甲胎蛋白双极电极纸芯片电致化学发光传感器的构建的制作方法

本发明涉及生物传感器技术领域，更具体地说是甲胎蛋白双极电极纸芯片电致化学发光传感器的构建方法。

背景技术：

甲胎蛋白是原发性肝癌确诊最重要的生物标志物，血清中甲胎蛋白含量的检测对肝癌临床诊断以及早期筛查具有重要意义。原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均局全球首位，我国每年新发的病例占全球每年新发的原发性肝癌病例的一半以上，且发病率呈逐年上升趋势。在我国仅次于肺癌，排行恶性肿瘤死亡率的第2位。目前，血清中甲胎蛋白含量的确定，临床检测主要采用免疫测定法，常规免疫测定包括酶联免疫吸附测定、放射免疫测定以及荧光免疫测定。但是，这些方法固有其自身缺陷，如会存在部分标记抗体的损失，会造成辐射危害以及环境污染等；荧光免疫测定中所需的标记物价格昂贵且容易受到外界干扰。此外，以上分析方法所需分析时间长，且需具备熟练的操作人员。因此，亟需开发一种简单、快速、灵敏和高选择性的检测方法，电致化学发光法是一种将电化学方法和发光方法相结合的方法，具有两种方法的优点。同时将双极电极引入电致化学发光方法中，可以有效地将检测目标物和信号分子隔离，在无干扰的条件下通过信号端光信号的测定实现对检测端目标物的间接检测。双极电极是在电场的作用下而在其两端产生一定电压差的一段导体，在纸基底上采用丝网印刷、蜡打印技术制备双极电极纸芯片，构建一种选择性好、结构简单、操作方便、成本低廉的甲胎蛋白双极电极纸芯片电致化学发光感器，具有重要的意义和广阔的市场价值。

技术实现要素：

本发明的目的是构建甲胎蛋白双极电极纸芯片电致化学发光传感器用于高选择、高灵敏、操作简便、低成本地检测甲胎蛋白。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：

(1)在计算机上利用adobeillustrator软件设计双极电极纸芯片的亲疏水蜡打印图案，如附图1所示；

(2)将步骤(1)中设计的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，随后将打印过的a4色谱纸放置到平板加热器或烘箱中，在100℃下加热100s，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；

(3)将步骤(2)中获得的纸芯片的通过丝网印刷技术印刷导电碳浆，制备驱动电极；

(4)将步骤(3)中获得的纸芯片双极电极区域生长金纳米颗粒，制备双极电极纸芯片；

(5)将步骤(4)中制得的纸芯片双极电极阴极区域滴加10～20μl10μg/ml的甲胎蛋白捕获抗体溶液，室温孵育20～30分钟，用超纯水清洗三次；

(6)将步骤(5)中得到的纸芯片双极电极阴极区域滴加10～20μl100μg/ml牛血清白蛋白溶液，室温孵育20～30分钟，用超纯水清洗三次；

(7)将步骤(6)中处理过的纸芯片双极电极阴极区域滴加10μl10pg/ml～200ng/ml的一定量甲胎蛋白标准溶液，室温孵育20～30分钟，用超纯水清洗三次；

(8)将10μl5～10mg/ml的ab2/pdau二抗复合物溶液滴加至步骤(7)中获得的双极电极阴极区域，室温孵育20～30分钟，用超纯水清洗三次，制得甲胎蛋白双极电极纸芯片电致化学发光传感器；

(9)将步骤(8)中得到的纸芯片双极电极阳极区域信号池内加入50μl0.1mol/l的磷酸缓冲溶液含有2.0～5.0mmol/l三联吡啶钌ru(bpy)3²⁺和30～50mmol/l三丙胺tpa，纸芯片双极电极阴极区域反应池内加入50μl30～50mmol/l的h2o2溶液，在驱动电极间施加4.0～6.0v电压，测定信号池电致化学发光强度。

本发明所述步骤(1)中设计的纸芯片的尺寸如附图1所示，纸芯片双极电极为4×14mm，双极电极两侧信号池和反应池为10×10mm的正方形。

本发明所述步骤(4)中双极电极区域生长金纳米颗粒的步骤为：量取160ml的二次水置于三口烧瓶中，加热到90℃，随后加入1.6ml氯金酸，水浴加热到96℃，反应1min，立即加入5.6ml1％柠檬酸钠，并搅拌15min至溶液变为酒红色；得到金种子溶液；10μl金种子溶液滴至纸芯片双极电极区域，孵育1h，加入20μl的1.2mmol/l氯金酸、2.0mmol/l十六烷基三甲基氯化铵和7.2mmol/l过氧化氢的10mmol/l磷酸缓冲溶液，孵育8分钟，制得双极电极区域生长金纳米颗粒。

本发明所述步骤(8)中ab2/pdau二抗复合物的制备步骤为：50μl1.0mmol/l的乙酸铜水溶液，2.5ml0.1mol/l的十八烷基三甲基氯化铵的乙二醇溶液，1.0ml1.0mmol/l的氯钯酸盐酸溶液，将上述溶液依次加入到1.0ml1.0mmol/l的氯金酸溶液中，搅拌10分钟，然后，迅速加入0.10ml0.2mol/l新制备的抗坏血酸溶液，轻轻摇动该溶液10分钟；所得混合溶液置于15℃恒温箱中反应12小时；反应结束后，得到的产物经离心分离，用超纯水洗涤5次后，放入干燥箱中在60℃干燥12h，得到pdau纳米材料，将pdau纳米材料与甲胎蛋白二抗ab2混合，室温孵育30分钟，得到ab2/pdau复合物。

本发明的有益效果

(1)利用纸芯片构建双极电极传感器实现信号和反应分开，避免背景干扰，提高方法的选择性。

(2)双极电极和外加电源之间无需导线相连，该检测装置的构建更简便。

(3)双极电极信号放大较三电极系统更佳，其阳极和阴极的分别修饰可实现高灵敏的ecl检测。

附图说明

图1双极电极纸芯片图案a：信号池；b：双极电极阳极；c：双极电极阴极；d：反应池

实施例：甲胎蛋白双极电极纸芯片电致化学发光传感器的应用

(1)在计算机上设计双极电极纸芯片的亲疏水蜡打印图案如图1所示，纸芯片双极电极为4×14mm，双极电极两侧信号池和反应池为10×10mm的正方形；

(2)将步骤(1)中设计的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，随后将打印过的a4色谱纸放置到平板加热器或烘箱中，在100℃下加热100s，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；

(3)将步骤(2)中获得的纸芯片的通过丝网印刷技术印刷导电碳浆，制备驱动电极；

(4)将步骤(3)中获得的纸芯片双极电极区域生长金纳米颗粒：量取160ml的二次水置于三口烧瓶中，加热到90℃，随后加入1.6ml氯金酸，水浴加热到96℃，反应1min，立即加入5.6ml1％柠檬酸钠，并搅拌15min至溶液变为酒红色；得到金种子溶液；10μl金种子溶液滴至纸芯片双极电极区域，孵育1h，加入20μl含有1.2mmol/l氯金酸、2.0mmol/l十六烷基三甲基氯化铵和7.2mmol/l过氧化氢的10mmol/l磷酸缓冲溶液，孵育8分钟，制得双极电极区域生长金纳米颗粒。

(5)将步骤(4)中制得的纸芯片双极电极阴极区域滴加10μl10μg/ml的甲胎蛋白捕获抗体溶液，孵育30分钟，用超纯水清洗三次；

(6)将步骤(5)中得到的纸芯片双极电极阴极区域滴加10μl100μg/ml牛血清白蛋白溶液，孵育30分钟，用超纯水清洗三次；

(7)将步骤(6)中得到的纸芯片双极电极阴极区域滴加10μl10pg/ml～200ng/ml的一定量甲胎蛋白标准溶液，孵育25分钟，用超纯水清洗三次；

(8)50μl1.0mmol/l的乙酸铜水溶液，2.5ml0.1mol/l的十八烷基三甲基氯化铵的乙二醇溶液，1.0ml1.0mmol/l的氯钯酸盐酸溶液，将上述溶液依次加入到1.0mmol/l的氯金酸溶液中，搅拌10分钟，然后，迅速加入0.10ml0.2mol/l新制备的抗坏血酸溶液，轻轻摇动该溶液10分钟；所得混合溶液置于15℃恒温箱中反应12小时；反应结束后，得到的产物经离心分离，用超纯水洗涤5次后，放入干燥箱中在60℃干燥12h，得到pdau纳米材料，将pdau纳米材料与甲胎蛋白二抗ab2混合，室温孵育30分钟，得到ab2/pdau复合物，将10μl10mg/ml的ab2/pdau二抗复合物溶液滴加至步骤(7)中处理过的双极电极负极区域，室温孵育20分钟，用超纯水清洗三次，制得甲胎蛋白双极电极纸芯片电致化学发光传感器；

(9)将步骤(8)中得到的纸芯片双极电极阳极区域信号池内加入50μl0.1mol/l的磷酸缓冲溶液含有4.0mmol/l三联吡啶钌ru(bpy)3²⁺和50mmol/l三丙胺tpa，纸芯片双极电极负极区域反应池内滴加50μl50mmol/l的h2o2溶液，在驱动电极间施加5.5v电压，对其电致发光强度进行检测。