专利名称：李斯特菌种别及毒力快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及食品中致病性李斯特菌的鉴定、动物李斯特菌病诊断及细菌分类进化的研究。建立基于多重PCR的鉴别李斯特菌各个种并区分单增李斯特菌毒力强弱的快速检测技术，即李斯特菌种别及毒力快速检测试剂盒。
背景技术：
李斯特菌属(Listeria)细菌分布广泛，对环境的耐受性较强。根据基因组序列、毒力及分解糖的能力等，可将其分为6个种，即单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，简称单增李斯特菌)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)和格氏李斯特菌(Listeria grayi)，其中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌为主要的致病种。单增李斯特菌是重要的食源性人兽共患病原菌，可引发胃肠炎、败血症、脑膜炎和流产等，2000年即被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一，其危害严重性可见一斑。但单增李斯特菌菌株间的毒力差异较大，弱毒株具有一些独特的分子特征。而伊氏李斯特菌主要危害动物，特别是反刍兽，常表现为败血症和流产。无害李斯特菌、塞氏李斯特菌和格氏李斯特菌也曾有引起人严重菌血症、化脓性脑膜炎和眼结膜炎的报道，但不常见。在食品中任何一种李斯特菌的存在，均被认为是卫生状况不良的指示，但危害严重性不同。李斯特菌家族并不庞大，且不同种的毒力与基因组区别明显，因此李斯特菌又是研究毒力分子进化的优良模型。
李斯特菌检测方法有微量生化反应和血清学方法等，均存在操作费时、费力，且试验结果差异较大等弊端。目前国内外已建立了一些检测李斯特菌属及单增李斯特菌的分子生物学方法，但对非单增李斯特菌及单增李斯特菌不同毒力株鉴别的研究极少，迄今为止，可同时鉴定李斯特菌各个种并区分单增李斯特菌毒力强弱的方法尚无报道。本发明通过对新基因lmo0038的分析、引物的选择以及检测条件的优化，设计一种准确、灵敏、快速的多重PCR检测试剂盒，以期填补上述的空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测试剂盒，由四个含有不同成分的冻存管和100个PCR管及加样及检测步骤说明组成，可进行100次检测。
本发明的李斯特菌种别及毒力快速检测试剂盒由代号为A、B、C、D、E、F、G、H、I和J十个含不同成分的冻存管和100个PCR反应管及检测步骤说明书组成；冻存管A装有Taq DNA polymerase，10×buffer，dNTP，引物；冻存管B装有裂解buffer溶液1mL；冻存管C～I分别装有0.5mL不同的阳性对照溶液，C管为单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)强毒灭活株，D管为单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)弱毒灭活株，E管为无害李斯特菌(Listeria innocua)，F管为伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)，G管为塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)，H管为威氏李斯特菌(Listeriawelshimer)，I管为格氏李斯特菌(Listeria grayi)；冻存管J装有0.58mL稀释液。上述引物LM、LN、LS、LVSW、LGU、Ld、lmo0038-1、lmo0038-2的序列如下LM AAACTGCTAACACAGCTACTLN TAGCACTCCAGTTGTTAAACLS CACAAGCGGCTCCTGCTCAACLGUCTGCGAAACCAGCAGTTTCTLVSW AACTGAGGTAGCGAGCGAALd ATACGCGACCGAAGCCAAClmo0038-1 TTTCAATTATGTACGCCCAGGTGTlmo0038-2 AATATTTCCGCCGCCAAGTAA李斯特菌种别及毒力快速检测试剂盒的检测步骤如下(1)将冻存管J中0.58mL溶液加至冻存管A，重悬；(2)将冻存管B中的溶液10μL加入PCR反应管，再将冻存管C～I中的阳性对照溶液5μL或待检样品(菌液或模板均可)5μL加至同一PCR反应管，混合均匀，最后将(1)中冻存管A的溶液5.8μL加入上述同一PCR反应管，立即检测；(3)将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增95℃ 3min；95℃ 45s，62℃30s，72℃ 1min，25个循环；72℃ 5min；(4)将扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析；(5)结果判定检测后，待检样品与阳性对照溶液C同时扩增出720bp、403bp两条条带的为Listeria monocytogenes强毒株阳性(图1-A)；待检样品与阳性对照溶液D同时扩增出720bp条带的为Listeria monocytogenes弱毒株阳性(图1-B)；待检样品与阳性对照溶液E同时扩增出986bp条带的为Listeria innocua阳性(图1-C)；待检样品与阳性对照溶液F同时扩增出1357bp、403bp两条条带的为Listeria ivanovii阳性(图1-D)；待检样品与阳性对照溶液G同时扩增出1108bp条带的为Listeria seeligeri阳性(图1-E)；待检样品与阳性对照溶液H同时扩增出1363bp条带的为Listeria welshimeri阳性(图1-F)；待检样品与阳性对溶液I同时扩增出479bp条带的为Listeria grayi阳性(图1-G)；阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为待检样品阴性(图1-H)；两者均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定(图1-I，J)。
图1为结果判定示意图
M.2000bp DNALadder Marker，1.阳性对照品，2.待检样品。
图2lmo0035-lmo0042长距离PCR扩增产物电泳图(一)M.2000bp DNA Ladder Marke，1.单增李斯特菌强毒灭活株，2.伊氏李斯特菌，3.无害李斯特菌，4.单增李斯特菌弱毒灭活株，5.塞氏李斯特菌，6.威氏李斯特菌，7.格氏李斯特菌。
图3lmo0035-lmo0042长距离PCR扩增产物电泳图(二)M.2000bp DNA Ladder Marker，1.无害李斯特菌，2.单增李斯特菌弱毒灭活株(F2525)，3.单增李斯特菌弱毒灭活株(54006)，4.单增李斯特菌强毒灭活株(EGD-e)。
图4lmo0029-lmo0042长距离PCR扩增产物电泳图M.2000bp DNALadder Marker，1.威氏李斯特菌，2.塞氏李斯特菌，3.格氏李斯特菌。
图5为多重PCR扩增产物电泳图M.2000bp DNA Ladder Marker，1.单增李斯特菌强毒灭活株，2.无害李斯特菌，3.伊氏李斯特菌，4.威氏李斯特菌，5.塞氏李斯特菌，6.格氏李斯特菌，7.格氏李斯特菌默氏亚种，8.单增李斯特菌弱毒灭活株。
图6为本试剂盒检测灵敏度-单增李斯特菌不同细菌量扩增产物电泳图M.2000bp DNA Ladder Marker，1.109CFU/mL，2.108CFU/mL，3.107CFU/mL，4.106CFU/mL，5.105CFU/mL，6.104CFU/mL，7.103CFU/mL，8.102CFU/mL，9.10CFU/mL。
图7为本试剂盒检测灵敏度-无害李斯特菌不同细菌量扩增产物电泳图M.2000bp DNA Ladder Marker，1.1.7×109CFU/mL，2.1.7×108CFU/mL，3.1.7×107CFU/mL，4.1.7×106CFU/mL，5.1.7×105CFU/mL，6.1.7×104CFU/mL，7.1.7×103CFU/mL，8.1.7×102CFU/mL，9.1.7×10CFU/mL。
图8为本试剂盒检测灵敏度-伊氏李斯特菌不同细菌量扩增产物电泳图M.2000bp DNA Ladder Marker，1.9×109CFU/mL，2.9×108CFU/mL，3.9×107CFU/mL，4.9×106CFU/mL，5.9×105CFU/mL，6.9×104CFU/mL，7.9×103CFU/mL，8.9×102CFU/mL，9.9×10CFU/mL。
图9为本试剂盒检测灵敏度-威氏李斯特菌不同细菌量扩增产物电泳图M.2000bp DNA Ladder Marker，1.1.1×109CFU/mL，2.1.1×108CFU/mL，3.1.1×107CFU/mL，4.1.1×106CFU/mL，5.1.1×105CFU/mL，6.1.1×104CFU/mL，7.1.1×103CFU/mL，8.1.1×102CFU/mL，9.1.1×10CFU/mL。
图10为本试剂盒检测灵敏度-塞氏李斯特菌不同细菌量扩增产物电泳图M.2000bp DNA Ladder Marker，1.109CFU/mL，2.108CFU/mL，3.107CFU/mL，4.106CFU/mL，5.105CFU/mL，6.104CFU/mL，7.103CFU/mL，8.102CFU/mL，9.10CFU/mL。
图11为本试剂盒检测灵敏度-格氏李斯特菌不同细菌量扩增产物电泳图M.2000bp DNA Ladder Marker，1.4.6×109CFU/mL，2.4.6×108CFU/mL，3.4.6×107CFU/mL，4.4.6×106CFU/mL，5.4.6×105CFU/mL，6.4.6×104CFU/mL，7.4.6×103CFU/mL，8.4.6×102CFU/mL，9.4.6×10CFU/mL。
图12为多重PCR抗干扰试验电泳图(一)M.2000bp DNA Ladder Marker，1.单增李斯特菌/无害李斯特菌，2.单增李斯特菌/伊氏李斯特菌，3.单增李斯特菌/威氏李斯特菌，4.单增李斯特菌/塞氏李斯特菌，5.单增李斯特菌/格氏李斯特菌，6.伊氏李斯特菌/无害李斯特菌，7.伊氏李斯特菌/威氏李斯特菌，8.伊氏李斯特菌/塞氏李斯特菌。
图13为多重PCR抗干扰试验电泳图(二)M.2000bp DNA Ladder Marker，1.无害李斯特菌/威氏李斯特菌，2.无害李斯特菌/塞氏李斯特菌，3.威氏李斯特菌/塞氏李斯特菌，4.无害李斯特菌/格氏李斯特菌，5.伊氏李斯特菌/格氏李斯特菌，6.威氏李斯特菌/格氏李斯特菌，7.塞氏李斯特菌/格氏李斯特菌，8.空白对照。
具体实施例方式
一、冻存管组成A管为冻干粉，含有10×buffer(市购)，dNTP(市购)；引物(序列由发明人设计，见表1)LM、LN、LS、LVSW、LGU、Ld、lmo0038-1、lmo0038-2；Taq DNA polymerase(市购)。保存于-20℃。
B管含有裂解buffer溶液1mL，保存于-20℃。
C-I管含有0.5mL溶液，为七种阳性对照品，保存于-20℃。
D管含有0.58mL溶液，为稀释液。
二、加样及检测步骤说明1、将D管中0.58mL溶液加至A管，重悬。
2、将B管溶液10μL加入PCR反应管，再次将C-I管中阳性对照溶液5μL或待检样品(菌液或模板均可)5μL加至同一PCR反应管，混合均匀，最后将1中的溶液5.8μL加入上述同一PCR反应管，立即检测。
3、将1按以下反应条件在PCR仪上进行扩增95℃ 3min；95℃ 45s，62℃ 30s，72℃ 1min，25个循环；72℃ 5min。
4、将2反应后的产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析。
下面通过试验对本发明的使用效果进行论证和描述。
1材料与方法1.1菌株及培养李斯特菌参考菌株部分购自ATCC、NCTC及中国药品生物制品检定所，部分由丹麦国立兽医研究所M.Jakobsen博士惠赠(详见表1)。119株经李斯特菌选择性显色培养基(CHROMagar，法国科玛嘉)初步筛选出的李斯特菌食品相关分离株分离自中国浙江、福建、江苏等地，由浙江大学动物预防医学研究所保存。与李斯特菌亲缘关系较近、G+C含量低的革兰氏阳性菌(G+low)如蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、猪链球菌(Streptococcussuis)、马链球菌兽疫亚种(C群)(Streptococcus.equi subsp.zooepidemicus)、嗜酸性乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)以及其他12种阴性对照菌株亦由本研究所保存(详见表1)。各菌株接种于5mL BHI(DIFCO)培养基，37℃振荡培养过夜。
表1 李斯特菌参考菌株及阴性对照菌株
1.2 DNA模板制备取1mL培养物，离心收集沉淀，双蒸水(Millipore)吹洗后，用等体积2×TZ和双蒸水重悬，-20℃静置45min。于沸水中作用8min后立即置冰浴中冷却7min，12000rpm 4℃离心1min，取上清保存于-20℃备用。
1.3小鼠LD506-8周龄ICR雌性小鼠(20-22g)购自浙江中医药大学实验动物中心，适应3天后攻毒。每一菌株设6个剂量组，每组6只。细菌过夜培养后，8000rpm离心以收集菌体，用PBS(0.01M，pH7.2)调整细菌数至1010左右，并进行一系列的十倍梯度稀释，以0.1mL的剂量腹腔注射；同时，设一对照组注射0.1mL PBS，另一对照组不注射。攻毒后连续观察10天，根据各组的小鼠死亡率、按改良寇氏法计算出各菌株的LD50。
1.4 lmo0038全基因及其两侧序列的测定及分析设计引物扩增单增李斯特菌lmo0038及伊氏李斯特菌同源区(i-lmo0038)的全长序列。扩增产物割胶回收纯化后，按照T-A克隆策略连接至pMD18-T载体中，并热击法转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α。重组质粒通过PCR和EcoR I、HindIII双酶切鉴定后，将阳性克隆送往上海英骏生物技术有限公司测序。所测序列由Clustal X(version 1.8)软件分析。
单增李斯特菌lmo0035-0042、lmo0029-0042及其他种的同源区序列通过长距离PCR扩增，长距离酶(LA Taq DNA polymerase)购自TaKaRa生物技术有限公司。引物详见表2。
表2 引物序列及产物长度(一)
注v表示产物长度因种别不同而变化1.5 PCR体系建立1.5.1引物设计根据测出的lmo0038全序列，设计引物lmo0038-1/lmo0038-2。通过对iap序列内保守区和可变区的分析，并参照相关文献，设计五条上游引物(LM、LN、LVSW、LGU、LS)与下游引物(Ld)竞争结合。引物序列详见表3。
1.5.2 PCR反应体系及条件通过PCR体系及条件的优化，确定多重PCR反应体系为10×Taq Buffer(含Mg2+)3μL，10mmol/L dNTP Mix 0.6μL，50μM引物各0.6μL，DNA模板(或菌液)2μL，Taq DNApolymerase 0.8μL，加ddH2O补足体积至30μL；反应条件为95℃ 3min；95℃ 45s，62℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。
1.5.3 PCR产物测序鉴定按1.3所述方法，将PCR产物进行克隆、测序。
1.5.4特异性试验以蜡状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、马链球菌兽疫亚种(C群)、嗜酸性乳酸杆菌、弯曲乳酸杆菌等20种细菌以及双蒸水作为阴性对照和空白对照，用建立的PCR方法进行扩增。
1.5.5敏感性试验李斯特菌各个种的参考菌株在BHI中37℃过夜培养后，取1mL菌液离心并用PBS(0.01M，pH7.2)重悬，调整菌液浓度至109CFU/mL(OD600约为0.18-0.2)，作10倍连续梯度稀释。选取10-5、10-6、10-7、10-8稀释度进行平板计数，并取各稀释度的菌液进行PCR检测。
1.5.6抗干扰试验将任意两种或三种李斯特菌的模板(约109CFU/mL)等量混合，前者共有15种组合，后者共9种组合，用建立的PCR体系进行扩增，以确定该方法同时鉴定多种李斯特菌的能力。
1.6食品相关分离株鉴定119株疑似李斯特菌食品相关分离株分离自华南地区的海产品、奶制品、肉制品、蔬菜及食品加工厂器具、污水等。这些分离株均用本试剂盒进行检测，并同时用API系统(Biomerieux，France)鉴定。
1.7种别确证试验选取16S rRNA、23S rRNA及单增李斯特菌特异性基因hly、mpl、InlB、lmo0733为靶基因，对待检菌株及参考菌株进行PCR扩增并测序。序列经NCBIBLAST对比，以确证该菌株的种别。引物详见表2。
1.8加样及检测步骤1.8.1将试剂盒D管中0.58mL溶液加至A管，重悬。
1.8.2将B管溶液10μL加入PCR反应管，再次将C管(或待检样品)5μL加至同一PCR反应管，混合均匀，最后将1.6.1重悬溶液5.8μL加入上述同一PCR反应管，立即检测。
1.8.3将1.6.1按以下反应条件在PCR仪上进行扩增94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 40s，72℃ 50s，30个循环；72℃ 5min。
1.8.4将1.6.2反应后的产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析。
2结果2.1小鼠LD50如表4所示，参考菌株F2525、54006为弱毒株(对小鼠的LD50＞108)，而EGD、ScottA、10403S均为标准强毒株。
2.2 lmo0038全基因其两侧序列的测定及分析单增李斯特菌lmo0038及伊氏李斯特菌同源区(i-lmo0038)序列全长为1092bp，同源性为83.9％。lmo0035-0042长距离PCR扩增结果表明，单增李斯特菌强毒株和伊氏李斯特菌两个致病种可扩增出7538bp条带，单增李斯特菌弱毒株和无害李斯特菌均扩增出876bp条带且同源性为78.6-82％，其余种均无扩增(图2，3)；lmo0029-0042长距离PCR扩增结果表明，威氏李斯特菌和塞氏李斯特菌可扩增出750bp条带，而格氏李斯特菌无任何条带扩增(图4)。以上结果提示李斯特菌各个种在该区段的基因排布不同，lmo0038仅存在于致病种。
2.3多重PCR和试剂盒检测结果利用试剂盒对李斯特菌各个种的参考菌株进行扩增，如图5所示，单增李斯特菌强毒株可得到720bp和403bp的目的条带，而弱毒株仅得到720bp条带；无害李斯特菌可得到986bp条带，伊氏李斯特菌可得到1357bp和403bp两条条带，威氏李斯特菌可得到1363bp条带，塞氏李斯特菌可得到1108bp条带，格式李斯特菌及默氏亚种均得到479bp条带。
2.4 PCR产物的测序鉴定PCR扩增产物经BLAST比对后，结果显示，各个种的iap序列与已知序列的同源性为98.2％-100％；lmo0038与已知序列的同源性为100％，与i-lmo0038序列的同源性为79.4％(网上尚无i-lmo0038序列)。表明该PCR方法具有较高的准确性。
2.5特异性试验利用本试剂盒分别对20种其他细菌进行扩增，结果显示无任何条带，表明该PCR反应扩增李斯特菌基因片段具有良好的特异性。
2.6敏感性试验利用试剂盒对各稀释度的李斯特菌菌液进行检测，结果见图6-图11。当各个种分别含有约102CFU/mL细菌时，可见相应的目的条带产物，表明该方法对李斯特菌各个种的敏感性均可达102CFU/mL。
2.7抗干扰试验如图12、13所示，将两种李斯特菌的模板等量混合后，15种组合均可同时扩增出清晰的目的条带，不产生干扰。而将三种李斯特菌的模板等量混合后，仅能扩增出较小的片段，如lmo0038及格氏李斯特菌的iap片段，因此该方法不适用于三个种的同时检测。
2.8食品相关分离株鉴定及种别确证在119株来自华南地区的食品相关分离株中，通过本试剂盒的鉴定，86株为单增李斯特菌，其中牛奶分离株mLm4仅扩增出iap条带(图3)，而盐焗鸡分离株L92扩增出的iap条带较小(约600-650bp)。LD50结果(表4)表明，在20株单增李斯特菌分离株中，除mLm4毒力与标准弱毒株F2525、54006相当外，其余均为强毒株，与试剂盒检测结果吻合。其余27株为无害李斯特菌，1株为塞氏李斯特菌，1株为威氏李斯特菌，4株为非李斯特菌。API结果也与其完全符合。
通过种别确证试验发现，mLm4、L92均可扩增出与单增李斯特菌参考菌株相同的hly、mpl、InlB、lmo0733条带，确证两者为单增李斯特菌。而通过16S rRNA、23S rRNA基因的PCR、测序及序列分析，在4株非李斯特菌中3株为粪肠球菌，1株为较为少见的绿浅气球菌(Aerococcus viridans)。以上结果均证实该多重PCR快速检测试剂盒的可靠性。
表3 引物序列及产物长度(二)
表4 单增李斯特菌参考菌株及分离株来源与小鼠LD50
序列表LM AAACTGCTAACACAGCTACTLN TAGCACTCCAGTTGTTAAACLS CACAAGCGGCTCCTGCTCAACLGU CTGCGAAACCAGCAGTTTCTLVSW AACTGAGGTAGCGAGCGAALd ATACGCGACCGAAGCCAAClmo0038-1TTTCAATTATGTACGCCCAGGTGTlmo0038-2AATATTTCCGCCGCCAAGTAA
权利要求
1.李斯特菌种别及毒力快速检测试剂盒，包括10个含不同成分的冻存管A、B、C、D、E、F、G、H、I和J和100个PCR反应管及检测步骤说明书，其特征在于冻存管A装有Taq DNA polymerase，10×buffer，dNTP，引物；冻存管B装有裂解buffer溶液1mL；冻存管C～I分别装有0.5mL不同的阳性对照溶液，C管为单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌)强毒灭活株，D管为单核细胞增多性李斯特菌弱毒灭活株，E管为无害李斯特(Listeria innocua)，F管为伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)，G管为塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)，H管为威氏李斯特菌(Listeria welshimer)，I管为格氏李斯特菌(Listeria grayi)；冻存管J装有0.58mL稀释液。
2.按权利要求1所述李斯特菌种别及毒力快速检测试剂盒，其特征在于所述引物为LM、LN、LS、LVSW、LGU、Ld、lmo0038-1、lmo0038-2，其序列如下LM AAACTGCTAACACAGCTACTLN TAGCACTCCAGTTGTTAAACLS CACAAGCGGCTCCTGCTCAACLGU CTGCGAAACCAGCAGTTTCTLVSW AACTGAGGTAGCGAGCGAALd ATACGCGACCGAAGCCAAClmo0038-1TTTCAATTATGTACGCCCAGGTGTlmo0038-2AATATTTCCGCCGCCAAGTAA。
3.按权利要求1所述李斯特菌种别及毒力快速检测试剂盒，其特征在于它的检测方法为如下步骤(1)将冻存管J中0.58mL溶液加至冻存管A，重悬；(2)将冻存管B中的溶液10μL加入PCR反应管，再将冻存管C～I中的阳性对照溶液5μL或待检样品5μL加至同一PCR反应管，混合均匀，最后将(1)中冻存管A的溶液5.8μL加入上述同一PCR反应管，立即进行以下检测步骤；(3)将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增95℃3min；95℃45s，62℃30s，72℃1min，25个循环；72℃5min；(4)将扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析；(5)结果判定检测后，待检样品与阳性对溶液C同时扩增出720bp、403bp两条条带的为单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)强毒株阳性；待检样品与阳性对溶液D同时扩增出720bp条带的为单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)弱毒株阳性；待检样品与阳性对溶液E同时扩增出986bp条带的为无害李斯特(Listeria innocua)阳性；待检样品与阳性对溶液F同时扩增出1357bp、403bp两条条带的为伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)阳性；待检样品与阳性对溶液G同时扩增出1108bp条带的为塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)阳性；待检样品与阳性对溶液H同时扩增出1363bp条带的为威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)阳性；待检样品与阳性对溶液I同时扩增出479bp条带的为格氏李斯特菌(Listeria grayi)阳性；阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为待检样品阴性；两者均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。
全文摘要
李斯特菌种别及单核细胞增多性李斯特菌毒力强弱的快速检测试剂盒，由四个含不同成分的冻存管和100个PCR反应管及检测步骤说明书组成，冻存管分别装有Taq DNA polymerase，10×buffer，dNTP，引物LM、LN、LS、LVSW、LGU、Ld、lmo0038－1和lmo0038－2，裂解buffer溶液，阳性对照溶液和稀释液。本发明建立的多重PCR方法可同时鉴定李斯特菌各个种并区分单核细胞增多性李斯特菌的毒力强弱，最低检测限可达10
文档编号C12Q1/68GK101029331SQ20071006698
公开日2007年9月5日 申请日期2007年1月30日 优先权日2007年1月30日
发明者方维焕, 陈健舜, 江玲丽, 李肖梁, 王淑娜, 田国明, 陈宁, 吴蓓蓓 申请人:浙江大学