本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种凝结芽孢杆菌及其利用木质纤维素发酵生产l-乳酸的应用。
背景技术：
：乳酸是一种广泛应用于食品、医药、纺织和化工等行业的多用途的有机酸。作为一种多功能的绿色平台化合物，乳酸被认为是一种很有前景和良好发展潜力的精细化学品。传统的乳酸菌生产方法主要分为化学合成法和微生物发酵法。与传统的化学合成法相比，采用微生物发酵法可以通过不同的菌株，根据不同的需要生产光学纯的l-乳酸或d-乳酸。目前采用微生物发酵法生产乳酸主要存在两个瓶颈问题。一方面，发酵法采用可发酵糖如葡萄糖、淀粉等成本较高；另一方面，发酵过程中灭菌、下游分离纯化成本较高。针对第一个瓶颈问题，可以采用更多廉价的可再生原材料，如农业废弃物中的淀粉或木质纤维素材料，及工业和城市废弃物等作为原材料发酵产乳酸，不仅大大降低乳酸的生产成本，还可以解决部分环境问题，变废为宝。针对第二个瓶颈问题，可以选育一些嗜热的芽孢杆菌来进行发酵。由于嗜热芽孢杆菌对外界环境耐受性强，发酵温度高，杂菌污染几率低，故无需对设备等进行灭菌实行开放式发酵，降低了能源、人力等成本。因此，从上述两个瓶颈问题的解决方法来看，选育耐高温的，可以同时利用五碳糖和六碳糖为发酵底物的菌株是解决问题的关键。对于上述问题，申请公布号为cn102690764的中国发明专利公开了一种用于制备l-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法，该菌株能够以五碳糖或六碳糖为原料，进行发酵后得到l-乳酸，且其产量也较高，但是该菌株主要是以木糖醇生产过程中产生的副产物为原料，尤其是以玉米芯水解液中提取的木糖为原料，而且其在发酵过程中需要补加碳源，因此，其应用受到了极大的限制。申请公布号为cn102643874的中国发明专利公开了芽孢杆菌利用玉米秸秆水解液生产聚合级l-乳酸的方法，具体公开了该芽孢杆菌能够以玉米秸秆水解液作为唯一碳源发酵得到l-乳酸，其l-乳酸产量可达80g/l(每升发酵液生产80gl-乳酸)，虽然其也能够利用玉米秸秆水解液生产l-乳酸，但其产量有待提高。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种凝结芽孢杆菌bc-tj或由其传代而产生的芽孢杆菌，其中所述的芽孢杆菌bc-tj的保藏编号为cgmccno.14044。本发明还提供了上述凝结芽孢杆菌bc-tj或由其传代而产生的芽孢杆菌在制备乳酸中的应用，尤其是制备l-乳酸中的应用。在上述通过凝结芽孢杆菌bc-tj或由其传代而产生的芽孢杆菌制备乳酸的应用中，其原料可为木质纤维素水解液。示例性地，木质纤维素选自玉米秸秆、小麦秸秆、稻草秸秆或其他农作物秸秆中的一种或多种。本发明还提供了一种培养基，该培养基包含上述凝结芽孢杆菌bc-tj或由其传代而产生的芽孢杆菌。示例性的，所述培养基为上述凝结芽孢杆菌bc-tj或由其传代而产生的芽孢杆菌发酵后的培养基。进一步的，所述培养基中还包含木质纤维素水解液。示例性的，木质纤维素水解液为玉米秸秆水解液、小麦秸秆水解液、稻草秸秆水解液或其他农作物秸秆水解液。优选地，所述玉米秸秆是经过酸水解或酶水解或酸酶联和水解所得的水解液。本发明还提供上述凝结芽孢杆菌bc-tj或由其传代而产生的芽孢杆菌经过遗传修改而制备的芽孢杆菌。本发明还提供制备乳酸的制备方法，其包括通过上述凝结芽孢杆菌bc-tj或由其传代而产生的芽孢杆菌发酵木质纤维素，优选为木质纤维素水解液。示例性的，木质纤维水解液为玉米秸秆水解液、小麦秸秆水解液、稻草秸秆水解液或其他农作物秸秆水解液。具体地，本发明所述的制备乳酸的方法包括：将凝结芽孢杆菌bc-tj或其传代而产生的芽孢杆菌接种于含有木质纤维素水解液(例如玉米秸秆水解液、小麦秸秆水解液、稻草秸秆水解液或其他农作物秸秆水解液)的处理培养基中，在适宜温度下发酵。所述秸秆水解液为秸秆的酸水解液或酶水解液或酸酶联合水解液。示例性的，上述制备方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌bc-tj种子液，接种到处理培养基中，在30℃-60℃，优选的为50℃条件下静置培养直至培养基中总还原糖和l-乳酸含量稳定时结束发酵。示例性的，上述所述酸酶联和水解液的制备方法包括：1)将秸秆(例如玉米秸秆、小麦秸秆、稻草秸秆或其他农作物秸秆)浸泡在稀硫酸中进行预处理，且任选地，将处理过的秸秆进行水洗，过滤，烘干后用于酶解；2)在上述预处理后的秸秆中加入纤维素酶液和β-葡萄糖苷酶酶液酶解处理；和3)将酶解后的产物静置或离心，收集上清，即为秸秆水解液。本发明还提供包含上述凝结芽孢杆菌bc-tj或由其传代而产生的芽孢杆菌的培养物或其加工物。本发明筛选出了一种凝结芽孢杆菌bc-tj，其保藏编号为cgmccno.14044。该菌株为兼性厌氧菌株，在有氧和无氧条件下均能生长，且发酵温度高，发酵过程中，杂菌污染几率小，无需对设备等进行灭菌，实行开放式发酵，降低了能源、人力等成本。该菌株利用木质纤维素水解液为原料发酵生产l-乳酸，其产量可达160±1.5g/l，光学纯度达100％，发酵生产能力为2.2g/l/h。其在发酵过程中，无需补充还原性糖，能够进一步降低生产成本，其在大规模工业生产中具有较大的潜力。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1菌株的分离及筛选试验过程所用培养基如下：富集培养基：每升培养基中含有木糖10g，酵母粉10g，其余为蒸馏水，ph6.0，115℃灭菌20min。发酵培养基：每升培养基中含有木糖50g，酵母粉10g，其余为蒸馏水，ph6.0，115℃灭菌20min。生长培养基：每升培养基中含有木糖30g，酵母粉10g，caco310g，琼脂粉15～20g，ph6.5，115℃灭菌20min。种子培养基：每升培养基中含有葡萄糖50g，酵母粉10g，caco320g，其余为蒸馏水，ph6.5，115℃灭菌20min。处理培养基：气爆玉米秸秆水解液100～150ml，酵母粉10g，caco330g，ph6～7，115℃灭菌20min。采集河北农村堆肥样品，称取1g置于20ml富集培养基中，50℃富集培养12h。置于80℃水浴锅中加热20min，杀死不形成芽孢的菌体，取出后进行梯度稀释分离。待长出单菌落后，挑选生长速度快和产透明圈面积大的菌落进行纯化培养。将纯化后的菌株接入发酵培养基中50℃静置培养48h，采用生物传感分析仪sba-40d测定l-乳酸含量。生物传感分析仪sba-40d是以l-乳酸为底物，与氧气、水在酶的催化作用下生成h2o2。h2o2透过酶膜的内层在铂金电极表面失去电子还原成h2o，铂电极获得电子产生电流信号，该电流信号与h2o2的浓度成比例，而h2o2浓度与底物浓度成线性比例关系。通过比较被测物和标准样品产生的h2o2量，就可计算出被测样品中底物的含量。经过多次重复筛选，选取出一种乳酸产量最高的菌株bc-tj，将其保存并进行后续实验。实施例2菌株bc-tj的菌落形态特征与生理生化特征将菌株bc-tj接种于生长培养基上生长24h后，观察其菌落呈圆形，表面光滑，呈乳白色，边缘平滑。革兰氏染色呈阳性，细胞形态为杆状，菌体大小为(0.7～0.9)×(3～5)μm，内生芽孢。该菌株的适宜生长温度为30℃～60℃，最适生长ph为5.5～6.5。在生理生化试验中，明胶液化、吲哚实验和葡萄糖发酵产气为阴性；淀粉水解、v.p实验为阳性，60℃有氧条件和厌氧条件下均能生长。具体实验结果参见表1。表1菌株bc-tj的生理生化实验结果注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。实施例3菌株bc-tj的16srdna序列分析为了更准确的鉴定分离得到的菌株bc-tj，对该菌株bc-tj的16srdna序列进行扩增和比对。首先提取该菌株bc-tj的基因组dna，用于16srdna序列扩增的模板。将静置培养过夜的菌株bc-tj，12000rpm室温离心1min收集菌体，采用细菌dna提取试剂盒进行dna提取(天根生化科技(北京)有限公司)，方法按照说明书所述进行。16srdna序列扩增引物：27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’1492r：5’-ggytaccttacgactt-3’反应条件：95℃预变性5min；5℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；后72℃延伸10min。反应体系：模板1μl，buffer5μl，fast-pfutaq酶1μl，dntp(2.5mmeach)4μl，正反向引物(100mm)各0.4μl，ddh2o补足至50μl反应体系。目的片段胶回收后送测序。序列测定结果在ncbi中(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blastn比对。结果显示，所得序列与凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)同源性高达99％，再结合形态学、生理生化测定结果，参考bergey’smanualofdeterminativebacteriology(holtjg等1994)确定菌株bc-tj为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)bc-tj，并将其送于保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏日期：2017年4月18日，保藏号：cgmccno.14044。实施例4凝结芽孢杆菌bc-tj发酵玉米秸秆发酵液生产l-乳酸1.气爆玉米秸秆水解液的获得气爆玉米秸秆通过蒸汽爆破设备处理。反应条件如下：将玉米秸秆浸泡在3％的稀硫酸中2h，170℃处理5min。然后将处理过的玉米秸秆用10倍体积的水洗10次，过滤后烘干直接用于酶解。采用里氏木霉纤维素酶酶液与黑曲霉β-葡萄糖苷酶酶液处理气爆玉米秸秆。酶解反应体系及条件如下：底物加载量为10％(w/v)，纤维素酶为15fpu/g底物，β-葡萄糖苷酶为30cbu/g底物，反应于50mm，ph4.8的柠檬酸缓冲液中进行48h。酶解后的水解产物8000rpm离心10min，收集上清，即为气爆玉米秸秆水解液，作为培养基成分在发酵过程中添加。2.乳酸含量的测定乳酸含量测定采用液相色谱法。采用waters600高效液相色谱仪系统，色谱柱采用手性柱chirex3126(d)-penicillami，4.6mmid×250mml。流动相2mmol/lcuso4溶液，其中溶剂为5％的异丙醇溶液，流动相流速为0.7ml/min，柱温30℃，紫外检测器波长为254nm，进样量为2pl，用empower积分软件积分。待测样品以及流动相等使用前经0.22μm滤膜过滤后超声脱气。根据标准品做出标准曲线，然后再根据标准曲线计算出样品中乳酸的含量。3.总还原糖的测定总还原糖测定采用dns法(3，5-二硝基水杨酸比色法)。首先将葡萄糖稀释不同的梯度制备葡萄糖标准曲线，再根据标准曲线进行浓度计算。具体反应如下：试管内添加0.5ml的葡萄糖溶液样品，添加0.05mm，ph4.8柠檬酸缓冲液1ml，50℃水浴反应60min；添加3ml的dns反应液，混匀，沸水浴加热5min，冷却至室温；540nm波长下，测定样品的吸光度。4.光学纯度计算l-乳酸的光学纯度＝(l-乳酸产量-d-乳酸产量)/(l-乳酸产量+d-乳酸产量)×100％5.l-乳酸发酵生产能力计算l-乳酸生产能力(g/l/h)＝l-乳酸产量(g/l)/发酵时间(h)6.凝结芽孢杆菌bc-tj发酵生产l-乳酸将保存于-80℃甘油中的菌株bc-tj划线接种于生长培养基上，50℃培养24h活化菌种；在无菌条件下将接种环1环菌种接于含有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃静置培养20h后作为种子；种子按10％的接种量接入处理培养基中，50℃静置培养直到培养基中总还原糖和l-乳酸含量稳定时结束发酵。发酵结束后根据上述的测定方法，对各个指标进行测定和计算。实验结果详见表2。表2凝结芽孢杆菌bc-tj发酵产l-乳酸的情况水解液(ml/l)100125150发酵完成所需时间(h)72h72h72hl-乳酸(g/l)112±2.1143±3.1160±1.5转化率(g/ml)1.121.141.07生产能力(g/l/h)1.561.992.22凝结芽孢杆菌bc-tj大规模生产l-乳酸的应用利用本发明提供的凝结芽孢杆菌bc-tj发酵大规模生产l-乳酸时，将种子培养基以体积比为5％～20％的接种量接入发酵罐，发酵罐可根据实际生产需要选用1m3、2m3、3m3或更大体积的发酵罐，发酵罐装入量为70％～80％(v/v)，不通气搅拌，搅拌速率为80-100r/min。大规模的发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，本发明提供的凝结芽孢杆菌bc-tj的碳源和氮源选择十分广泛，碳源可以为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖或玉米、大米、红薯、木薯或玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉等淀粉类物质或玉米秸秆、小麦秸秆、稻草秸秆或其他农作物秸秆类物质中的一种或多种，其中淀粉类物质经酶法液化、糖化制备成水解糖，农作物秸秆类物质经酸水解或酶水解或酸梅联合水解制备成水解液。氮源可以为蛋白胨、酵母粉、酵母膏、牛肉膏、麦根、麸皮、米糠、玉米浆、大豆肽、棉籽蛋白等中的一种或多种。在发酵过程中按照质量体积比加入caco3，以控制处理培养基的ph维持在4.5-6.5。发酵温度为40℃～60℃，优选的为50℃。本发明提供的保藏号为cgmccno.14044的凝结芽孢杆菌bc-tj在不供氧的环境下，通过半连续间歇发酵方式或中间补糖发酵方式生产高光学纯度的l-乳酸。下面以玉米秸秆水解液为例说明本发明半连续间歇发酵方式或中间补糖发酵方式大规模生产l-乳酸的过程。应用实例1半连续间歇发酵方式大规模生产l-乳酸将保存于-80℃甘油中的凝结芽孢杆菌bc-tj划线接种于生长培养基中，40℃～50℃培养18～24h活化菌种；在无菌条件下将接种环1环菌种接于种子培养基中，50℃静置培养20h后作为种子；种子按5％～20％的接种量接入装有处理培养基的发酵罐中，发酵罐可根据实际生产需要选用1m3、2m3、3m3或更大体积的发酵罐，温度控制在40℃～60℃，优选的为45℃～55℃，更优选的为50℃，厌氧发酵24～48h，不通气搅拌，搅拌转速为80～100r/min，当发酵液中葡萄糖残留≤0.3g/l时，结束发酵，将此发酵液的5％～20％作为种子液转接入新鲜的处理培养基中进行下一批次的发酵，其余的发酵液进入提取工序。将其余乳酸发酵液过滤除去固形不溶物，得到乳酸钙溶液；然后向乳酸钙溶液中加入硫酸酸解，硫酸的质量分数为30％，处理温度为70℃，控制最终酸解体系的ph值为2.5。酸解后进行过滤，得到酸解后乳酸溶液，加热浓缩除去乳酸溶液中80％的水分，得到初步浓缩的乳酸溶液。将初步浓缩的乳酸溶液温度升至40℃，加入乳酸溶液质量1.5％的活性炭，持续搅拌25min进行脱色处理，得到脱色后的乳酸清液，在上述清液中加入0.02倍体积的正丁醇，通过采用薄膜蒸发进行二次浓缩脱水，控制真空度为80kpa，至乳酸清液中乳酸含量为91％，得到脱色后乳酸浓缩液。将上述乳酸浓缩液置于冰水浴中，待温度降至15℃时，向其中加入浓缩液质量0.5％的醋酸钠，并边搅拌边缓慢加入浓缩液3倍体积的乙醇，经过25min左右，体系的温度降至5℃，停止降温，过滤得到不溶固形物和乳酸滤液。将所得固形物中加入乙醇洗涤，加入量为上述乙醇使用量的0.6倍，过滤后得到沉淀物和乳酸滤液。将两部分乳酸滤液混合，在真空度90kpa下进行减压蒸馏，脱除其中的有机溶剂(正丁醇、乙醇)及残余水分。最后，通过分子蒸馏进行精制，温度为70℃，压力为20pa。l-乳酸的收率为94.6％，光学纯度为100％。应用实例2中间补糖发酵方式大规模生产l-乳酸将保存于-80℃甘油中的凝结芽孢杆菌bc-tj划线接种于生长培养基中，40℃～50℃培养18～24h活化菌种；在无菌条件下将接种环1环菌种接于种子培养基中，50℃静置培养20h后作为种子；种子按5％～20％的接种量接入装有处理培养基的发酵罐中，发酵罐可根据实际生产需要选用1m3、2m3、3m3或更大体积的发酵罐，温度控制在40℃～60℃，优选的为45℃～55℃，更优选的为50℃，不通气搅拌，搅拌转速为80～100r/min，厌氧发酵12～24h，补加玉米秸秆水解液，继续发酵，60-72h后反应结束，发酵液进入提取工序。将上述乳酸发酵液过滤除去固形不溶物，得到乳酸钙溶液；然后向乳酸钙溶液中加入硫酸酸解，硫酸的质量分数为30％，处理温度为70℃，控制最终酸解体系的ph值为2.5。酸解后进行过滤，得到酸解后乳酸溶液，加热浓缩除去乳酸溶液中80％的水分，得到初步浓缩的乳酸溶液。将初步浓缩的乳酸溶液温度升至40℃，加入乳酸溶液质量1.5％的活性炭，持续搅拌25min进行脱色处理，得到脱色后的乳酸清液，在上述清液中加入0.02倍体积的正丁醇，通过采用薄膜蒸发进行二次浓缩脱水，控制真空度为80kpa，至乳酸清液中乳酸含量为91％，得到脱色后乳酸浓缩液。将上述乳酸浓缩液置于冰水浴中，待温度降至15℃时，向其中加入浓缩液质量0.5％的醋酸钠，并边搅拌边缓慢加入浓缩液3倍体积的乙醇，经过25min左右，体系的温度降至5℃，停止降温，过滤得到不溶固形物和乳酸滤液。将所得固形物中加入乙醇洗涤，加入量为上述乙醇使用量的0.6倍，过滤后得到沉淀物和乳酸滤液。将两部分乳酸滤液混合，在真空度90kpa下进行减压蒸馏，脱除其中的有机溶剂(正丁醇、乙醇)及残余水分。最后，通过分子蒸馏进行精制，温度为70℃，压力为20pa。l-乳酸的收率为93.2％，光学纯度为100％。本发明提供的保藏号为cgmccno.14044的凝结芽孢杆菌bc-tj是一种新的可用于l-乳酸发酵生产的耐高温微生物，能在不供氧的情况下同型发酵生产光学纯度为100％的l-乳酸，其产率可高达160±1.5g/l，发酵生产能力为2.2g/l/h。该菌株发酵玉米秸秆发酵液生产l-乳酸，其发酵过程简单，无需供氧，减少了无菌空气供给所需的能耗及发酵罐的搅拌能耗，节约了生产成本。该菌株的最适合发酵温度为40℃-60℃，其较高的发酵温度能够使杂菌污染的机会大大减少。另外，该菌株的发酵底物为玉米秸秆、小麦秸秆、稻草秸秆或其他农作物秸秆的水解液中的一种或多种，能够将玉米秸秆、小麦秸秆、稻草秸秆等秸秆废弃物充分利用起来，变废为宝，避免污染环境。利用该菌株大规模发酵玉米秸秆水解液，l-乳酸的得率在93％以上，光学纯度为100％，因此，该菌株能够应用于大规模的工业生产。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。<110>中国科学院天津工业生物技术研究所<120>凝结芽孢杆菌及其制备l-乳酸的应用<130>2017<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工合成<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>16<212>dna<213>人工合成<400>2ggytaccttacgactt16当前第1页12