专利名称：亚细胞器靶向壳寡糖－脂肪酸嫁接物及制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属化合物的合成方法，涉及壳寡糖-脂肪酸嫁接物的制备，以及多疏水性内核壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团的制备和该嫁接物胶团作为纳米级胶团微粒载体在生命科学领域中的应用。
背景技术：
近年来，聚合物胶团在药物制剂学、生物医学及高分子领域已经引起了人们广泛的重视。聚合物胶团是由两亲性的嵌段或接枝共聚物在水性介质中自聚形成，具有核-壳结构。其疏水性链段构成胶团的内核，亲水性链段形成胶团的外壳。疏水核可为难溶性药物提供储库的作用；亲水性外膜保持胶团在水性环境中的稳定性，并可进行理化性质修饰以达到特定的目的，如胶团的主动靶向等。
聚合物胶团作为一种药物传输系统，有许多优势通过调整材料的溶解性、pH值、Zeta电位等可以控制药物在生物体内的释放；由于胶团粒径很小，故可穿过血脑屏障，也可促进肠胃黏膜等的良好吸收，到达大尺寸粒子无法通过的部位，达到被动靶向的目的；聚合物胶团骨架对药物的保护和屏蔽作用，可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒性；与脂质体相比，聚合物胶团的载药量较高；聚合物材料的多样性，使得以聚合物为载体的药物制剂亦多样化，能满足各种使用需求。
聚合物胶团主要用作难溶性药物，特别是抗肿瘤药物的载体。由于聚合物胶团的粒径一般小于100nm，可通过“增强的透过及滞留效应”(enhancedpermeability and retention effect)聚集于肿瘤部位。
壳聚糖是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性。壳聚糖被广泛应用于药物辅料、止血材料、组织工程支架等。虽然以壳聚糖为基本材料所制备的微粒、纳米粒、以及一些疏水改性壳聚糖的聚合物胶团，已广泛应用于药物载体材料的研究，但由于载体表面壳聚糖本身的亲水性结构，所以现有以壳聚糖为基本组成的载体难以被细胞所摄取，从而最终影响药物的靶向治疗效果。同时，由于壳聚糖的高分子量，高粘性以及在生理pH条件下不溶等缺点，增加了壳聚糖微粒和纳米粒的制备难度，以及限制了疏水改性壳聚糖胶团的应用。
发明内容
本发明的一个目的，是提供壳寡糖-脂肪酸嫁接物，其具有代表性的结构通式为 其中R为烷基链，其碳链数目为12～22；n，x，y为聚合度；壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70-100％；壳寡糖链上的部分自由氨基被烷基取代，氨基取代度为1～90％。
本发明的第二个目的，是提供壳寡糖-脂肪酸嫁接物的合成方法，通过以下方案实现(1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)的制备取市售壳聚糖(70～100％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，按照使用要求，分别从分子量3kDa、10kDa、30kDa，50kDa的超滤膜中，选择合适的超滤膜超滤分级，超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为70-100％、不同分子量的低分子量壳聚糖(优选壳寡糖分子量为1～100kDa)。以凝胶渗透色谱法测定壳寡糖的分子量。
(2)壳寡糖-脂肪酸嫁接物制备本发明以碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为耦合剂，通过壳寡糖上的氨基和脂肪酸的羧基之间的化学反应，制备壳寡糖-脂肪酸嫁接物。具体合成方法为取0.001M壳寡糖水溶液100ml，加入N-羟基琥珀酰亚胺(壳寡糖与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶10～1∶1000)溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另秤取一定量的脂肪酸(壳寡糖与脂肪酸的摩尔比为1∶2～1∶200)，在40℃的条件下溶于20ml的无水乙醇后，加入一定量的碳二亚胺(脂肪酸与碳二亚胺的摩尔比为1∶5)，在50℃磁力搅拌的条件下反应1小时。在上述两反应液(壳寡糖与N-羟基琥珀酰亚胺反应液与脂肪酸与碳二亚胺的反应液)各反应1小时后，将上述两反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。终反应液经透析后，冷冻干燥，干燥产物经40℃的无水乙醇洗涤后，得到壳寡糖-脂肪酸嫁接物。脂肪酸选自癸酸、豆蔻酸、软脂酸、油酸、硬脂酸、山嵛酸等中任一种。
本发明所制备得到的壳寡糖-脂肪酸嫁接物，具有在水性介质中通过自聚集形成胶团的特性，1mg/ml的壳寡糖-脂肪酸嫁接物水溶液，可形成粒径为5～1000nm、zeta电位为5～80mV的胶团。壳寡糖-脂肪酸嫁接物的临界胶团浓度位于0.01～0.1mg/ml之间，明显低于一般表面活性剂的临界胶团浓度。当胶团遇到体液被稀释时，可以继续保持胶团的结构，表明壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团适宜作为药物的载体使用。
本发明的第三个目的是提供壳寡糖-脂肪酸嫁接物在制备具有快速细胞摄取和亚细胞器靶向的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团中的应用。
本发明的第四个目的是提供壳寡糖-脂肪酸嫁接物在制备具有细胞浆滞留和细胞核转运功能药物中的应用。
本发明的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团，具有多个疏水核的特殊空间结构，能被细胞快速摄取。根据壳寡糖-脂肪酸嫁接物的组成和疏水核数目的不同，可分别体现出细胞浆滞留和细胞核转运的功能。
本发明的有益之处是本发明在前期的研究工作基础上，利用壳聚糖的降解产物、低分子量壳聚糖(壳寡糖)，进行烷基化修饰，通过对烷基化修饰壳寡糖(壳寡糖-脂肪酸嫁接物)合成方法的改进，合成了一类具有特殊结构的壳寡糖-脂肪酸嫁接物。由提供的壳寡糖-脂肪酸嫁接物所形成的嫁接物胶团，为一种具有优良亚细胞器靶向的微粒载体，可应用于生命科学领域与制药领域。利用这种载体，可应用于载体本身在细胞内各个细胞器的靶向分布研究；探索大分子物质进入细胞的途径和机制；为开拓亚细胞器靶向药物治疗，提供理论与技术基础。
图110.2％氨基取代度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团，与A549细胞共孵育2小时后的荧光显微镜照片。
图248.6％氨基取代度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团，与A549细胞共孵育2小时后的荧光显微镜照片。
具体实施例方式
本发明结合实施例和附图作进一步的说明。
实例一1、低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备取市售分子量为550kDa的壳聚糖(70％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，使用分子量为10kDa和30kDa的超滤膜进行超滤分级。取分子量介于10kDa和30kDa的超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为70％、分子量22.4 kDa的壳寡糖。
2、壳寡糖-脂肪酸嫁接物制备及理化性质测定取上述0.0001mol壳寡糖，溶于100ml蒸馏水中，制备壳寡糖的水溶液，加入0.01mol N-羟基琥珀酰亚胺溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另分别称取0.002mol的脂肪酸(癸酸、硬脂酸和山嵛酸)，在40℃的条件下，溶于20ml的无水乙醇，加入0.01mol的碳二亚胺，在50℃磁力搅拌的条件下反应1小时。在上述两反应液各反应1小时后，分别将壳寡糖的反应液与脂肪酸的反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。终反应液经透析后，冷冻干燥，干燥产物经40℃的无水乙醇洗涤后，分别得到壳寡糖-癸酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物和壳寡糖-山嵛酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法，测定所得壳寡糖-脂肪酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述壳寡糖-脂肪酸嫁接物4mg溶于2ml蒸馏水，同法操作，测定344nm波长处的吸收值，按标准曲线计算壳寡糖-脂肪酸嫁接物的氨基取代度。
采用芘荧光法测定，壳寡糖-脂肪酸嫁接物的临界胶团浓度。取壳寡糖-脂肪酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/ml的壳寡糖-脂肪酸嫁接物溶液稀释成不同浓度的壳寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10-7mol/L)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。
采用荧光萃灭法，测定壳寡糖-脂肪酸嫁接物的疏水核数目。以氯化十六烷基呲啶(1-Dodecylpyridinium chloride，DPC)为芘的荧光萃灭剂，在包封芘的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团溶液中，加入定量的DPC溶液，荧光分光光度法测定DPC加入前后的荧光强度，以荧光萃灭动力学方程(式(1))，计算疏水核区所需疏水性材料(脂肪酸)的浓度ln(I0/I)＝[Q]/[M](1)I0和I分别为荧光萃灭剂加入前后的荧光发射强度；[Q]为荧光萃灭剂的浓度；[M]为形成单个疏水核区所需脂肪酸的浓度。
单个壳寡糖-硬脂酸嫁接物分子的疏水核区数量n照下式计算n＝[脂肪酸]/[M](2)另取壳寡糖-脂肪酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制备1mg/ml的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团溶液。Zetasizer 3000HS分析仪测定壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团的粒径及Zeta电位。
经测定，壳寡糖-癸酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物和壳寡糖-山嵛酸嫁接物的理化性质见表1。
表1壳寡糖-癸酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物和壳寡糖-山嵛酸嫁接物的理化性质
实例二1、低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(90％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，使用分子量为3kDa、10kDa、30kDa，50kDa的超滤膜进行超滤分级。分级后的超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为90％、分子量分别为1.0kDa，22.2 kDa，33.4kDa，54.6kda和101.2kDa的壳寡糖。
2、壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备及理化性质测定分别取上述0.0001mol壳寡糖溶于100ml蒸馏水中，制备壳寡糖水溶液，加入0.01mol N-羟基琥珀酰亚胺溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另秤取0.002mol的硬脂酸，在40℃的条件下溶于20ml的无水乙醇后，加入0.01mol的碳二亚胺，在50℃磁力搅拌的条件下反应1小时。在上述两反应液各反应1小时后，分别将壳寡糖的反应液与脂肪酸的反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。终反应液经透析后，冷冻干燥，干燥产物经40℃的无水乙醇洗涤后，分别得到不同分子量壳寡糖的壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法，测定所得壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量的壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2ml蒸馏水，同法操作，测定344nm波长处的吸收值，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。
采用芘荧光法，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物的临界胶团浓度。取壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/ml的壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶液，稀释成不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10-7mol/L)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。
采用荧光萃灭法，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物的疏水核数目。以氯化十六烷基呲啶(1-Dodecylpyridinium chloride，DPC)为芘的荧光萃灭剂，在包封芘的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液中，加入定量的DPC溶液，荧光分光光度法测定DPC加入前后的荧光强度，运用荧光萃灭动力学方程(式(1))，计算疏水核区所需疏水性材料(硬脂酸)的浓度。单个壳寡糖-硬脂酸嫁接物分子的疏水核区数量n照(2)式计算。
另取壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制备1mg/ml的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液。Zetasizer 3000HS分析仪，分别测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径及Zeta电位。
经测定，不同壳寡糖分子量的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性质见表2。
表2不同壳寡糖分子量的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性质
实例三1、低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备取市售分子量为750kDa的壳聚糖(100％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，使用分子量为10kDa和30kDa的超滤膜进行超滤分级。分级后的超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为100％、分子量为25.8kDa的壳寡糖。
2、壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备及理化性质测定取上述0.0001mol壳寡糖，溶于100ml蒸馏水中，制备壳寡糖的水溶液，加入0.01mol N-羟基琥珀酰亚胺，溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另称取0.002mol的硬脂酸，在40℃的条件下溶于20ml的无水乙醇后，加入0.01mol的碳二亚胺，在50℃磁力搅拌的条件下反应1小时。在上述两反应液各反应1小时后，分别将壳寡糖的反应液与脂肪酸的反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。终反应液经透析后，冷冻干燥，干燥产物经40℃的无水乙醇洗涤后，得到脱乙酰度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法，测定所得壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，测定344nm波长处的吸收值，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。
采用芘荧光法，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物的临界胶团浓度。取壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/ml的壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶液，稀释成不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10-7mol/L)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。
采用荧光萃灭法，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物的疏水核数目。以氯化十六烷基呲啶(1-Dodecylpyridinium chloride，DPC)为芘的荧光萃灭剂，在负载芘的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液中，加入定量的DPC溶液，荧光分光光度法测定DPC加入前后的荧光强度，运用荧光萃灭动力学方程(式(1))，计算疏水核区所需疏水性材料(硬脂酸)的浓度。单个壳寡糖-硬脂酸嫁接物分子的疏水核区数量n照(2)式计算。
另取壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制备1mg/ml的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液。Zetasizer 3000HS分析仪，分别测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径及Zeta电位。
经测定，脱乙酰度为100％的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性质见表3。
表3脱乙酰度为100％的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性质
实例四1、低分子量壳聚糖(壳寡糖)制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(90％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，使用分子量为10kDa和30kDa的超滤膜进行超滤分级。取分子量介于10kDa和30kDa的超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为90％、分子量19.2kDa的壳寡糖。
2、壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备及理化性质测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备投料比见表4。
表4壳寡糖-硬脂酸嫁接物制备投料比
取上述定量壳寡糖，溶于100ml蒸馏水中，制备壳寡糖的水溶液，加入定量的N-羟基琥珀酰亚胺，溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另称取定量的硬脂酸，在40℃的条件下分别溶于20ml的无水乙醇后，分别加入定量的碳二亚胺，在50℃磁力搅拌的条件下反应1小时。在上述两反应液各反应1小时后，分别将壳寡糖的反应液与脂肪酸的反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时。终反应液经透析后，冷冻干燥，干燥产物经40℃的无水乙醇洗涤后，分别得到不同氨基取代度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法，测定所得壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同量壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，测定344nm波长处的吸收值，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度。
采用芘荧光法，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物的临界胶团浓度。取壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml。将1mg/ml的壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶液，稀释成不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘的终浓度为7×10-7mol/L)，水浴超声(400w，30min)。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定荧光强度，并计算临界胶团浓度。
采用荧光萃灭法，测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物的疏水核数目。以氯化十六烷基呲啶(1-Dodecylpyridinium chloride，DPC)为芘的荧光萃灭剂，在包封芘的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液中，加入定量的DPC溶液，荧光分光光度法测定DPC加入前后的荧光强度，运用荧光萃灭动力学方程(式(1))，计算疏水核区所需疏水性材料(硬脂酸)的浓度。单个壳寡糖-硬脂酸嫁接物分子的疏水核区数量n照(2)式计算。
另取壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制备1mg/ml的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液。Zetasizer 3000HS分析仪，分别测定壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的粒径及Zeta电位。
经测定，不同硬脂酸投料比的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性质见表5。
表5不同硬脂酸投料比的壳寡糖-硬脂酸嫁接物的理化性质
3、壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团细胞摄取取0.1g异硫氰基荧光素和0.5g壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定后分别溶解于60％乙醇溶液中。在冰浴、避光与磁力搅拌(400rpm)条件下，将壳寡糖-硬脂酸嫁接物乙醇溶液，滴加到异硫氰基荧光素溶液中，相同条件下继续反应10h。终反应液置透析袋，重蒸水透析24h，除去未反应异硫氰基荧光素。透析液冷冻干燥，得异硫氰基荧光素标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
取异硫氰基荧光素标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物10mg，精密称定。加适量重蒸水，水浴超声10min分散，定容至1000ml，得异硫氰基荧光素标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液。
以人II型肺上皮细胞A549细胞为模型细胞，在37℃，5％CO2条件下培养细胞至呈对数生长期后，离心收集，按每孔1×105个细胞的密度接种24孔培养板，孵箱内预培养24小时。在培养液中加入异硫氰基荧光素标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液孵育。胶团浓度控制为100μg/ml。培养一定时间后，用荧光倒置显微镜观察。荧光显微镜观察结果显示，壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团能快速被细胞所摄取，并根据嫁接物的氨基取代度的不同，分别体现出细胞浆滞留和细胞核转运的功能。图1和图2分别为氨基取代度为10.2％和48.6％的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团，与A549细胞共孵育2小时后的荧光显微镜照片。参见图1和图2，氨基取代度分别为10.2％和48.6％的壳寡糖-硬脂酸嫁接物与A549细胞共孵育2小时后，分别体现出细胞浆滞留和细胞核转运的功能。图1为10.2％氨基取代度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团，与A549细胞共孵育2小时后的荧光显微镜照片，其中A图为异硫氰基荧光素标记聚合物胶团荧光照片，B图为核染对照照片。图2为48.6％氨基取代度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团，与A549细胞共孵育2小时后的荧光显微镜照片，其中A图为异硫氰基荧光素标记聚合物胶团荧光照片，B图为核染对照照片。
权利要求
1.一种壳寡糖-脂肪酸嫁接物，其具有代表性的结构通式为 其中R为烷基链，其碳链数目为12～22，n，x，y为聚合度，壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70-100％，壳寡糖链上的部分自由氨基被烷基取代，氨基取代度为1～90％。
2.根据权利要求1所述的壳寡糖-脂肪酸嫁接物的合成方法，其特征是通过以下步骤实现(1)低分子量壳寡糖的制备取市售高分子量的壳聚糖，70～100％脱乙酰度，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，纤维素酶与壳聚糖比例按重量百分比0.5∶100加入纤维素酶，降解壳聚糖，以粘度法控制壳聚糖的降解程度，所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，按照使用要求，分别从分子量3kDa、10kDa、30kDa，50kDa的超滤膜中，选择合适的超滤膜超滤分级，超滤液冷冻干燥，选用壳寡糖分子量为1～100kDa、脱乙酰度为70-100％的低分子量壳聚糖，以凝胶渗透色谱法测定壳寡糖的分子量；(2)壳寡糖-脂肪酸嫁接物的制备取上述0.001 M壳寡糖水溶液100ml，加入N-羟基琥珀酰亚胺，壳寡糖与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶10～1∶1000，溶解后，在室温和磁力搅拌的条件下反应1小时；另称取脂肪酸，壳寡糖与脂肪酸的摩尔比为1∶2～1∶200，在40℃的条件下溶于20ml的无水乙醇后，加入碳二亚胺，脂肪酸与碳二亚胺的摩尔比为1∶5，在50℃磁力搅拌的条件下反应1小时；在上述两反应液各反应1小时后，将上述两反应液混合，继续在室温、磁力搅拌的条件下反应48小时，经透析后，冷冻干燥，干燥产物经40℃的无水乙醇洗涤后，得到壳寡糖-脂肪酸嫁接物。
3.根据权利要求2所述的壳寡糖-脂肪酸嫁接物的合成方法，其特征是1mg/ml的壳寡糖-脂肪酸嫁接物水溶液形成粒径为5～1000nm、zeta电位为5～80mV的胶团，壳寡糖-脂肪酸嫁接物的临界胶团浓度位于0.01～0.1mg/ml之间。
4.根据权利要求2所述的壳寡糖-脂肪酸嫁接物的合成方法，其特征是所形成的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团具有多个疏水核的特殊空间结构。
5.根据权利要求1所述的壳寡糖-脂肪酸嫁接物在制备具有快速细胞摄取和亚细胞器靶向的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团中的应用。
6.根据权利要求1所述的壳寡糖-脂肪酸嫁接物在制备具有细胞浆滞留和细胞核转运功能药物中的应用。
全文摘要
本发明提供壳寡糖－脂肪酸嫁接物，其具有代表性的结构通式为右式，其中R为烷基链，碳链数为12～22；n，x，y为聚合度；壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70－100％；壳寡糖链上的部分自由氨基被烷基取代，取代度为1～90％。通过利用壳聚糖的降解产物、低分子量壳聚糖(壳寡糖)，进行烷基化修饰，通过对烷基化修饰壳寡糖合成方法的改进，合成了具有特殊结构的壳寡糖－脂肪酸嫁接物。该嫁接物所形成的嫁接物胶团，是一种具有优良亚细胞器靶向的微粒载体，可应用于载体本身在细胞内各个细胞器的靶向分布研究；探索大分子物质进入细胞的途径和机制；为开拓亚细胞器靶向药物的制备，提供理论与技术基础。
文档编号C12P19/00GK101081876SQ20071006911
公开日2007年12月5日 申请日期2007年5月29日 优先权日2007年5月29日
发明者胡富强, 杜永忠, 袁弘, 游剑 申请人:浙江大学