一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法
【专利摘要】本发明属于生物工程【技术领域】，特别公开了一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法。该方法以环状芽孢杆菌为生产菌种，其特征为，从试管斜面上挑取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌体接种到液体种子培养基中，培养制得活化后的液体种子；将液体种子接种量接种到液体发酵培养基中，依次加入木聚糖酶和阿魏酸酯酶，培养制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液；发酵液经过滤、萃取、静置分相，制得含有4-乙烯基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙烯基愈创木酚产品。本发明可以实现4-乙烯基愈创木酚生产的连续化、规模化；并且4-乙烯基愈创木酚的生产工艺简便，生产周期短，生产成本低，极具工业化应用前景。
【专利说明】一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法
[0001](一)【技术领域】
本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法。
[0002](二)【背景技术】
4-乙烯基愈创木酹(4-Vinylguaiacol,4_VG)又名2-甲氧基-4-乙烯基苯酹、对乙烯基愈创木酚，分子式为C9HltlO2,分子量为150.18，为无色或淡黄色的油状液体，略带甜味，呈发酵香气。4-VG是一种能产生特殊香味或丁香类香味的挥发性酚类物质，其感觉阈值很低，仅为0.3mg/L，它能提高食品的感官品质，对酒类、酱油、干酪、饮料等食品的自然香气有很大影响。4-VG是一种常用的高档香料，主要用于食品以增加其香味成份，还用于烟草、日化、医药、香精合成等行业。在酿酒行业，4-VG是以小麦类为原辅料的上面发酵啤酒中必不可少的香味物质，也是酱香型白酒和葡萄酒中的一种重要的风味物质。
[0003]4-乙烯基愈创木酚的生产方法有从植物中直接提取法、化学合成法和生物合成法三种。植物提取法是从菊科、旋花科等植物中提取，但由于原料供应有限，且植物中4-VG的含量较低，导致提取工艺成本较高而难以实现大规模生产。
[0004]化学合成法是常用的生产4-VG的方法，如中国专利文献CN 101885669 A(申请号201010229531.X)公开了一种4-乙烯基愈创木酚的制备方法，步骤为:(I)向反应器中依次投入喹啉、阿魏酸和作为阻聚剂的对苯二酚，加热，温度升高到180-185°C时，反应4-5小时左右；(2 )将上述反应液中加入溶剂苯，并加入盐酸，搅拌均匀，静置分层，检测水相pH值为中性为止，最后加入干燥剂无水氯化钙；(3)将干燥后的溶液放入蒸馏器中，常压将作为溶剂的苯蒸出，然后连接上真空泵在100°C以下的气相温度下将产品蒸出，即可包装市售。但化学合成法普遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，生产工艺复杂，产品收率低；并且由于产品中含有原料、副产物、溶剂等物质的残留物，因此该方法得到的4-VG无法直接添加到食品中。`
[0005]随着人们对绿色产品要求的日益提高，利用生物工程技术生产4-VG的方法具有产品绿色天然、安全可靠、反应条件温和、环境污染小等优点而受到人们的重视。生物合成法是通过培养含有阿魏酸脱羧酶的微生物细胞或通过采用阿魏酸脱羧酶制剂进行催化合成4-VG的方法。与植物提取法和化学合成方相比，生物合成法具有原料来源广泛、副产物少、产品收率高、生产成本低、易于实现工业化的特点，是一种经济有效和极有产业化前景的4-乙烯基愈创木酚生产方法。
[0006]如中国专利文献CN 102776246 A(申请号201210288911.X)公开了一种生物转化制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法，该方法以芽孢杆菌feci77心sp.HY3CCTCCM2012247为生物催化剂，以天然阿魏酸为底物，通过微生物转化制备天然4-乙烯基愈创木酚。其生产过程包括:(I)斜面培养，(2)制备种子培养液，(3)转化细胞培养，(4)转化。该发明是在微生物的作用下将天然阿魏酸转化制备4-乙烯基愈创木酚，但天然阿魏酸是从植物(如谷糠、阿魏等冲提取得到的，由于提取成本较高，因此采用该方法生产4-VG的成本也较闻。[0007]许多微生物(如参与酒类酿造的酵母菌、细菌、真菌等)能够利用培养基中的营养物质发酵产生4-乙烯基愈创木酚，但由于这些微生物细胞内的阿魏酸脱羧酶活性较低，产生的4-VG含量较低(一般在2.0-5.0mg/L),因而不能满足工业化生产的要求。
[0008](三)
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种产率高、成本低、能够规模化生产的环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法。
[0009]本发明是通过如下技术方案实现的:
一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，以菌种保藏编号为CGMCCN0.8044的环状芽孢杆菌{Bacillus circulans) HG12菌株为生产菌种,包括如下步骤:(O从试管斜面上挑取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌体接种到液体种子培养基中，在35-40°C、120-160r/min条件下，培养12_16h，制得活化后的液体种子；
(2)将液体种子按体积比为3-5%的接种量接种到液体发酵培养基中，发酵10-12h，加入木聚糖酶，继续发酵10_12h，加入阿魏酸酯酶，再发酵60-72h制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液；
(3)将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，向滤出液中加入萃取剂，混合均与，静置分相，制得含有4-乙烯基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙烯基愈创木酚产品O
[0010]本发明涉及的环`状芽孢杆菌{Bacillus circulans) HG12菌株是从中国白酒厂酿造酱香型白酒用的高温大曲中分离，并经过紫外线诱变筛选获得，已于2013年8月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC N0.8044。
[0011]本发明的环状芽孢杆菌(ifeci77i/5.HG12菌株的微生物学特征是:菌落呈乳白色、有褶皱、无光泽、表面不光滑；菌体呈杆状、直或接近直、单个或成链状，细胞大小约为(0.6-1.0) MmX (1.8-3.8) Mm，产芽孢、孢囊膨大、芽孢椭圆形、芽孢中生到端生；革兰氏阳性、兼性厌氧、有机化能异养菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖产酸，V-P反应阴性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐，在培养温度为55°C下生长；可发酵小麦麸皮、小麦、大麦、高粱的一种或几种组合制成的液体培养基和固态培养基，产生明显的酱香香气。
[0012]本发明的更优方案为:
步骤(1)中，液体种子培养基的组分为:葡糖糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏
10.0g/L, NaCl 5.0g/L, pH 7.0-7.2，蒸馏水定容。
[0013]步骤(2)中，液体发酵培养基为:小麦麸皮300g，加水1000mL,混合均匀，于100°C下、蒸煮 10_20min,调 pH 值为 6.0-6.5,121°C下、灭菌 30min。
[0014]步骤(2)中，菌体的发酵条件为37-40°C、160-200r/min。
[0015]步骤(3)中，微孔滤膜的工作压力为0.05-0.1MPa，微孔滤膜的孔径为0.2-0.4Mm。
[0016]步骤(3)中，萃取剂为乙酸丁酯，其用量为滤出液体积比的20-30%。
[0017]步骤(2)中，木聚糖酶的用量为10.0_20.0U/g麸皮，阿魏酸酯酶的用量为
5.0-10.0U/g 麸皮。
[0018]本发明使用的环状芽孢杆菌HG12菌株来源于酱香型白酒高温大曲并经过紫外线诱变选育获得；HG12菌株含有高活性阿魏酸脱羧酶，能将发酵液中的阿魏酸脱羧生成4-乙烯基愈创木酚且生成率高；HG12菌株发酵性能优良，其发酵液中的4-乙烯基愈创木酚的浓度高；HG12菌株的发酵产物4-乙烯基愈创木酚符合相关食品安全法规，安全无毒害，属于绿色安全食品。
[0019]本发明米用小麦麸皮为原料,小麦麸皮中含有丰富的阿魏酸，在高温蒸煮以及木聚糖酶和阿魏酸酯酶的共同作用下，其含有的阿魏酸几乎全部释放到发酵液中，为4-乙烯基愈创木酚的生产提供了天然原料；小麦麸皮营养丰富，含有25-30%的淀粉、15%左右的蛋白质以及多种微量元素，能充分满足HG12菌株的生长要求；小麦麸皮来源广泛、价格低廉，用其为原料发酵生产4-乙烯基愈创木酚的生产成本低。
[0020]本发明可以实现4-乙烯基愈创木酚生产的连续化、规模化；并且4-乙烯基愈创木酚的生产工艺简便，生产周期短，生产成本低，极具工业化应用前景。
[0021](四)【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
[0022]本发明中4-乙烯基愈创木酚含量的测定步骤如下:
精密称取4-乙烯基愈创木酚标准品25mg，用色谱纯甲醇溶解并定容到25mL，制得浓度为lmg/mL的标准母液。用色谱纯甲醇将标准母液进行稀释，制得质量体积浓度依次为0.02,0.2、1.0,2.0,4.0Pg/mL的4-乙烯基愈创木酚标准溶液。将上述标准溶液分别用0.22Mffl的有机滤膜过滤，过滤液分别用高效液相色谱仪(购自上海天普分析仪器有限公司)进样测定，以峰面积(Y)为纵坐标、浓度值(X，Kg/mL)为横坐标，制作4-乙烯基愈创木酚标准溶液的标准曲线。根据标准曲线获得该曲线的回归方程为:y=3.973X+9.522(R2=0.9995)，其中:y为峰面积，x为4-乙烯基愈创木酚的质量浓度(Pg/mL)，R2为相关系数。峰面积Y的变化与4-乙烯基愈创木酚的质量浓度成线性关系，其拟合度达0.9995。
[0023]将含有4-乙烯基愈创木酹的发酵液在8000r/min下、离心20min,取上清液,用0.22Mm的水性滤膜过滤，将过滤液稀释成质量浓度为0.01-4.0Pg/mL的样品溶液，用高效液相色谱仪进样测定，得到样品溶液的峰面积，根据回归方程计算出4-乙烯基愈创木酚的浓度。
[0024]高效液相色谱仪的测定条件为:C18色谱柱(Agilent HC-C18, 250mmX4mm, 5Mm),流动相为水:甲醇:磷酸=540:450:10 (v/v/v)，流速为lmL/min，进样量为15μ?，操作温度为30°C。荧光检测器条件为激发波长270nm、发射波长315nm。
[0025]原料来源:小麦麸皮市售，乙酸丁酯购自上海谱振生物科技有限公司，4-乙烯基愈创木酹标准品购自美国Sigma公司，阿魏酸酯酶购自爱尔兰Megazyme公司，木聚糖酶购自诺维信公司，甲醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
[0026]实施例1
一种利用环状芽孢杆菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株发酵生产4-乙烯基愈创木酹的方法，步骤如下:
(I)用接种环从菌株试管斜面上挑取I环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到IOmL的液体种子培养基中，在37°C、120r/min条件下，培养14h，制得活化后的液体种子。
[0027](2)将步骤(1)制得的液体种子按5% (v/v)的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中，在40°C、200r/min下培养12h，加入木聚糖酶，其用量为20.0U/g麸皮；在40°〇、200r/min下继续培养12h，加入阿魏酸酯酶，其用量为10.0U/g麸皮；再在40°C、200r/min下继续培养72h，制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液。
[0028](3)将步骤(2)制得的含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液在0.1MPa压力下用孔径为0.2Mm的微孔滤膜过滤除菌，收集滤出液，向滤出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量为滤出液体积百分比的30% (v/v)，混合均匀，静置分相，制得含有4-乙烯基愈创木酚的萃取液。将萃取液在100°C、667Pa下蒸发，制得4-乙烯基愈创木酚产品0.239g。
[0029]经检测发酵液中4-乙烯基愈创木酚的含量为1.22g/L。
[0030]所述步骤(1)中的液体种子培养基组分如下(g/L):葡萄糖10.0，蛋白胨10.0，牛肉膏10.0, NaCl 5.0, pH 7.2，蒸馏水定容。
[0031]所述步骤(2)中的液体发酵培养基:小麦麸皮300g，加水1000mL,混合均匀，于10CTC下、蒸煮 IOmin,调 pH 值为 6.0,121°C下、灭菌 30min。
[0032]实施例2
如实施例1所述的利用环状芽孢杆菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，不同之处在于:
步骤(2)中，将步骤(1)制 得的液体种子按5% (v/v)的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中，木聚糖酶的用量为10.0U/g麸皮，制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液。
[0033]经检测发酵液中4-乙烯基愈创木酚的含量为1.18g/L。
[0034]在此条件下制得4-乙烯基愈创木酚产品0.231g。
[0035]实施例3
如实施例1所述的利用环状芽孢杆菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，不同之处在于:
步骤(2)中，将步骤(1)制得的液体种子按5% (v/v)的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中，阿魏酸酯酶的用量为5.0U/g麸皮，制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液。
[0036]经检测发酵液中4-乙烯基愈创木酚的含量为1.12g/L。
[0037]在此条件下制得4-乙烯基愈创木酚产品0.219g。
[0038]实施例4
如实施例1所述的利用环状芽孢杆菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，不同之处在于:
步骤(2)中，将步骤(1)制得的液体种子按5% (v/v)的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中，木聚糖酶的用量为10.0U/g麸皮，阿魏酸酯酶的用量为5.0U/g麸皮，制得含有
4-乙烯基愈创木酚的发酵液。
[0039]经检测发酵液中4-乙烯基愈创木酚的含量为1.06g/L。
[0040]在此条件下制得4-乙烯基愈创木酚产品0.208g。
[0041]实施例5
一种利用环状芽孢杆菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株发酵生产4-乙烯基愈创木酹的方法，步骤如下:
Cl)同实施例1的步骤(1)。
[0042](2)将步骤(1)制得的液体种子按3% (v/v)的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中，在37°C、160r/min下培养10h，加入木聚糖酶，其用量为20.0U/g麸皮；在37°C、 160r/min下继续培养10h，加入阿魏酸酯酶，其用量为10.0U/g麸皮；再在37°C、160r/min下继续培养60h，制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液。
[0043](3)将步骤(2)制得的含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液在0.05MPa压力下用孔径为0.4Mm的微孔滤膜过滤除菌，收集滤出液；向滤出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量为滤出液体积百分比的25% (v/v)，混合均匀，静置分相，制得含有4-乙烯基愈创木酚的萃取液；将萃取液在100°C、667Pa下蒸发，制得4-乙烯基愈创木酚产品0.217g。
[0044]经检测发酵液中4-乙烯基愈创木酚的含量为1.13g/L。
[0045]所述步骤(1)中的液体种子培养基组分如下(g/L):葡萄糖10.0，蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，NaCl 5.0, pH 7.0，蒸馏水定容。
[0046]所述步骤(2)中的液体发酵培养基:小麦麸皮300g，加水1000mL,混合均匀，于 10CTC下、蒸煮 20min,调 pH 值为 6.5,121°C下、灭菌 30min。
[0047]实施例6
如实施例1所述的利用环状芽孢杆菌{Bacillus circulans)Y￡l2菌株发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，不同之处在于:
步骤(3)中，向滤出液中加入乙酸丁酯，乙酸丁酯的用量为滤出液体积百分比的20%(v/v)。
[0048]制得4-乙烯基愈创木酚产品0.232g。
【权利要求】
1.一种环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，以菌种保藏编号为CGMCCN0.8044的环状芽孢杆菌心circulans) HG12菌株为生产菌种，其特征为，包括如下步骤:(I)从试管斜面上挑取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌体接种到液体种子培养基中，在35-40°C、120-160r/min条件下，培养12_16h，制得活化后的液体种子；(2)将液体种子按体积比为3-5%的接种量接种到液体发酵培养基中，发酵10-12h，加入木聚糖酶，继续发酵10-12h，加入阿魏酸酯酶，再发酵60-72h制得含有4-乙烯基愈创木酚的发酵液；(3)将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，向滤出液中加入萃取剂，混合均与，静置分相，制得含有4-乙烯基愈创木酚的萃取液，将萃取液真空蒸发，制得4-乙烯基愈创木酚产品。
2.根据权利要求1所述的环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征为，步骤(1)中，液体种子培养基的组分为:葡糖糖10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,牛肉膏10.0g/L, NaCl 5.0g/L, pH 7.0-7.2，蒸馏水定容。
3.根据权利要求1所述的环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征为，步骤(2)中，液体发酵培养基为:小麦麸皮300g，加水1000mL,混合均匀，于100°C下、蒸煮 10-20min，调 pH 值为 6.0-6.5，121°C下、灭菌 30min。
4.根据权利要求1所述的环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于:步骤(2)中，菌体的发酵条件为37-40°C、160-200r/min。
5.根据权利要求1所述的环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于:步骤(3)中，微孔滤膜的工作压力为0.05-0.1MPa，微孔滤膜的孔径为0.2-0.4Mm。
6.根据权利要求1所述的环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于:步骤(3)中，萃取剂为乙酸丁酯，其用量为滤出液体积比的20-30%。
7.根据权利要求3所述的环状芽孢杆菌发酵生产4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于:步骤(2)中，木聚糖酶的用量为10.0-20.0U/g麸皮，阿魏酸酯酶的用量为5.0-10.0U/g麸皮。
【文档编号】C12P7/22GK103789357SQ201310413429
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】董永胜 申请人:齐鲁工业大学