专利名称：用工程菌生产5－氨基乙酰丙酸的方法
技术领域：
本发明涉及用工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法。
背景技术：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)广泛存在于生物体中，是卟啉生物合成途径中第一个化合物，也是合成血红素、叶绿素、维生素B12等四吡咯化合物的共同前体。ALA作为一种光动力学剂(photodynamic agent，PDT)，在农用化学品和医学领域具有广泛的用途。在农业领域，ALA具有除草、杀虫、增加植物抗逆性和促进植物生长等多种功能，并且易降解无残留、对人畜无毒性，成为极具发展前途的无公害绿色农用化学品。在医学领域，ALA具有选择性杀死癌细胞的作用，被称为第二代光动力学药物(photodynamic medicine)，具有对正常细胞毒害小，病人避光时间短，疗效好等显著特点，被用于治疗皮肤癌、膀胱癌、结肠癌和胰腺癌等多种癌症。基于ALA的功能和广泛的应用前景，其合成研究已经引起前所未有的重视。
目前ALA的生产较多采用化学合成法，其步骤繁琐、副产物多、产率低且严重污染环境；而生物诱变法生产ALA，主要是利用类球红细菌突变株，所报道ALA的最高产量为27mmol/L，但其培养条件较为复杂，生产周期长，成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单，产量高，对环境友好的用工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法。
本发明的用工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法，包括以下步骤1)用接种针从保藏编号为CGMCC No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30-50μg/ml卡那霉素和30-50μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，置于37℃烘箱中过夜培养；2)将平板上的单克隆接种于含30-50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为200-220rmp，在37℃过夜培养，得到一级种子；3)取1ml-5ml一级种子接种于含50-100ml发酵培养基的500ml的摇瓶中培养3-4h，得到二级种子；4)将50-100ml二级种子接种于含2-3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，使罐上的初始菌液密度OD600为0.08-0.2，发酵罐转速为400-600rpm，空气流量为1-2L/min，起始培养温度为37℃，2h后降至26-30℃，再用0.05-0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导；5)诱导培养6-10h后流加补料培养基，在菌体密度OD600达到8-12时，分批补加5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂继续培养；6)发酵培养初始采用10％-20％体积分数的稀硫酸控制pH在5.8-6.0；诱导培养4-8h后通过流加补料培养基控制pH为6.1-6.3。
本发明中，所说的保藏编号为CGMCC No.1939工程菌，保藏日期2007.1.25，分类命名中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coliRosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址中国科学院微生物研究所。
本发明中，所说的初始发酵培养基是由质量体积比分别为0.5％-2％蛋白胨、0.25％-1％酵母粉、0.3％-1％琥珀酸、0.2％-0.4％甘氨酸和0.1％-0.5％葡萄糖组成，其pH值为6.0-6.3；所说的补料培养基中分别含有15-25g琥珀酸和10-15g甘氨酸，体积为800-1000ml；5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂为3-6g/L D-葡萄糖。
本发明工艺简单、可控性高、成本低、发酵过程对环境友好，所得的胞外ALA产量高，具有广阔的工业化前景。
图1胞外ALA浓度及菌体密度OD600与发酵时间的关系曲线。
具体实施例方式
以下结合实施例进一步说明本发明实施例用工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法，包括以下步骤1.用接种针从保藏编号为CGMCC No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA的甘油管中蘸取少量菌液，在含30μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线，于37℃烘箱中过夜培养；2.挑取单克隆接种于含50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为200rmp，在37℃过夜培养，得到一级种子；3.取1ml一级种子接种于含100ml发酵培养基的500ml的摇瓶中，在37℃，200rpm条件下培养3h，得到二级种子。其中初始发酵培养基是由质量体积比分别为1％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.3％琥珀酸、0.2％甘氨酸和0.2％葡萄糖组成，用氢氧化钠调节pH值为5.9；
4.将100ml二级种子接种于含3L上述发酵培养基的5L发酵罐中，使罐上的初始菌液密度OD600近似为0.1，发酵罐转速为600rmp，空气流量为1.5L/min，起始培养温度为37℃，2h后降至28℃，用0.1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导；5.诱导培养4h后流加含有21g琥珀酸和12g甘氨酸，体积为330ml的补料培养基，用菌体的密度监测菌体生长情况，当菌体密度OD600达到8时，开始每隔3h添加4g/L D-葡萄糖作为5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂，总共添加3次葡萄糖。6)发酵培养初始pH采用10％-20％体积分数的稀硫酸控制在5.9；诱导培养4h后通过流加补料培养基控制pH为6.2。采用Mauzerall和Granick的分析方法(参照Mauzerall D，Granick S.J.Bio.Chem.，1956，219435-442)测定ALA的浓度。由图1可见胞外ALA的浓度30h时即可达到6.6g/L。
权利要求
1.用工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征是包括以下步骤1)用接种针从保藏编号为CGMCC No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30-50μg/ml卡那霉素和30-50μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线后，置于37℃烘箱中过夜培养，保藏编号为CGMCCNo.1939工程菌，分类命名中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichiacoli Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA；2)将平板上的单克隆接种于含30-50ml LB培养基的250ml摇瓶中，转速为200-220rmp，在37℃过夜培养，得到一级种子；3)取1ml-5ml一级种子接种于含50-100ml发酵培养基的500ml的摇瓶中培养3-4h，得到二级种子；4)将50-100ml二级种子接种于含2-3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，使罐上的初始菌液密度OD600为0.08-0.15，发酵罐转速为400-600rpm，空气流量为1-2L/min，起始培养温度为37℃，2h后降至26-30℃，再用0.05-0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导；5)诱导培养4-8h后流加补料培养基，在菌体密度OD600达到8-12时，分批补加葡萄糖作为5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂；6)发酵培养初始pH采用10％-20％体积分数的稀硫酸控制在5.8-6.0；诱导培养4-8h后通过流加补料培养基控制pH为6.1-6.3。
2.根据权利要求1所述的用工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所说的初始发酵培养基是由质量体积比分别为0.5％-2％蛋白胨、0.25％-1％酵母粉、0.3％-1％琥珀酸、0.2％-0.4％甘氨酸和0.1％-0.5％葡萄糖组成，其pH值为6.0-6.3。
3.据权利要求1所述的用工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所说的补料培养基中含有15-25g琥珀酸和10-15g甘氨酸，体积为300-400ml。
4.根据权利要求1所述的用工程菌生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于所说的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂为3-6g/L D-葡萄糖。
全文摘要
本发明涉及用工程菌生产5－氨基乙酰丙酸的方法。该方法包括以下步骤1)用LB培养基平板活化保藏编号为CGMCC No.1939工程菌Rosetta(DE3)－pET28a－R.S.hemA；2)将平板上的单克隆接种于LB培养基摇瓶中，在37℃过夜培养，得到一级种子；3)取一级种子接种于LB培养基的摇瓶中培养，得到二级种子；4)将二级种子接种于含发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷降温诱导，继续培养一段时间后进行补料培养。本发明工艺简单、可控性高、成本低、发酵过程对环境友好，所得的胞外ALA产量高，具有广阔的工业化前景。
文档编号C12R1/01GK101041839SQ200710068169
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月20日 优先权日2007年4月20日
发明者林建平, 傅维琦, 岑沛霖 申请人:浙江大学