atcatgatga tgatgatgat gacc 54<210〉 4<211〉 30<212> DNA <213〉人工序列<400> 4gacgatgaca aacaagcaaa gcataagcaa 30<210〉 5<211〉 29<212> DNA <213>人工序列<400> 5ttcggatcct tagcgacagc cacaacctt 29<210〉 6<211〉 957<212> DNA <213>人工合成<400> 6atggcgcagt atgaagatgg taaacagtac actaccctgg aaaaaccggt 3gctggcgcg 60ccgcaagtgc tggagttttt ctctttcttc tgcccgcact gctatcagtt tgaagaagtt 120ctgcatattt ctgataatgt gaagaaaaaa ctgccggaag gcgtgaagat gactasatac 180cacgtcaact tcatgggtgg tgacctgggc aaagatctga ctcaggcatg ggctgtggcg 240atggcgctgggcgtggaagacaaagtgactgttccgctgtttgaaggcgt300cagaccattcgttctgcttctgatatccgcgatgtatttatcaacgcaggtattaaaggt360gaagagtacgacgcgacgtggaacagcttcgtggtga幼tctctggtcgctc8gcaggaa420aaagctgcagctgacgtgcaattgcgtggcgUccggcgatgtttgttaacggtaaatat480cagctgaatccgcsgggtatggataccagcaatatgtttgttcagcagtatgctgataca540gtgaaatacttaagcgagaaaaaaggttctggttctggtcatcatcatcatcatcatgat600gacgatgaca幼CEiaigcaaeigcataagcaacgga卿ggctgaaatcctcctgcaa幼ga660catccgctgtatgtggattttagcgatgtgggctgg咖gattggattgtggcgccgccg720ggctatcatgcgttttattgccatggcgaatgcccgtttccgctggcggatcatctgaac780tccaccaaccatgcgattgtgcagaccctggtgaactctgtgaacagcaa840gcgtgctgtgtgccgaccgaactgagcgcgatttcgatgctgtatctgga900aaagtggtgctgaaaaactatcaggatatggtggtggaaggttgtggctgtcgctaa957<210> 7<211> 318<212> PRT <213>人工合成<400> 7Met Ala Gin Tyr Glu Asp Gly Lys Gin Tyr Thr Thr Leu Glu Lys Pro1510 15Val Ala Gly Ala Pro Gin Val Leu Glu Phe Phe Ser Phe Phe Cys Pro2025 30His Cys Tyr Gin Phe Glu Glu Val Leu His lie Ser Asp Asn Val Lys3540 45Lys Lys Leu Pro Glu Gly Val Lys Met Thr Lys Tyr His Val Asn Phe5055 60Met Gly Gly Asp Leu Gly Lys Asp Leu Thr Gin Ala Trp Ala Val Ala6570 75 80Met Ala Leu Gly Val Glu Asp Lys Val Thr Val Pro Leu Phe Glu Gly8590 95Val Gin Lys Thr Gin Thr lie Arg Ser Ala Ser Asp lie Arg Asp Val100105 110Phe lie Asn Ala Gly lie Lys Gly Glu Glu Tyr Asp Ala Thr Trp Asn115120 125Ser Phe Val Val Lys Ser Leu Val Ala Gin Gin Glu Lys Ala Ala Ala130135 140Asp Val Gin Leu Arg Gly Val Pro Ala Met Phe Val Asn Gly Lys Tyr145150 155 160Gin Leu Asn Pro Gin Gly Met Asp Thr Ser Asn Met Phe Val Gin Gin165170 175Tyr Ala Asp Thr Val Lys Tyr Leu Ser Glu Lys Lys Gly Ser Gly Ser 180 185 190Gly His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gin Ala Lys His 195 200 205Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr 210 215 220Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp lie Val Ala Pro Pro225 230235240Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala 245 250 255Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala lie Val Gin Thr Leu Val Asn 260 265 270Ser Val Asn Ser Lys lie Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu 275 280 285Ser Ala lie Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu 290 295 300Lys Asn Tyr Gin Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 305 310 315<210〉 <211> <212> <213><220〉 <223><400>815PRTUnknown人工合成 8Gin Ala Lys His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 15 10 1权利要求
1. 一种骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述方法包括如下顺序步骤(1)删除DsbA基因信号肽第2～18个氨基酸编码基因，保留第一个甲硫氨酸的密码子作为起始密码子，得到编码不含信号肽的DsbA的DNA片段，将该片段重组于表达载体中，获得重组质粒1；(2)将编码骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重组于重组质粒1中DsbA基因的下游，获得重组质粒2；(3)将重组质粒2转化入宿主菌株的菌体中，得到工程菌，所述宿主菌为无硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主的DE3溶原菌；(4)工程菌在含有抗生素的培养基中培养，添加诱导剂使目的基因表达；(5)工程菌细胞经破菌，分离纯化得到BMP-2融合蛋白；(6)蛋白酶酶切BMP-2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。
2. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其 特征在于所述步骤(1)中所述DsbA基因来自质粒pET39。
3. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其 特征在于所述步骤(3)中宿主菌林为大肠杆菌BL21(DE3)。
4. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中目的基因的表达在缺乏氧化环境条件下进行。
5. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其 特征在于所述步骤(6)中蛋白酶为下列之一肠激酶，重组肠激酶 轻链。
6. 如权利要求1~5之一所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方 法，其特征在于所述步骤(2)中，重组质粒2中骨形态发生蛋白BMP-2 完整成熟肽的DNA与DsbA基因的下游之间，还重组有编码"Linker-6His-蛋白酶识别位点"的序列。
7. 如权利要求6所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其 特征在于所述蛋白酶识别位点为肠激酶或凝血因子。
8. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其 特征在于所述方法按如下顺序步骤进行(1)以含有DsbA基因的质粒pET39作为PCR模板，利用PCR技 术删除pET39中的DsbA信号肽基因第2 18个氨基酸编码基 因，保留第一个曱硫氨酸的密码子作为起始密码子，获得的 DNA片段重组于表达载体中，获得重组质粒l: pET39(SP-);(2 )将骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重组于重组质粒 1中DsbA基因的下游，获得重组质粒2: pET39(SP-BMP-2);(3) 将重组质粒2: pET39 (SP-BMP-2)转化入宿主菌株大肠杆菌 的菌体中，得到工程菌；(4) 工程菌在Luria-Bertani培养基中培养，^f吏目标融合蛋白得到表 达；(5) 工程菌细胞经破菌，分离纯化得到BMP-2融合蛋白；(6) 以肠激酶酶切BMP-2融合蛋白，经分离得到所迷的骨形态发生 蛋白BMP-2成熟肽。
9.如权利要求8所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其 特征在于所述方法按如下顺序步骤进行(1)以含有DsbA基因的质粒pET39为模板，删除该质粒中的DsbA 信号肽基因第2-18个氨基酸编码基因，保留第一个曱硫氨酸的密码 子作为起始密码子，得到的片段重组于表达栽体中，获得重组质粒1: pET39 ( SP-);(2 )将编码"Linker-6His-Eksite"的DNA片段与编码骨形态发生蛋 白BMP-2成熟肽的DNA拼接，获得编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2" 的DNA片段；再将编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片段 重组于重组质粒l: pET39(SP-)中DsbA基因的下游，获得重组质 粒2: pET39 ( SP誦BMP-2 );(3 )将重组质粒2: pET39 ( SP- BMP-2 )转化入宿主菌林BL21(DE3)的菌体中，得到工程菌；(4 )工程菌在Luria-Bertani培养基中，30°C 、 200 r/min培养到OD600 约0.5时，添加终浓度为O.l-lmM i秀导剂异丙基辟"戈-p-D-半乳泮唐 苷，30-37匸下继续培养2 10h,使目的基因表达；(5)发酵结束后，离心收集工程菌细胞，破菌后，离心，收集上清 液过含N产的螯合柱，以50mM咪唑緩沖液预洗脱，以含咪唑 120~150mM的緩冲液洗脱目标蛋白，收集洗脱液；(6 )往含BMP-2融合蛋白的洗脱液中，加入终浓度O.l-lmM的二乙胺四乙酸，以及肠激酶5U/mL， 25。C下进行酶切，蛋白酶酶切融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。
10.如权利要求8所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述方法按如下顺序步骤进行(1)以含有DsbA基因的质粒pET39为模版，引物DsbA-l: 5， -AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，，DsbA-2: 5， -TCGCTTAAGTATTTCACTGT画3，， PCR参数94 °C 3min94X: 30s 40。C 30s 72°C lmin3个循环 94€ 30s 48°C 30s 72°C lmin 27个循环 721: lOmin 4。C lOmin以iV&I和仏; TI酶切PCR产物和pET39质粒，使不含信号肽基 因的DNA片段置换pET39中原有的DsbA基因，获得不含DsbA信 号肽基因的重组质粒l: pET39(SP-); (2)将编码 "Linker-6His-Eksite " 的 DNA 片段 ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCA TCATCATGATGACGATGACAAA,其中CTTAAG为丑spTI识别序列， 与编码骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的DNA拼接，获得编码 "Linker-6His國Eksite-BMP國2"的DNA片段引物Linker-1: 5 ，-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTC ATC ATC ATC AT國3' 引物Linker-2: 5， -TTGCTTATGCTTTGCTTGTTTGTCATCGTCATCATGATGATGATGATGATGACC 3， 亏i物BMP2-1: 5 ，-GACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAA-3 ， 引物BMP2-2: 5，-TTCGGATCCTTAGCGACAGCCACAACCTT-3，取浓度为lOuM的引物Linker-l和Link-2各2uL,加入2uL dNTP， 5uL 10 xDNA Polymerase Buffer,补ddH20至50uL反应体系，沸水浴 10min,放入50。C水浴冷却3min，补加2.5U PfU DNA polymerase,转 入72水浴10min，使两个引物互为才莫板，形成DNA双链，得到反应 产物A;以引物BMP2-1和BMP2-2作为正反向引物，以BMP-2基因为模 板进行PCR扩增，退火温度设为50。C，延伸时间30s,得到反应产物 B;以产物A和产物B作为PCR模板，以引物Linker-l和BMP2-2作 为正反向引物进行基因拼接，获得编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2" 的DNA片段，反应体系和反应参数如下 PCR参数94 °C 3min94°C 30s 60°C 30s 72°C lmin 30个循环 72 °C lOmin 4。C lOmin ;(3) 将编码"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片^殳重组于重组 质粒pET39( SP-)中DsbA基因的下游，获得重组质粒2: pET39(SP誦BMP-2 );(4) 将重组质粒2: pET39( SP- BMP-2 )转化入宿主菌林Eco" BL21(DE3)的菌体中，得到工程菌； (5 )工程菌在Luria-Bertani培养基中经种子培养得工程菌种子液， 培养好的工程菌种子液按1%的接种量接种到摇瓶装液量为20 %的Luria-Bertani培养基发酵培养，30°C、 200 r/min培养到 OD6。。约为0.5时添加诱导剂异丙基琉代-p-D-半乳糖苷至终浓 度为0.2mM， 30X:温度下继续培养3h,使目的基因表达；(6) 发酵结束后，离心收集工程菌细胞，超声破菌后，离心，收集 上清液过含N产的螯合柱，以50mM咪唑緩沖液预洗脱，以含 150mM咪唑的Tris-HCl、 pH7.8緩沖液洗脱，收集洗脱液；(7) 往含BMP-2融合蛋白的洗脱液中，加入终浓度lmM的二乙胺 四乙酸，以及肠激酶5U/mL， 25。C下进行酶切，蛋白酶酶切融 合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。
全文摘要
本发明提供了一种制备重组骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的方法删除DsbA基因信号肽第2～18个氨基酸编码基因，保留第一个甲硫氨酸的密码子作为起始密码子，得到片段重组于表达载体中，获得的重组质粒1；将骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重组于重组质粒1中DsbA基因的下游，获得重组质粒2；将重组质粒2转化入表达宿主菌株的菌体中，得到工程菌经培养、添加诱导剂使目的基因表达，破菌、分离纯化得到DsbA-BMP-2融合蛋白，蛋白酶酶切DsbA-BMP-2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。本发明方法制得的产物可与天然BMP-2成熟肽氨基酸序列完全一致，实现可溶性胞内融合表达，融合蛋白可以用Ni²⁺亲和层析一步纯化，进一步简化了BMP-2复性前的纯化步骤。
文档编号C12P21/02GK101235084SQ200710067138
公开日2008年8月6日 申请日期2007年1月31日 优先权日2007年1月31日
发明者于真真, 付水星, 任慧颖, 伟 徐, 林陈水, 明 许, 郑小玲, 钱俊青, 黎小军 申请人:浙江工业大学