一种凝结芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法与流程

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，属于微生物技术领域。

背景技术：

凝结芽孢杆菌又被称芽孢乳酸菌，属于革兰氏阳性菌，兼性厌氧型，能够产生乳酸，可产生抑菌活性物质，抑制某些腐败和病原微生物生长。由于其对人体无毒无害，且不改变食品本身的特性，可以应用于食品工业领域。可以在动物肠道中对肠道致病菌有较佳的抑制力，可以应用于医疗保健领域。

有关研究表明，凝结孢杆菌可产生抗菌活性物质，但由于该类产物依赖于发酵条件的控制，且发酵产物成分复杂，其含量较低，提高凝结芽孢杆菌抑菌活性物质的产量对于制备抑菌活性物质，促进其广泛应用有极大的必要性。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种凝结芽孢杆菌产抑菌活性物质的培养基，含有淀粉8-12g/L，酵母浸膏18-22g/L，CaCl₂14-16g/L，pH为7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基含有可溶性淀粉10g/L,酵母浸膏20g/L，CaCl₂15g/L。

本发明的第二个目的在于提供一种凝结芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，是将凝结芽孢杆菌接种至所述的培养基中培养20～28h。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是以接种量2～5mL菌液/100mL培养基进行接种。

在本发明的一种实施方式中，所述培养是在37℃，200～220rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是接种凝结芽孢杆菌种子液；所述种子液是以单菌落接种至LB培养基，37℃，200～220r/min培养8～20h获得。

在本发明的一种实施方式中，所述凝结芽孢杆菌为CGMCC 1.949。

本发明的第三个目的是提供所述方法生产的抑菌活性物质。

本发明的第四个目的是提供所述抑菌活性物质在制备食品添加剂、抑菌剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述食品添加剂包括食品防腐剂，保鲜剂。

有益效果：通过培养基及培养条件优化，使得凝结芽孢杆菌1.949菌株产生抑菌多肽含量由原来的1.507mg/mL提高为2.846mg/mL，以金黄色葡萄菌作为指示菌，测定抑菌圈直径，其抑制效果与0.5mg/mL的氨苄青霉素以及0.05mg/mL的硫酸卡那霉素作用效果相当。对其日后用于食品防腐剂及保健品领域打下良好基础。

附图说明

图1为LB培养基中凝结芽孢杆菌抑菌圈大小；

图2为碳源对凝结芽孢杆菌产抑菌物质的影响；

图3为氮源对凝结芽孢杆菌产抑菌物质的影响；

图4为无机盐对菌株产抑菌物质的影响；

图5为不同培养基下凝结芽孢杆菌抑菌效果图(从左到右依次为实施例5-7)

图6为不同蛋白酶对菌株产抑菌物质的活性影响(1，酸性蛋白酶处理，2，中性蛋白酶处理，3，胰蛋白酶处理)。

具体实施方式

培养基：

LB培养基(g/L)：酵母粉5，NaCl 10，蛋白胨10，pH7.0

LB固体培养基(g/L)：酵母粉5，NaCl 10，蛋白胨10，琼脂1.5-2，pH 7.0

种子培养：挑取单菌落接种至LB培养基，37℃200～220r/min培养8～20h。

发酵条件：接种量2～5mL菌液/100mL发酵培养基，培养条件37℃，200～220r/min，发酵24h。

改良牛津杯法：倒5ml琼脂固体培养基(体积比为1.5％-2％琼脂溶于去离子水)于培养皿底部，放置牛津杯，当LB固体培养基温度降低到40℃后，向其添加指示菌(每100mL培养基添加指示菌2mL)，摇匀制备固体培养基，待其凝固后，用无菌镊子取出牛津杯，每孔加入100μL离心后发酵上清液。放入4℃冰箱扩散1h，再放入37℃培养箱生长24h。

抑菌圈测量：外圈抑菌圈直径与内圈牛津杯直径(8cm)差值为最终抑菌圈直径。

还原糖的测定：采用DNS法，首先绘制葡萄糖的标准曲线，将发酵液上清液适当稀释后，取2ml准确加入1.5mlDNS试剂沸水浴5min，放置室温下待其冷却，用超纯水定容至25ml，测定其在520nm处吸光值。根据之前绘制的标准曲线，计算出发酵液的还原糖总量。

蛋白含量的测定：考马斯亮蓝法，首先绘制标准曲线，将发酵液上清液适当稀释，取稀释后的样品1ml加4ml的考马斯亮蓝，室温反应两分钟，在595nm处测定吸光度。根据绘制的标准曲线，计算发酵液中蛋白质含量。

总糖的测定：苯酚硫酸法，首先绘制葡萄糖的标准曲线，吸取适当稀释后的发酵液2mL，加入1mL质量分数为6％的苯酚溶液,再缓慢地添加5mL浓硫酸，摇匀，在室温下充分反应20min，测490nm处测吸光值。根据提前绘制的标准曲线计算发酵液中总糖含量。

多肽含量测定：采用双缩脲法，取上清液1ml并准确添加4ml的双缩脲试剂，混合摇匀后于室温下反应30min，测定其在540nm处吸光值。根据标准曲线计算发酵液中多肽含量。

实施例1

以LB培养基为发酵培养基，采用改良牛津杯法，以金黄色跑葡萄球菌作为指示菌，其产生抑菌圈如图1所示，经测定，抑菌圈直径平均值为18.3mm。对发酵液中多肽含量进行测定，结果显示，抑菌多肽含量为1.507mg/mL。

实施例2

以LB培养基作为初始培养基，分别以2g/100mL的添加量加入甘露醇，葡萄糖，蔗糖，可溶性淀粉，采用改良牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定抑菌圈直径，其中添加可溶性淀粉的培养基发酵后测得抑菌圈最大为13mm，结果如图2。

实施例3

以LB培养基作为初始培养基，分别以1g/100mL的添加量加入蛋白胨，鱼粉蛋白胨，酵母浸膏，尿素；采用改良牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定抑菌圈直径，其中添加酵母浸膏的培养基发酵后测得抑菌圈最大为12mm，结果如图3。

实施例4

以LB培养基作为初始培养基，分别以1g/100mL加入CaCl₂，KCl，NaCl，采用改良牛津杯法，以金黄色跑葡萄球菌作为指示菌，测定抑菌圈直径，其中添加CaCl₂的培养基发酵后测得抑菌圈最大为10mm，结果如图4。

实施例5

以可溶性淀粉10g/L，酵母浸膏15g/L，CaCl₂ 15g/L配制发酵培养基，调节初始pH为7，在37℃，220r/min，发酵24h，采用改良牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定抑菌圈直径22mm(如图5所示)。

实施例6

实施方式同实施例5，其区别在于，改变酵母浸膏添加量为20g/L，测定抑菌圈直径24mm。(如图5所示)

实施例7

实施方式同实施例5，其区别在于，改变可溶性淀粉添加量为5g/L，测定抑菌圈直径20mm。(如图5所示)

实施例8

实施方式同实施例5，其区别在于，改变酵母浸膏添加量为15g/L，测定抑菌圈直径19mm。

实施例9

实施方式同实施例5，其区别在于，改变CaCl₂添加量为5g/L，测定抑菌圈直径13mm。

实施例10

实施方式同实施例5，其区别在于，改变可溶性淀粉添加量为15g/L，测定抑菌圈直径14mm。

实施例11

实施方式同实施例5，其区别在于，调节初始pH为6，采用改良牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，未见透明圈出现。

实施例12

实施方式同实施例11，其区别在于，改变初始培养基pH为8，采用改良牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，未见透明圈出现。

实施例13

以淀粉10g/L，酵母浸膏20g/L，CaCl₂ 15g/L配制发酵培养基，调节初始pH为7，在37℃，220r/min，发酵20h，采用改良牛津杯法，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，测定抑菌圈直径为19mm。

实施例14

实施方式同实施例13，其区别在于，改变发酵时间为22h，测定抑菌圈直径22mm。

实施例15

实施方式同实施例13，其区别在于，改变发酵时间为26h，测定抑菌圈直径24mm。

实施例16

实施方式同实施例13，其区别在于，改变发酵时间为28h，随着发酵时间增加，抑菌物质有部分被分解失活。发酵28h后测定抑菌圈直径为20mm。

实施例17

将实施例6获得的凝结芽孢杆菌株菌发酵液在4℃，12000r/min离心5min，对上清液中还原糖，总糖，蛋白质，多肽含量进行测定。

结果显示，凝结芽孢杆菌产生的活性抑菌物质中，含有总糖6.515mg/mL，还原糖0.908mg/mL，多肽2.846mg/mL，蛋白质0.624mg/mL。

实施例18

检测抑菌活性物质对不同蛋白酶的敏感度，菌株上清液用酸性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶分别在相应的最适条件下作用，然后进行作用前后的抑菌活性分析比对，先把三种蛋白酶用pH6.5，3mmol/L的磷酸盐缓冲液配成质量浓度为1mg/mL母液，分别加入发酵上清液中，调节pH值至三种酶的最适pH值，以不加酶的发酵上清液作为空白对照，37℃水浴保温2h，冷却后用1mol/L的HCl溶液或1mol/L的NaOH溶液调整各酶解液pH值至6.5，然后以金黄色葡萄球菌为指示菌进行改良牛津杯实验测定抑菌圈直径大小。如图6所示，发现抑菌物质经酸性蛋白酶处理上清液中抑菌物质仍保留活性，而中性蛋白酶，胰蛋白酶处理后活性消失。初步判断抑菌物质活性主要与里面的蛋白质和多肽有关。

采用氨苄青霉素和硫酸卡那霉素进行对照实验，选取浓度为50mg/mL的两种抗生素作为母液，分别稀释原来的10，10^-2，10^-3,10^-4,10^-5,10^-6倍，以金黄色葡萄球菌作为指示菌进行抑菌实验，与实施例7获得的发酵上清液抑菌圈大小比较，经过抑菌圈测定发现含有2.846mg/mL抑菌多肽的发酵液(对应24mm抑菌圈)的抑菌圈效果与同等抑菌圈大小的0.5mg/mL的氨苄青霉素以及0.05mg/mL的硫酸卡那霉素作用效果相当。

实施例19

选取革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌；选取革兰氏阴性菌大肠杆菌，铜绿假单胞菌；选取一种真菌类酿酒酵母使其菌浓都控制在9lg(CFU/mL)进行凝结芽孢杆菌抑菌物质的抑菌谱实验。发现该株凝结芽孢杆菌抑菌产物对革兰氏阳性菌有较好的抑菌效果(见表1)，对酿酒酵母无明显抑菌作用。

表1凝结芽孢杆菌1.949对不同微生物的抑菌效果