一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法。

背景技术：

脂蛋白残粒(remnantlipoprotein，rlp)又称富含甘油三酯(triglyceride，tg)，脂蛋白残粒(trl)是乳糜微粒(chylomicron，cm)和极低密度脂蛋白(verylowdensitylipoprotein，vldl)经脂蛋白酯酶(lipoproteinlipase，lpl)水解逐渐失去甘油三酯、磷脂、脂蛋白a，apoa)和apoc后，转变成的富含胆固醇、胆固醇脂和apoe的较小颗粒。

近年来，随着对脂蛋白残粒的深入了解，rlp测定的临床意义日趋受重视。大量研究表明，浓度在动脉粥样硬化性疾病及动脉粥样相关的疾病(如ⅱ型糖尿病、ⅲ型高脂血症和慢性肾功能衰竭及肥胖患者)中显著增加。另外，从人动脉粥样斑块中分离的脂蛋白在结构上与富含tg脂蛋白残粒相似。因此，血清或血浆脂蛋白残粒胆固醇(rlp-c)水平升高是动脉粥样硬化性疾病和冠心病(coronaryheart、disease，chd)以及与动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病的重要危险因素。所以，准确、快速测定rlp非常重要。常规方法中采用胶乳微球直接偶联rlp-c抗体，我公司采用该方法发现灵敏度和线性范围均较差。因此，应该提供一种新的技术方案解决上述问题。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种灵敏度高，重复性好的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1的各组分及浓度包括：

所述试剂r2包括第二缓冲液、保存液、偶联有rlp-c单克隆抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球，所述第二缓冲液的浓度为8.05-27.30g/l，所述保存液的各组分及浓度包括：

n,n-二羟乙基甘氨酸1.26-9.83g/l

稳定剂0.5-2.0g/l

第二防腐剂0.8-2.0ml/l

胶乳微球偶联物的各组份及浓度包括：

胶乳微球0.01-3.0％

生物素5-20g/l

链霉亲和素5-20g/l

脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体0.05-3.0g/l

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.005-0.3g/l。

进一步的技术方案：

所述试剂r1中的第一缓冲液a、第一缓冲液b以及试剂r2中的第二缓冲液均为pbs缓冲液、hepes缓冲液、mes缓冲液、tris缓冲液、甘氨酸缓液中的一种或几种的组合。

优选的，所述第一缓冲液a为二水合磷酸二氢钠、第一缓冲液b为十二水合磷酸氢二钠，第二缓冲液为2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物。

所述试剂r1和r2中的防腐剂为叠氮钠、proclin-950、proclin-300、硫柳汞中的一种或几种的组合。

所述试剂r2中稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、甘露醇中的一种或几种的组合。

优选的，所述试剂r2中稳定剂为牛血清白蛋白。

胶乳微球所选粒径为90-280nm，其表面修饰基团为羧基或氨基中的一种。

所述试剂r1ph在6.80-8.00之间，试剂r2ph在6.30-8.50之间。

生物素结合rlp-c单克隆抗体比例为1:1-3:1之间，链霉亲和素结合生物素-rlp-c单克隆抗体比例为0.5:1-4:1之间。

测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，

a)、试剂r1制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，以0.8-3.2g/l标准，边搅拌边投入第一缓冲液a，以8.75-24.31g/l的标准投入第一缓冲液b，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节ph值到6.80-8.00之间，之后以5.8-20.0g/l标准，投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以40-120g/l、0.8％-2.0％的标准，依次投入peg6000、第一防腐剂,投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；

b)、试剂r2制备；

b1、缓冲液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以8.05-27.30g/l的标准，边搅拌边投入第二缓冲液，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节ph值到6.30-8.50之间，继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；

b2、保存液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以1.26-9.83g/l的标准边搅拌边投入n,n-二羟乙基甘氨酸，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，调节ph值到6.30-8.50之间，之后以0.5-2.0g/l标准，投入稳定剂，待物料完全溶解后，再以0.8-2.0ml/l标准，投入第二防腐剂，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；

b3、胶乳微球抗体偶联物的制备，胶乳微球所选粒径为90-280nm，其表面修饰基团为羧基或氨基中的一种将胶乳微球以缓冲液稀释到0.01-3.0％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，将脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以反应液稀释到0.05-3.0g/l的浓度,与生物素按3:1-1:1的比例结合后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，链霉亲和素结合生物素-rlp-c单克隆抗体比例为0.5:1-4:1之间，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.005-0.3g/l的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应100-140分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应80-100分钟，将混合液以14000rpm的转速离心15-45分钟，吸去上清液，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入保存液，超声重悬，将制备好的r2装入成品罐中，进行标识。

由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒,采用胶乳微球连接链霉亲和素1:1，rlp-c单克隆抗体连接生物素1:2，二者再以1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到0.1-8mg/l。

附图说明

图1是本发明实施例4中r2试剂未采用级联放大偶联的定标曲线图。其中x轴表示标准品浓度，y轴表示吸光度。

图2是本发明实施例4中r2试剂采用级联放大偶联的定标曲线图。其中x轴表示标准品浓度，y轴表示吸光度。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：

实施例1:

一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液a的二水合磷酸二氢钠，其浓度为0.8g/l，作为第一缓冲液b的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为24.31g/l，作为第一电解质的氯化钠，其浓度为5.8g/l,作为第一高分子促进剂的peg6000，其浓度为40g/l，以及作为第一防腐剂的proclin-950，其浓度为2.0％。

所述试剂r2包括第二缓冲液、保存液、偶联有rlp-c单克隆抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球，所述第二缓冲液为2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，其浓度为8.05g/l；所述保存液包括：浓度为9.83g/l的n,n-二羟乙基甘氨酸、作为稳定剂的牛血清白蛋白，其浓度为0.5g/l的，作为第二防腐剂的proclin-950，其浓度为0.8ml/l；胶乳微球偶联物的各组份及浓度包括：浓度为3.0％的胶乳微球，浓度为5g/l的生物素，浓度为5g/l的链霉亲和素，浓度为0.05g/l的脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以及浓度为0.005g/l的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

以上测定测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，

a)、试剂r1制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为0.8g/l二水合磷酸二氢钠和浓度为24.31g/l的十二水合磷酸氢二钠，搅拌30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节ph值为6.8，之后投入浓度为5.8g/l的氯化钠，待物料完全溶解后，再按照上述投料方式依次投入peg6000和proclin-950，以上两者的浓度分别为40g/l和2.0％，投料完成后，继续搅拌5分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；

b)、试剂r2制备；

b1、缓冲液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以8.05g/l的标准，边搅拌边投入2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌5分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节ph值为6.30，继续搅拌5分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；

b2、保存液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以9.83g/l的标准边搅拌边投入n,n-二羟乙基甘氨酸，搅拌5分钟至物料完全溶解，调节ph值为6.30，之后以0.5g/l标准，投入牛血清白蛋白，待物料完全溶解后，再以0.8ml/l标准，投入proclin-950，继续搅拌30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；

b3、胶乳微球抗体偶联物的制备，胶乳微球所选粒径为90nm，其表面修饰基团为羧基，将胶乳微球以缓冲液稀释到3.0％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，将脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以反应液稀释到0.05g/l的浓度,与生物素按2:1的比例结合后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，链霉亲和素结合生物素-rlp-c单克隆抗体比例为1:1，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.005g/l的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应100分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应80分钟，将混合液以14000rpm的转速离心15分钟，吸去上清液，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入保存液，超声重悬，将制备好的r2装入成品罐中，进行标识。

实施例2

一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1的各组分及浓度包括作为第一缓冲液a的二水合磷酸二氢钠，其浓度为3.2g/l，作为第一缓冲液b的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为8.75g/l，作为第一电解质的氯化钠，其浓度为20.0g/l,作为第一高分子促进剂的peg6000，其浓度为80g/l，作为第一防腐剂的proclin-300，其浓度为0.8％，所述试剂r2包括第二缓冲液、保存液、偶联有rlp-c单克隆抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球，所述第二缓冲液为2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，其浓度为27.30g/l；所述保存液包括：浓度为5.0g/l的n,n-二羟乙基甘氨酸、作为稳定剂的酪蛋白，其浓度为2.0g/l的，作为第二防腐剂的proclin-300，其浓度为2.0ml/l；胶乳微球偶联物的各组份及浓度包括：浓度为0.01％的胶乳微球，浓度为20g/l的生物素，浓度为20g/l的链霉亲和素，浓度为3.0g/l的脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以及浓度为0.3g/l的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

以上测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，

a)、试剂r1制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为3.2g/l二水合磷酸二氢钠和浓度为8.75g/l的十二水合磷酸氢二钠，搅拌5分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节ph值为7.3，之后投入浓度为20g/l的氯化钠，待物料完全溶解后，再按照上述投料方式依次投入peg6000和proclin-300，以上两者的浓度分别为80g/l和0.8％，投料完成后，继续搅拌30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；

b)、试剂r2制备；

b1、缓冲液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以27.3g/l的标准，边搅拌边投入2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节ph值到7，继续搅拌18分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；

b2、保存液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以5.0g/l的标准边搅拌边投入n,n-二羟乙基甘氨酸，搅拌18分钟至物料完全溶解，调节ph值为7，之后以2.0g/l标准，投入酪蛋白，待物料完全溶解后，再以2.0ml/l标准，投入proclin-300，继续搅拌18分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；

b3、胶乳微球抗体偶联物的制备，胶乳微球所选粒径为190nm，其表面修饰基团为氨基，将胶乳微球以缓冲液稀释到0.01％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，将脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以反应液稀释到3.0g/l的浓度,与生物素按3:1的比例结合后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，链霉亲和素结合生物素-rlp-c单克隆抗体比例为4:1，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.3g/l的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应120分钟，加入酪蛋白封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14000rpm的转速离心30分钟，吸去上清液，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入保存液，超声重悬，将制备好的r2装入成品罐中，进行标识。

实施例3

一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1的各组分及浓度包括作为第一缓冲液a的二水合磷酸二氢钠，其浓度为2g/l，作为第一缓冲液b的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为16g/l，作为第一电解质的氯化钠，其浓度为12g/l,作为第一高分子促进剂的peg6000，其浓度为120g/l，作为第一防腐剂的硫柳汞，其浓度为1.0％，所述试剂r2包括第二缓冲液、保存液、偶联有rlp-c单克隆抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球，所述第二缓冲液为2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，其浓度为16.80g/l；所述保存液包括：浓度为1.26g/l的n,n-二羟乙基甘氨酸、作为稳定剂的甘露醇，其浓度为1.2g/l的，作为第二防腐剂的叠氮钠，其浓度为1.5ml/l；胶乳微球偶联物的各组份及浓度包括：浓度为1.5％的胶乳微球，浓度为13g/l的生物素，浓度为13g/l的链霉亲和素，浓度为1.5g/l的脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以及浓度为0.15g/l的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

以上测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，

a)、试剂r1制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为2g/l二水合磷酸二氢钠和浓度为16g/l的十二水合磷酸氢二钠，搅拌18分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节ph值为8.0，之后投入浓度为12g/l的氯化钠，待物料完全溶解后，再按照上述投料方式依次投入peg6000和硫柳汞，以上两者的浓度分别为120g/l和1.0％，投料完成后，继续搅拌18分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；

b)、试剂r2制备；

b1、缓冲液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以16.8g/l的标准，边搅拌边投入2-(n-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌18分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节ph值到7，继续搅拌30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；

b2、保存液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以1.26g/l的标准边搅拌边投入n,n-二羟乙基甘氨酸，搅拌30分钟至物料完全溶解，调节ph值为8.5，之后以1.2g/l标准，投入甘露醇，待物料完全溶解后，再以1.5ml/l标准，投入叠氮钠，继续搅拌5分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积；

溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；

b3、胶乳微球抗体偶联物的制备，胶乳微球所选粒径为280nm，其表面修饰基团为羧基将胶乳微球以缓冲液稀释到1.5％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，将脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以反应液稀释到3g/l的浓度,与生物素按1:1的比例结合后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，链霉亲和素结合生物素-rlp-c单克隆抗体比例为0.5:1，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.15g/l的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应140分钟，加入甘露醇封闭，振荡混匀，室温反应100分钟，将混合液以14000rpm的转速离心40分钟，吸去上清液，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入保存液，超声重悬，将制备好的r2装入成品罐中，进行标识。

实施例4

本发明一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的应用，其工作原理是:一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈，形成级联放大反应。检测样本中脂蛋白残粒胆固醇(rlp-c)与其相应的链霉亲和素-生物素-rlp-c抗体在溶液中相遇，采用级联放大反应，形成抗原-抗体复合物，使乳胶颗粒发生凝集，产生浊度变化。该浊度变化的高低在足量抗体存在时与样本中rlp-c的含量成正比，在340nm波长下，通过与已知浓度的校准品比较，可定量检测出样品中rlp-c的含量。

具体测定结果比较如下：

r2试剂采用胶乳微球直接偶联rlp-c单克隆抗体试剂盒，使用标准品进行定标，结果如表1所示，定标曲线如图1所示。

表1、r2试剂未采用级联放大偶联，胶乳微球直接偶联rlp-c单克隆抗体定标结果：

结果解析：如图1和表1所示，线性范围可做到0.1-8mg/l，浓度大于4mg/l时出现hook效应。

r2试剂采用胶乳微球间接偶联rlp-c单克隆抗体试剂盒，使用标准品进行定标，结果如表2所示，定标曲线如图2所示。

表2、r2试剂采用级联放大偶联，胶乳微球间接偶联rlp-c单克隆抗体定标结果：

结果解析：如图2和表2所示，线性范围可做到0.1-8mg/l。

实施例5

精密度cv检测:

r2试剂采用胶乳微球直接偶联rlp-c单克隆抗体试剂盒，随机取3份份临床血清样本，使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次，检测结果如表3所示。

表3：检测样本的脂蛋白残粒胆固醇含量(10次)及变异系数

结果解析：精密度cv较大，基本＞5％。

r2试剂采用胶乳微球间接偶联rlp-c单克隆抗体的试剂盒，随机取3份临床血清样本，使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次，检测结果如表4所示。

表4：检测样本的脂蛋白残粒胆固醇含量(10次)及变异系数

结果解析：精密度cv明显改善，4％以内。

结论:采用胶乳微球间接偶联rlp-c单克隆抗体的试剂盒，即胶乳微球连接链霉亲和素1:1，rlp-c单克隆抗体连接生物素1:2，二者再以1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到0.1-8mg/l。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进或替换，这些改进或替换也应视为本发明的保护范围。