专利名称：香港海鸥形菌检验技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检验技术，特别是一种细菌的检验技术。
背景技术：
香港海鸥形菌是2001年在香港被首次发现的一种新的肠道致病菌，经深入研究发现，该细菌主要引起感染者腹泻，而食用淡水鱼与外出旅行是该细菌感染的危险因素。由于这是一种新发现的细菌，目前尚未建立对该细菌的一套规范、有效、快捷的检验技术与检验流程。香港在检验香港海鸥形菌时要做生化试验十多项，所以检出率较低，不易发现，检出程序过于复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、实用、快速的香港海鸥形菌检验技术。
本发明的目的是通过下述方法实现的1、取粪便标本，接种在含有头孢哌酮的麦康凯培养基上，放入温度为37℃培养箱内培养48小时后取出；2、肉眼在其内挑选无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落进行纯化培养；3、对培养的菌按以下步骤进行实验第一步用常规革兰染色检验为阴性的短杆菌或弧菌第二步用常规氧化酶、触酶试验必须均为阳性后，第三步再用常规接种在三糖铁培养基试管内，置于温度为37℃培养箱内培养24小时后取出试管；4、用肉眼观察试管内鲜红色培养基保持原来的颜色不变或颜色变得更深；5、凡符合上述实验3)和4)结果的细菌，采用PCR诊断技术诊断，当PCR诊断结果呈阳性，即诊断为香港海鸥形菌。
所述在麦康凯琼脂内加入头孢哌酮的浓度在15～17mg/L之间。所述浓度是16mg/L。所述PCR诊断香港海鸥形菌检验技术的由特异性引物对P2F5’TTGAGGGTGCCCGAAAGGGA3’，P2B5’CTACCCACTTCTGGCGGATT3’。
香港海鸥形菌的检出率较低，甚至发现不了，这主要是与该细菌的检出技术有一定的难度以及检出程序过于复杂有关。
“麦康凯培养基”在医学上是一种古老的、经典的，用于肠道细菌培养的最常用的培养基；但由于肠道细菌众多，且大部分在“麦康凯培养基”上生长得又快又大，一些肠道细菌的菌落要比香港海鸥形菌大数十倍，甚至上百倍，故掩盖了香港海鸥形菌的生长(该细菌菌落较小，且生长较缓慢)；所以，人们很难从长满的细菌的培养皿上发现“小个子”的香港海鸥形菌。为此，根据香港海鸥形菌具有天然耐抗生素---头孢哌酮的这一特点，在麦康凯培养基中加入浓度为16mg/L的头孢哌酮，这样使那些不需要看到的其他肠道细菌都被头孢哌酮抑制了，而“小个子”的香港海鸥形菌就容易被肉眼发现了。
临床上要鉴定一种细菌，往往要做数十种生化试验。这就为我们开展香港海鸥形菌的检出带来复杂的程序以及造成试验成本的提高，在数十种生化试验中，氧化酶试验、触酶试验以及三糖铁试验，这3种试验是香港海鸥形菌所必备的；如前两种生化试验，氧化酶试验、触酶试验，必须是都为阳性反应；而三糖铁试验的颜色观察非常重要，如发现该样本的细菌在三糖铁试管内，经37℃、24小时培养后不会变色，即保持原来的颜色，或颜色变得更深，既是略变黄色，都不会是香港海鸥形菌。如果这3种生化实验均符合要求，该细菌基本就是香港海鸥形菌。
基因诊断技术，由于已获得了香港海鸥形菌菌株，为此，根据其DNA序列检测数据，将其最保守的片段(最具诊断价值)设计为PCR引物。从而，大大提高了诊断的可靠性。从PCR诊断为阳性的香港海鸥形菌的标本中选择10株细菌，送检进行16S rRNA检测验证，结果PCR的诊断符合率为100％。
目前，只要符合上述3种生化试验结果的细菌，送检PCR实验，均为香港海鸥形菌阳性；而PCR阳性的细菌，即可诊断为香港海鸥形菌。对香港海鸥形菌的检验程序进行充分优化，对细菌所要求鉴定的数十种生化实验，选择了这3种必备实验，符合要求的细菌才做PCR，这样大大节约了时间、人力、物力与资金。
本发明由于建立了一套香港海鸥形菌实验诊断(表型诊断+基因诊断)方法，为香港海鸥形菌感染疾病的防治临床治疗提供依据，为香港海鸥形菌作为新的食源性病原菌的进一步深入研究提供实验技术支持。同时具有简便、实用、快速的检验优点，并节约了时间、人力、物力与资金。
图1是本发明的简易的检验流程图。
具体实施例方式
用无菌棉签取腹泻病人甲的新鲜粪便，即插入Cary-Blair运送培养基试管内，送达实验室进行划线培养。来自人体的粪便标本接种在加入浓度为16mg/L头孢哌酮的麦康凯培养基上，再放入温度为37℃培养箱内，培养48小时后，取出培养皿，用肉眼寻找可疑菌落，香港海鸥形菌菌落在这种培养基上为无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落；挑选这些可疑菌落，进行纯化培养后，再按以下步骤开展实验先用常规的革兰染色细菌检验步骤，检验结果为阴性短杆菌或弧菌，再进行以下试验；其次经常规氧化酶试验、触酶试验步骤，检验结果必须均为阳性后；再用常规接种在三糖铁培养基试管内(三糖铁培养基呈现为鲜红色)，置于温度为37℃培养箱内培养24小时后取出试管；用肉眼观察试管内培养基的颜色变化，如保持原来的颜色或颜色变得更深，即符合香港海鸥形菌的生化试验结果。凡符合上述实验步骤结果的细菌，即采用PCR诊断技术诊断，PCR诊断结果呈阳性，即诊断为香港海鸥形菌。
用无菌棉签取腹泻病人乙的新鲜粪便，使用与腹泻病人甲完全相同的检验方法，不同的只是在麦康凯培养基中加入浓度为15mg/L头孢哌酮，同样能诊断出香港海鸥形菌。
取新鲜活草鱼腹部解剖，剪开中、后肠后用无菌棉签取肠内粪便，使用与腹泻病人甲完全相同的检验方法，不同的只是在麦康凯培养基中加入浓度为17mg/L头孢哌酮，同样能诊断出香港海鸥形菌。
取新鲜活鲢鱼，使用与新鲜活草鱼完全相同的检验方法，不同的只是在麦康凯培养基中加入浓度为15mg/L头孢哌酮，同样能诊断出香港海鸥形菌。
取新鲜活鲈鱼，使用与新鲜活草鱼完全相同的检验方法，不同的只是在麦康凯培养基中加入浓度为16mg/L头孢哌酮，同样能诊断出香港海鸥形菌。
从检验的效果看，在麦康凯培养基中加入浓度为16mg/L头孢哌酮的效果最好，其附近浓度的效果逐步次之。
权利要求
1.一种香港海鸥形菌检验技术1)取粪便标本，接种在含有头孢哌酮的麦康凯培养基上，放入温度为37℃培养箱内培养48小时后取出；2)肉眼在其内挑选无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落进行纯化培养；3)对培养的菌按以下步骤进行实验用常规革兰染色检验为阴性的短杆菌或弧菌→经常规氧化酶、触酶试验必须均为阳性后→再用常规接种在三糖铁培养基试管内，置于温度为37℃培养箱内培养24小时后取出试管；4)用肉眼观察试管内鲜红色培养基保持原来的颜色不变或颜色变得更深；5)凡符合实验3)和4)结果的细菌，采用PCR诊断技术诊断，当PCR诊断结果呈阳性，即诊断为香港海鸥形菌。
2.根据权利要求1所述的香港海鸥形菌检验技术，其特征在于所述在麦康凯琼脂中加入头孢哌酮的浓度在15～17mg/L之间。
3.根据权利要求2所述的香港海鸥形菌检验技术，其特征在于所述浓度是16mg/L。
4.根据权利要求1所述的香港海鸥形菌检验技术，其特征在于所述PCR诊断香港海鸥形菌检验技术的由特异性引物对P2F5’TTGAGGGTGCCCGAAAGGGA3’，P2B5’CTACCCACTTCTGGCGGATT3’。
全文摘要
一种香港海鸥形菌检验技术，取粪便标本接种在含头孢哌酮的麦康凯培养基上，放入37℃箱内培养48小时取出；挑无色透明、扁平状，直径在0.5～1.0mm之间的微小菌落进行纯化培养；对培养菌按步骤实验革兰染色检验为阴性短杆菌或弧菌→氧化酶、触酶试验均为阳性→接种在三糖铁培养基试管内，置37℃箱内培养24小时取出；鲜红色培养基的颜色保持不变或变得更深；符合结果的细菌，用PCR诊断技术诊断，当PCR结果呈阳性，即诊断为香港海鸥形菌。本发明为香港海鸥形菌感染疾病的防治与临床治疗提供了依据，为该菌作为新的食源性病原菌的深入研究，提供实验技术支持。具有简便、实用、快速的检验优点，并节约了时间、人力、物力与资金。
文档编号C12Q1/68GK101063164SQ20071006897
公开日2007年10月31日 申请日期2007年6月4日 优先权日2007年6月4日
发明者孙建荣, 项海青, 倪晓平, 任淑华, 李长春, 查捷, 孔庆鑫, 徐虹, 金慧, 俞骅 申请人:杭州市疾病预防控制中心, 杭州市第一人民医院