专利名称：一种生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法。
背景技术：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是四氢吡咯的前缀化合物，是生物体合成叶绿素、血红素、卟啉和维生素B12等必不可少的物质。近年来ALA除作为一种环境相容性及选择性很高的新型光活化农药外，还在临床上用作光化疗剂。作为新一代光动力学药剂其具有毒性小，选择性高等显著优点，被用来治疗皮肤癌、膀胱癌、结肠癌和胰腺癌等多种癌症，在光化疗领域正逐步展现其巨大的应用性。
由于化学法合成ALA步骤繁琐且产率低，故生物合成方法正逐步展现出巨大优势。其一是生物诱变法，优化类球红细菌的突变株CR 720(Rhodobactersphaeroides CR720)培养条件，ALA的产量可达27mmol/L，但其培养条件复杂、周期长和成本较高。其二是基因工程方法，Mariet J.Vander Werf等(1996年)和Choi等(1999年)分别构建了含有类球红细菌Rhodobacter sphaeroides和大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicμm.的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(hemA)的工程菌，用于生产ALA，但酶活和产量均较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法。
本发明的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌是含有类球红细菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1939。保藏日期2007.1.25，分类命名中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coliRosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA，保藏单位地址中国科学院微生物研究所。
上述5-氨基乙酰丙酸合成酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。
上述5-氨基乙酰丙酸合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列或在其基础上减少、替代、增加一个氨基酸残基的具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性的氨基酸序列。
生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤1)从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的菌液中提取总基因组DNA，类球红细菌可由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买得到，保藏编号为CGMCC编号1.2174；2)用聚合酶链式反应扩增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因；3)将扩增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因与克隆载体pMD-18T simple(商业化载体，从TaKaRa公司购买)连接，进行DNA测序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；4)将测序后的目的基因片断与表达载体pET28a(商业化载体，从德国Novagen公司购买)连接，构建出重组子pET28a-R.S.hemA；5)将重组子pET28a-R.S.hemA转化至宿主菌中，即可。
为获得较高的5-氨基乙酰丙酸的产量，本发明中的宿主菌采用大肠杆菌Rosetta(DE3)(商业化菌株，从德国Novagen公司购买)。
本发明将一种类球红细菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因接入表达载体pET28a转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下，有较高的可溶性5-氨基乙酰丙酸合成酶表达，且经优化表达后胞外ALA的产量高达6.6g/L。
图1是重组质粒pET28a-R.S.hemA的构建图，图中，R.S.hemA为5-氨基乙酰丙酸合成酶基因，Kana+为卡那霉素抗性基因，EcoRI和HindIII为限制性内切酶位点；图2是工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA诱导表达示意图。
具体实施例方式
以下结合实施例进一步说明本发明实施例1本发明生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，包括以下步骤1.类球红细菌基因组DNA的提取1)将过夜培养的菌液放在1.5ml离增中，13,000×g离心1min后去上清；2)用500μl TE缓冲液溶解后，加30μl 10％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，同时加3μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀后，37℃保温1h；3)加1/5体积5mol/L NaCl溶液，再加约1/5体积CTAB/NaCl溶液(4.1g NaCl溶解于80ml H2O，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml)，65℃保温30min；4)加等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液(酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1)，13,000×g离心5min；
5)取上清液加等体积的氯仿和异戊醇的混合液(氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1)，13,000×g离心5min；7)取上清液加2倍体积的无水乙醇及1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH 4.6)，于-20℃下静置10min后，13,000×g离心5min；8)去上清液所得的DNA沉淀用70％的乙醇洗2次后，自然风干后，溶于TE缓冲液中(含20μg/ml RNase)，55℃水浴处理30min，即得到基因组DNA。
2用聚合酶链反应(PCR)扩增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因1)取上述提取的基因组DNA 20μg，浓度均为10μmol/L的两引物各1μl(5’端引物为GGATCCGAATTCATGGACTACAATCTGGCACTC，3’端引物为AAGCTTTCAGGCAACGACCTCGGCGCGA)，10×反应缓冲液2μl，PfuDNA聚合酶(5unit/μl)0.5μl，4种脱氧核苷酸(dNTP)浓度均为10mmol/L的混合液0.5μl，加于0.5ml PCR管中，用双蒸水补足20μl；2)将上述20μl反应液，放入PCR仪中，反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min；3)把PCR扩增后的产物，加5μl上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定出一条约1.2kb的条带；3.将扩增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因与克隆载体pMD-18T simple连接，进行DNA测序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列1)将PCR扩增的hemA基因用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)进行切胶回收；2)在10μl的反应体系中取7μl回收的基因片断加0.5μl 200μmol/L脱氧腺苷酸(dATP)，0.3μl 25mmol/L MgCl2，0.2μl(5unit/μl)TaqDNA聚合酶，1μl 10×反应缓冲液，其余用双蒸水补足，此反应系统在70℃下反应30min，使hemA基因加上脱氧腺苷酸(A’)末端；3)将具有A’末端的目的基因与克隆载体pMD-18T simple在16℃下连接2h，然后转化感受态细胞DH5α(见图1)；4)在含100μg/μl的氨苄青霉素及5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和IPTG各800μg的LB培养基平板上经蓝白斑系统筛选出阳性克隆，即从转化平皿上挑出5个白色克隆进行鉴定(1升LB培养基含10克蛋白胨、5克酵母粉、10克氯化钠，pH 7.0)；5)对这5个克隆用EcoRI和HindIII双酶切，其中4个分别在约3kb和1.2kb处有条带，具有1.2kb的基因片断认为连接成功，其余1个只有在3kb处有条带，说明目的基因没有连接上；6)用EcoRI和HindIII双酶切鉴定出有正确插入的克隆(即重组子)命名为pMD18T-R.S.-hemA，进行DNA测序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.将测序后的目的基因片断与表达载体pET28a连接，构建出重组子pET28a-R.S.-hemA，用此重组子转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)1)用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切重组质粒pMD18T-R.S.-hemA；切下1.2kb片断进行胶回收；2)用内切酶EcoRI和HindIII处理表达载体pET28a，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收约5.0kb的大片断；3)两种回收产物在16℃下连接4h，然后转化感受态细胞Rosetta(DE3)，这样hemA基因就定向连接到表达载体pET28a的EcoRI和HindIII位点处，将这种表达载体命名为pET28a-R.S.-hemA，而含有这种表达载体的工程菌命名为Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA，即为本发明的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌(见图1)。
实施例25-氨基乙酰丙酸合成酶在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下的表达1)将本发明工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA培养在含50ml LB培养基的250ml的摇瓶中，先在37℃，200rpm下培养2.0h；然后降温至28℃，用2.5μl 1mol/L IPTG诱导，继续培养6h后，取30ml菌液于10,000×rpm离心10min去上清液；2)用9ml 50mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)洗涤一次后，再用同样量的缓冲液重悬，超声破胞，其条件为300w工作5s，间歇7s，重复30次，10,000×rpm离心10min；3)取上清液进行10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；4)根据电泳结果在约50.0kDa处有占总蛋白量25％的可溶蛋白表达(见图2)，此大小与SEQ ID NO.2的氨基酸序列大小基本一致，即认为此蛋白为5-氨基乙酰丙酸合成酶过量表达。
实施例35-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力测定1)将500μl含有50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、20mmol/L MgCl2、0.1mol/L甘氨酸、0.27mmol/L磷酸吡哆醛、0.2mmol/L琥珀酰辅酶A和破胞后的细胞上清液的混合液，于37℃反应10min；2)取上述反应液加150μl 10％三氯乙酸于1.5mL离心管中混合，13,000×g离心5min；3)取300μl上清液与400μl 1mol/L乙酸盐缓冲液(pH 4.6)和35μl乙酰丙酮混合，沸水浴15min；4)冷却15min至室温后，再加入700μl新鲜配制的Ehrlich试剂(依次加入30ml的冰乙酸，1g对-二甲氨基苯甲醛，5ml 70％的高氯酸，5ml水，溶解后用冰乙酸定容至50ml)，反应30min后在554nm处测定其吸光值，ALA的浓度(mg/L)＝20.574×OD554-0.49(R2＝0.9994)；5)蛋白浓度由蛋白质浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)测定，测出含有hemA基因的重组菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力为33.8nmol-1min-1mg of protein-1(1个酶单位定义为1min内生成1nmol ALA所需的酶量；酶的比活力为每毫克蛋白所含的酶单位)，而不含重组子的大肠杆菌Rosetta(DE3)检测不到5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性。
SEQ ID NO.1长度1224bp类型脱氧核糖核酸链数双链几何结构线性来源从类球红细菌基因组中PCR扩增而来特征编码5-氨基乙酰丙酸合成酶的核苷酸序列SEQ ID NO.2长度407个氨基酸残基类型肽链链数单链几何结构线性来源类球红细菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因推断得到特征具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性序列表<110>浙江大学<120>一种生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1224<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1atggactaca atctggcact cgataccgct ctgaaccggc tccataccga gggccggtac60cggaccttca tcgacatcga gcggcgcaag ggtgccttcc cgaaagccat gtggcgcaag 120cccgacggga gcgagaagga aatcaccgtc tggtgcggca acgactatct cggcatgggc 180cagcatccgg tggtgctggg ggccatgcac gaggcgctgg attcgaccgg cgccgggtcg 240ggcggcacgc gcaacatctc gggcaccacg ctctatcaca agcgcctcga ggccgagctc 300gccgacctgc acggcaagga agcggcgctg gtcttctcgt cggcctatat cgccaacgac 360gcgaccctct cgacgctgcc gcagctgatc ccgggcctcg tcatcgtctc ggacaagttg 420aaccacgctt cgatgatcga gggcatccgc cgctcgggca ccgagaagca catcttcaag 480cacaatgacc tcgacgacct gcgccggatc ctgacctcga tcggcaagga ccgtccgatc 540ctcgtggcct tcgaatccgt ctattcgatg gatggcgact tcggccgcat cgaggagatc 600tgcgacatcg ccgacgagtt cggcgcgctg aaatacatcg acgaggtcca tgccgtcggc 660atgtacggcc cccgcggcgg cggcgtggcc gagcgggacg ggctgatgga ccggatcgac 720atcatcaacg ggacgctggg caaggcctat ggcgtgttcg gcggctatat cgcggcctcg 780tcaaagatgt gcgacgcggt gcgctcctac gcgccgggct tcatcttctc gacctcgctg 840ccgcccgtcg tggcggccgg tgcggcggcc tcggtgcgcc acctcaaggg cgatgtggag 900ctgcgcgaga agcaccagac ccaggcccgc atcctgaaga tgcgcctcaa ggggctcggc 960ctgccgatca tcgaccacgg ctcgcacatc gtgccggtcc atgtgggcga ccccgtgcac 1020tgcaagatga tctcggacat gctgctcgag catttcggca tctatgtcca gccgatcaac 1080ttcccgaccg tgccgcgcgg gaccgagcgg ctgcgcttca ccccgtcgcc cgtgcatgat 1140tccggcatga tcgatcacct cgtgaaggcc atggacgtgc tctggcagca ctgtgcgctg 1200aatcgcgccg aggtcgttgc ctga 1224
<210>2<211>407<212>PRT<213>Escherichia coli<400>2Met Asp Tyr Asn Leu Ala Leu Asp Thr Ala Leu Asn Arg Leu His Thr1 5 10 15Glu Gly Arg Tyr Arg Thr Phe Ile Asp Ile Glu Arg Arg Lys Gly Ala20 25 30Phe Pro Lys Ala Met Trp Arg Lys Pro Asp Gly Ser Glu Lys Glu Ile35 40 45Thr Val Trp Cys Gly Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Val50 55 60Val Leu Gly Ala Met His Glu Ala Leu Asp Ser Thr Gly Ala Gly Ser65 70 75 80Gly Gly Thr Arg Asn Ile Ser Gly Thr Thr Leu Tyr His Lys Arg Leu85 90 95Glu Ala Glu Leu Ala Asp Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Val Phe100 105 110Ser Ser Ala Tyr Ile Ala Asn Asp Ala Thr Leu Ser Thr Leu Pro Gln115 120 125Leu Ile Pro Gly Leu Val Ile Val Ser Asp Lys Leu Asn His Ala Ser130 135 140Met Ile Glu Gly Ile Arg Arg Ser Gly Thr Glu Lys His Ile Phe Lys145 150 155 160His Asn Asp Leu Asp Asp Leu Arg Arg Ile Leu Thr Ser Ile Gly Lys165 170 175Asp Arg Pro Ile Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly180 185 190Asp Phe Gly Arg Ile Glu Glu Ile Cys Asp Ile Ala Asp Glu Phe Gly195 200 205
Ala Leu Lys Tyr Ile Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Pro210 215 220Arg Gly Gly Gly Val Ala Glu Arg Asp Gly Leu Met Asp Arg Ile Asp225 230 235 240Ile Ile Asn Gly Thr Leu Gly Lys Ala Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr245 250 255Ile Ala Ala Ser Ser Lys Met Cys Asp Ala Val Arg Ser Tyr Ala Pro260 265 270Gly Phe Ile Phe Ser Thr Ser Leu Pro Pro Val Val Ala Ala Gly Ala275 280 285Ala Ala Ser Val Arg His Leu Lys Gly Asp Val Glu Leu Arg Glu Lys290 295 300His Gln Thr Gln Ala Arg Ile Leu Lys Met Arg Leu Lys Gly Leu Gly305 310 315 320Leu Pro Ile Ile Asp His Gly Ser His Ile Val Pro Val His Val Gly325 330 335Asp Pro Val His Cys Lys Met Ile Ser Asp Met Leu Leu Glu His Phe340 345 350Gly Ile Tyr Val Gln Pro Ile Asn Phe Pro Thr Val Pro Arg Gly Thr355 360 365Glu Arg Leu Arg Phe Thr Pro Ser Pro Val His Asp Ser Gly Met Ile370 375 380Asp His Leu Val Lys Ala Met Asp Val Leu Trp Gln His Cys Ala Leu385 390 395 400Asn Arg Ala Glu Val Val Ala40权利要求
1.一种生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于此菌是含有类球红细菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌，中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coli Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.1939。
2.根据权利要求1所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于所说的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌，其特征在于所说的5-氨基乙酰丙酸合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或在其基础上减少、替代和增加一个氨基酸残基的具有5-氨基乙酰丙酸合成酶活性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤1)从类球红细菌的菌液中提取总基因组DNA；2)用聚合酶链式反应扩增出5-氨基乙酰丙酸合成酶基因；3)将扩增出的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因与克隆载体pMD-18T simple连接，进行DNA测序，得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；4)将测序后的目的基因片断与表达载体pET28a连接，构建出重组子pET28a-R.S.hemA；5)将重组子pET28a-R.S.hemA转化至宿主菌中，即可。
5.根据权利要求4所述的生产5-氨基乙酰丙酸的工程菌的构建方法，其特征在于所说的宿主菌为大肠杆菌Rosetta(DE3)。
全文摘要
本发明涉及生产5－氨基乙酰丙酸的工程菌及其构建方法。该菌是含有类球红细菌的5－氨基乙酰丙酸合成酶基因的工程菌。构建方法包括以下步骤1)从类球红细菌的菌液中提取总基因组DNA；2)用聚合酶链式反应扩增出5－氨基乙酰丙酸合成酶基因；3)将扩增出的5－氨基乙酰丙酸合成酶基因与克隆载体pMD－18T simple连接，进行DNA测序；4)将测序后的目的基因片断与表达载体pET28a连接，构建出重组子pET28a－R.S.hemA；5)将重组子pET28a－R.S.hemA转化至宿主菌中，即可。本发明具有较高酶活的可溶性5－氨基乙酰丙酸合成酶表达，且经优化表达后胞外ALA的产量高达6.6g/L。
文档编号C12N15/52GK101063104SQ200710068168
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月20日 优先权日2007年4月20日
发明者林建平, 傅维琦, 岑沛霖 申请人:浙江大学