本发明涉及发酵饮料技术领域，具体的说是一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料及其制备方法。
背景技术：
益生菌是定植于动物的肠道系统内，能够对寄主产生确切的作用，能够促进益于寄主健康的菌群的生长繁殖、抑制致病菌、平衡肠道菌群、促进人类健康，在食品中益生菌主要用于发酵乳制品的生产，但它也正逐步被用于开发各种功能食品，如果汁、糖果、冰棋淋、冷冻酸奶等。到目前为止，科学家发现的益生菌大体上可以分为三大类：包括乳杆菌类、双歧杆菌类及革兰氏阳性球菌。
凝结芽孢杆菌，属于芽孢杆菌属，两端钝圆，革兰氏阳性菌。该菌株能够产生l-乳酸，属于同型乳酸发酵；能产生大量的代谢产物，如l-乳酸、凝固素，从而有效地调整肠道菌群的结构，增加肠道细菌的数量。因此，近年来在益生菌研究领域属于热点研究内容。凝结芽孢杆菌除具有和乳酸菌及双歧杆菌同样的保健功效外，还具有耐酸、耐热、耐盐、容易培养和保存的特点。2013年，凝结芽孢杆菌正式录入《中国饲料添加剂品种名录》，2016年，国家卫生计生委将凝结芽孢杆菌正式列入《可用于食品的菌种名单》。
南瓜，营养丰富且全面，含有果胶、戊聚糖、甘露醇、腺嘌呤、膳食纤维、纤维素、蛋白质、多种氨基酸、脂肪等成分。在三大产热营养素中，南瓜以碳水化合物为主，脂肪含量很低，为很好的低脂肪食品。同时，南瓜中还含有能够促进胰脏分泌胰岛素的环丙基氨基酸，能够增加葡萄糖转运体含量，防治糖尿病。南瓜中的微量矿物质对糖尿病和血脂代谢有一定的调节作用。现阶段，南瓜的深加工产品主要为南瓜粉、南瓜酱、南瓜果脯等，本发明为南瓜的深加工开辟了一条新途径。
技术实现要素：
本发明提供了一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料及其制备方法，将新列入可食用菌种名单的凝结芽孢杆菌作为发酵菌株发酵南瓜汁，在适宜比例的基础上，优化发酵工艺，所得到的常温活菌饮料既保持了南瓜本身特有的香气，还具有浓郁的发酵香气，酸甜适中、风味独特。
本发明为解决上述技术问题采用的技术方案为：一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料，该常温活菌饮料由南瓜浆经果胶酶、纤维素酶和糖化酶酶解后与凝结芽孢杆菌混合发酵并加入调味剂调和而成；其中，每100重量份的南瓜块原料中，加入的果胶酶、纤维素酶、糖化酶和调味剂的重量份数依次为：果胶酶0.18-0.5份，纤维素酶0.5-1.8份，糖化酶0.25-1.5份，调味剂4.75-7.25份。
作为一种优选方案，所述调味剂由以下重量份数的原料组成：蔗糖4-6份、柠檬酸0.4-0.6份、柠檬酸钠0.3-0.5份和黄原胶0.05-0.15份。
作为一种优选方案，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌bc361。
作为一种优选方案，所述的南瓜浆由南瓜块原料煮熟后加水打浆而成，其中，打浆时，南瓜块原料与水的重量比为1：1-5。
作为一种优选方案，所述果胶酶的酶活力单位为1万-4万u/g，纤维素酶的酶活力单位为2万-6万u/g，糖化酶的酶活力单位是5万-10万u/g。
制备如上所述的一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料的方法，包括以下步骤：
步骤一、南瓜浆的制备
选择无病虫危害腐蚀的成熟南瓜，用水清洗干净后，切去表皮、去籽瓤，然后切成0.5-2cm厚的片状作为南瓜块原料；将南瓜块原料放入沸水中煮2-10min，向煮熟的南瓜块原料中加入水倒入打浆机中打浆，再通过胶体磨细磨2-3次，得到南瓜浆；
步骤二、称取原料
按照如上所述的重量份数分别称取果胶酶、纤维素酶、糖化酶、凝结芽孢杆菌、调味剂以及步骤一制备的南瓜浆，备用；
步骤三、酶解
将步骤二称取好的果胶酶，纤维素酶和糖化酶加入到步骤一制得的南瓜浆中，在35-60℃条件下酶解1-4h，得酶解后的南瓜浆，备用；
步骤四、过滤、灭菌
将步骤三酶解后的南瓜浆置于滤网中过滤得到南瓜发酵液，在100-115℃下，高温灭菌10-30min，得灭菌后的南瓜汁；
步骤五、菌种活化
从试管斜面中挑取1-2环菌落置于ypd培养基中，在30-38℃培养16-20h，活化两次，得到富集的凝结芽孢杆菌；
步骤六、接种发酵
将步骤四制得的灭菌后的南瓜汁作为发酵液接种，接入步骤五制得的富集的凝结芽孢杆菌，在30-38℃条件下培养12-48h，得发酵后的南瓜汁；
步骤七、调配
往步骤六制得的发酵后的南瓜汁中分别加入步骤二称取的调味剂，经过滤、均质、灌装，得一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料。
作为一种优选方案，步骤一所述打浆时，南瓜块原料与水的重量比为1：1-5。
作为一种优选方案，步骤六所述凝结芽孢杆菌的接种量为步骤四制得的灭菌后的南瓜汁总重量的1-3%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供了一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料及其制备方法，使用凝结芽孢杆菌作为发酵菌株，凝结芽孢杆菌除具有和乳酸菌及双歧杆菌同样的保健功效外，还具有耐酸、耐热、耐盐、容易培养和保存的特点；南瓜营养全面且丰富，主要为淀粉、果胶和纤维素，通过加入糖化酶、果胶酶和纤维素酶，可将南瓜中的大分子物质酶解为小分子，提高还原糖含量，同时能迅速降解南瓜果肉细胞壁的胞间层和初生壁中的果胶和纤维素、半纤维素，使得细胞壁破碎，内容物溶出；通过在酶解后的南瓜汁中接种凝结芽孢杆菌进行发酵，优化发酵工艺，制成新型益生菌常温活菌发酵南瓜汁，工艺独特，操作简单，该产品营养丰富，为凝结芽孢杆菌作为可食用菌株产品的开发提供一定的参考；
（2）本发明提供了一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料及其制备方法，既保持了南瓜本身特有的香气，还具有浓郁的发酵香气，酸甜适中、风味协调，并且含有易于常温保存的益生凝结芽孢杆菌，易于常温保存；且利用本发明制备方法制备的凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料菌落总数达到5×108-1.51×109cfu/g，远远高于国家对活菌饮料的菌落总数的要求106cfu/g；
（3）本发明提供了一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料及其制备方法，使用凝结芽孢杆菌作为发酵菌株，经过发酵后，南瓜中的β-胡萝卜素和维生素c等一些营养成分流失较小，营养物质得到较大程度地保留。
生物材料的保藏
本发明所述凝结芽孢杆菌bc361作为发酵菌株时，感官评价较优，且菌落总数、可滴定酸度较高，因此，作为一种优选方案，选用凝结芽孢杆菌bc361作为发酵菌株；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.9951，保藏日期为2014年11月13日。
附图说明
图1为候选菌株16srdna基因序列的系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作详细说明，本实施例以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料，该常温活菌饮料由南瓜浆经果胶酶、纤维素酶和糖化酶酶解后与凝结芽孢杆菌混合发酵并加入调味剂调和而成；其中，每100重量份的南瓜块原料中，加入的果胶酶、纤维素酶、糖化酶和调味剂的重量份数依次为：果胶酶0.18-0.5份，纤维素酶0.5-1.8份，糖化酶0.25-1.5份，调味剂4.75-7.25份。
作为一种优选方案，所述调味剂由以下重量份数的原料组成：蔗糖4-6份、柠檬酸0.4-0.6份、柠檬酸钠0.3-0.5份和黄原胶0.05-0.15份。
作为一种优选方案，所述的南瓜浆由南瓜块原料煮熟后加水打浆而成，其中，打浆时，南瓜块原料与水的重量比为1：1-5。
作为一种优选方案，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌bc361。
作为一种优选方案，所述果胶酶的酶活力单位为1万-4万u/g，纤维素酶的酶活力单位为2万-6万u/g，糖化酶的酶活力单位是5万-10万u/g。
制备如上所述的一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料的方法，包括以下步骤：
步骤一、南瓜浆的制备
选择无病虫危害腐蚀的成熟南瓜，用水清洗干净后，切去表皮、去籽瓤，然后切成0.5-2cm厚的片状作为南瓜块原料；将南瓜块原料放入沸水中煮2-10min，作为优选的，南瓜块原料煮至熟透为止，以破坏酶的活性，防止酶促褐变，使组织充分软化，更利于打浆，向煮熟的南瓜块原料中加入水倒入打浆机中打浆，作为优选的，打浆时，南瓜块原料与水的重量比为1：1-5，再通过胶体磨细磨2-3次，得到南瓜浆；
步骤二、称取原料
按照如上所述的重量份数分别称取果胶酶、纤维素酶、糖化酶、凝结芽孢杆菌、调味剂以及步骤一制备的南瓜浆，备用；
步骤三、酶解
将步骤二称取好的果胶酶，纤维素酶和糖化酶加入到步骤一制得的南瓜浆中，在35-60℃条件下酶解1-4h，使南瓜浆中的果胶质、纤维素及淀粉充分酶解，提高还原糖含量，同时能迅速降解南瓜果肉细胞壁的胞间层和初生壁中的果胶和纤维素、半纤维素，使得细胞壁破碎，内容物溶出，得酶解后的南瓜浆，备用；
步骤四、过滤、灭菌
将步骤三酶解后的南瓜浆置于滤网中过滤得到南瓜发酵液，在100-115℃下，高温灭菌10-30min，得灭菌后的南瓜汁；
步骤五、菌种活化
从置于冰箱中冷藏，冷藏温度为4℃的试管斜面中挑取1-2环菌落置于ypd培养基中，在30-38℃培养16-20h，活化两次，得到富集的凝结芽孢杆菌；
步骤六、接种发酵
将步骤四制得的灭菌后的南瓜汁作为发酵液接种，接入步骤五制得的富集的凝结芽孢杆菌，在30-38℃条件下培养12-48h，得发酵后的南瓜汁，作为优选的，凝结芽孢杆菌的接种量为步骤四制得的灭菌后的南瓜汁总重量的1-3%；
步骤七、调配
往步骤六制得的发酵后的南瓜汁中分别加入步骤二称取的调味剂，经过滤、均质、灌装，得一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料。
实施例一
一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料，该常温活菌饮料由南瓜浆经果胶酶、纤维素酶和糖化酶酶解后与凝结芽孢杆菌bc361混合发酵并加入调味剂调和而成，所述的南瓜浆由南瓜块原料煮熟后加水打浆而成，所述调味剂由蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠和黄原胶组成；其中，每100重量份的南瓜块原料中，加入的果胶酶、纤维素酶、糖化酶、蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠和黄原胶的重量份数依次为：果胶酶0.18份，纤维素酶0.5份，糖化酶0.25份，蔗糖4份，柠檬酸0.4份，柠檬酸钠0.3份，黄原胶0.05份；其中，打浆时，南瓜块原料与水的重量比为1：1，作为一种优选方案，所述果胶酶的酶活力单位为1万-4万u/g，纤维素酶的酶活力单位为2万-6万u/g，糖化酶的酶活力单位是5万-10万u/g。
制备如上所述的一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料的方法，包括以下步骤：
步骤一、南瓜浆的制备
选择无病虫危害腐蚀的成熟南瓜，用水清洗干净后，切去表皮、去籽瓤，然后切成0.5cm厚的片状作为南瓜块原料；将南瓜块原料放入沸水中煮2min，向煮熟的南瓜块原料中加入水倒入打浆机中打浆，再通过胶体磨细磨2次，得到南瓜浆；
步骤二、称取原料
按照如上所述的重量份数分别称取果胶酶、纤维素酶、糖化酶、凝结芽孢杆菌bc361、蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠、黄原胶以及步骤一制备的南瓜浆，备用；
步骤三、酶解
将步骤二称取好的果胶酶，纤维素酶和糖化酶加入到步骤一制得的南瓜浆中，在35℃条件下酶解1h，得酶解后的南瓜浆，备用；
步骤四、过滤、灭菌
将步骤三酶解后的南瓜浆置于滤网中过滤得到南瓜发酵液，在100℃下，高温灭菌10min，得灭菌后的南瓜汁；
步骤五、菌种活化
从试管斜面中挑取1环菌落置于ypd培养基中，在30℃培养16h，活化两次，得到富集的凝结芽孢杆菌bc361；
步骤六、接种发酵
将步骤四制得的灭菌后的南瓜汁作为发酵液接种，接入步骤五制得的富集的凝结芽孢杆菌bc361，在30℃条件下培养12h，得发酵后的南瓜汁，作为优选的，凝结芽孢杆菌的接种量为步骤四制得的灭菌后的南瓜汁总重量的1%，此时产品酸度为0.27％，ph为4.10，菌落总数为5.07×108cfu/g；
步骤七、调配
往步骤六制得的发酵后的南瓜汁中分别加入步骤二称取的蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠和黄原胶，经过滤、均质、灌装，得一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料。
实施例二
一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料，该常温活菌饮料由南瓜浆经果胶酶、纤维素酶和糖化酶酶解后与凝结芽孢杆菌混合发酵并加入调味剂调和而成，所述的南瓜浆由南瓜块原料煮熟后加水打浆而成，所述调味剂由蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠和黄原胶组成；其中，每100重量份的南瓜块原料中，加入的果胶酶、纤维素酶、糖化酶、蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠和黄原胶的重量份数依次为：果胶酶0.5份，纤维素酶1.8份，糖化酶1.5份，蔗糖6份，柠檬酸0.6份，柠檬酸钠0.5份，黄原胶0.15份；其中，打浆时，南瓜块原料与水的重量比为1：5，作为一种优选方案，所述果胶酶的酶活力单位为1万-4万u/g，纤维素酶的酶活力单位为2万-6万u/g，糖化酶的酶活力单位是5万-10万u/g。
制备如上所述的一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料的方法，包括以下步骤：
步骤一、南瓜浆的制备
选择无病虫危害腐蚀的成熟南瓜，用水清洗干净后，切去表皮、去籽瓤，然后切成2cm厚的片状作为南瓜块原料；将南瓜块原料放入沸水中煮10min，向煮熟的南瓜块原料中加入水倒入打浆机中打浆，再通过胶体磨细磨3次，得到南瓜浆；
步骤二、称取原料
按照如上所述的重量份数分别称取果胶酶、纤维素酶、糖化酶、凝结芽孢杆菌、蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠、黄原胶以及步骤一制备的南瓜浆，备用；
步骤三、酶解
将步骤二称取好的果胶酶，纤维素酶和糖化酶加入到步骤一制得的南瓜浆中，在60℃条件下酶解4h，得酶解后的南瓜浆，备用；
步骤四、过滤、灭菌
将步骤三酶解后的南瓜浆置于滤网中过滤得到南瓜发酵液，在115℃下，高温灭菌30min，得灭菌后的南瓜汁；
步骤五、菌种活化
从试管斜面中挑取2环菌落置于ypd培养基中，在38℃培养20h，活化两次，得到富集的凝结芽孢杆菌；
步骤六、接种发酵
将步骤四制得的灭菌后的南瓜汁作为发酵液接种，接入步骤五制得的富集的凝结芽孢杆菌，在38℃条件下培养48h，得发酵后的南瓜汁，作为优选的，凝结芽孢杆菌的接种量为步骤四制得的灭菌后的南瓜汁总重量的3%，此时产品酸度为0.45％，ph为3.95，菌落总数为1.1×109cfu/g；
步骤七、调配
往步骤六制得的发酵后的南瓜汁中分别加入步骤二称取的蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠和黄原胶，经过滤、均质、灌装，得一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料。
实施例三
一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料，该常温活菌饮料由南瓜浆经果胶酶、纤维素酶和糖化酶酶解后与凝结芽孢杆菌混合发酵并加入调味剂调和而成，所述的南瓜浆由南瓜块原料煮熟后加水打浆而成，所述调味剂由蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠和黄原胶组成；其中，每100重量份的南瓜块原料中，加入的果胶酶、纤维素酶、糖化酶、蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠和黄原胶的重量份数依次为：果胶酶0.3份，纤维素酶1.2份，糖化酶0.9份，蔗糖5份，柠檬酸0.5份，柠檬酸钠0.4份，黄原胶0.1份；其中，打浆时，南瓜块原料与水的重量比为1：3，作为一种优选方案，所述果胶酶的酶活力单位为1万-4万u/g，纤维素酶的酶活力单位为2万-6万u/g，糖化酶的酶活力单位是5万-10万u/g。
制备如上所述的一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料的方法，包括以下步骤：
步骤一、南瓜浆的制备
选择无病虫危害腐蚀的成熟南瓜，用水清洗干净后，切去表皮、去籽瓤，然后切成1.2cm厚的片状作为南瓜块原料；将南瓜块原料放入沸水中煮6min，向煮熟的南瓜块原料中加入水倒入打浆机中打浆，再通过胶体磨细磨2次，得到南瓜浆；
步骤二、称取原料
按照如上所述的重量份数分别称取果胶酶、纤维素酶、糖化酶、凝结芽孢杆菌、蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠、黄原胶以及步骤一制备的南瓜浆，备用；
步骤三、酶解
将步骤二称取好的果胶酶，纤维素酶和糖化酶加入到步骤一制得的南瓜浆中，在48℃条件下酶解3h，得酶解后的南瓜浆，备用；
步骤四、过滤、灭菌
将步骤三酶解后的南瓜浆置于滤网中过滤得到南瓜发酵液，在108℃下，高温灭菌20min，得灭菌后的南瓜汁；
步骤五、菌种活化
从试管斜面中挑取2环菌落置于ypd培养基中，在34℃培养18h，活化两次，得到富集的凝结芽孢杆菌；
步骤六、接种发酵
将步骤四制得的灭菌后的南瓜汁作为发酵液接种，接入步骤五制得的富集的凝结芽孢杆菌，在34℃条件下培养30h，得发酵后的南瓜汁，作为优选的，凝结芽孢杆菌的接种量为步骤四制得的灭菌后的南瓜汁总重量的2%，此时产品酸度为0.405％，ph为3.96，菌落总数为1.51×109cfu/g；
步骤七、调配
往步骤六制得的发酵后的南瓜汁中分别加入步骤二称取的蔗糖、柠檬酸、柠檬酸钠和黄原胶，经过滤、均质、灌装，得一种凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料。
试验研究数据
一、bc361分离筛选与鉴定
分离筛选：从生态养殖场健康仔猪盲肠及粪便样品中分离筛选凝结芽孢杆菌，称取1g样品添加到9ml无菌生理盐水中，涡旋仪混匀；80℃水浴，10min除去非芽孢细菌体；按照1％的接种量接种于改良lb培养基中，37℃培养20h后于改良碳酸钙鉴定平板上进行稀释涂布；挑选有溶钙圈且生长良好的单菌落进行革兰氏染色、芽孢染色、和接触酶试验，选取革兰氏阳性、产芽孢且接触酶为阳性的杆状细菌作为候选凝结芽孢杆菌，继续纯化培养，保藏备用。
鉴定：
1.生理生化鉴定（参照《伯杰细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》和《微生物学实验教程》进行生理生化鉴定相关试验）
由表1可看出候选菌株与标准凝结芽孢杆菌的生理生化特征基本一致，初步鉴定为凝结芽孢杆菌。
2.16srdna分子生物学鉴定
如图1所示，通过细菌基因组dna提取试剂盒提取bc361基因组dna，以p0和pc3为上下游引物进行pcr扩增，扩增出约750bp的特异条带并进行测序。测序结果提交到eztaxon数据库进行比对。采用mega5.0软件构建系统发育树，从进化距离分析发现bc361与b.coagulansiam12463标准模式菌株接近。这与生理生化鉴定结果一致，因此，将它们鉴定为凝结芽孢杆菌。
二、成品凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料品质分析
目前，市场上的益生菌产品通常以发酵乳和酸奶的形式。然而，随着素食主义消费者以及乳糖不耐症患者的增加，对非乳益生菌产品的需求也不断突显出来。水果和蔬菜分布广泛、且其营养价值丰富，可作为非乳益生菌产品的理想发酵底物，为目前的益生菌乳制产品提供健康的替代品。产品以当地盛产的南瓜为原料，以新型益生菌凝结芽孢杆菌为发酵菌株，提高南瓜附加利用值的同时开发出新型益生菌活菌饮料。
相关指标结果
菌落总数：5×108-1.51×109cfu/g，菌落总数远远高于国家对活菌饮料的菌落总数的要求106cfu/g；
ph：3.95-4.1；
酸度：0.27%-0.45%；
其中，对南瓜浆中β-胡萝卜素和维生素c含量进行检测，检测结果见表2：
由表2可以看出，经过发酵后，不同菌种发酵南瓜后β-胡萝卜素和维生素c含量都有一定程度的损失，但利用本发明制备方法接种凝结芽孢杆菌损失程度远低于由保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌=1:1，因此，利用本发明制备方法制备的凝结芽孢杆菌益生菌常温活菌饮料，营养成分得到较大程度地保留。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的工艺并不局限于此，凡利用此工艺方法对本发明进行非实质性的改动,均应属于侵犯本发明保护范围的行为。