HPLC同时定量测定水产品中乙酰甲喹及其主要代谢物的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种hplc同时定量测定水产品中乙酰甲喹及其主要代谢物的方法。

背景技术：

乙酰甲喹（mequindox），又名痢菌净，化学名为3-甲基-2-乙酰基-喹啉-n1,n2-二氧化物，为卡巴氧类似物，是由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所最早合成的一类新兽药。乙酰甲喹能促进动物生长，且对多数革兰氏阳性和阴性病原菌具有较强的抑制作用，因此在水产养殖中被广泛使用。但乙酰甲喹及其代谢物具有较强的光敏毒性和遗传毒性，对水生生态环境有潜在危害，且严重危害人体健康，故对乙酰甲喹及其代谢物进行准确、有效地检测是十分必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种hplc同时定量测定水产品中乙酰甲喹及其5种主要代谢物的方法，其操作简单、结果准确可靠。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种hplc同时定量测定水产品中乙酰甲喹及其5种主要代谢物的方法，其包括以下步骤：

1）将虾类去头、壳、肠线，蟹类去壳，鱼类去骨、内脏，取可食用部分进行匀浆（如不能及时检测，-18℃以下保存备用）；

2）取步骤1）所得浆液5g（精确至0.01g）于50ml塑料离心管中，加20ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合液振摇混匀，超声提取15min后，4000r/min离心10min，所得残渣再加入15ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合液，重复提取1次；合并上清液于鸡心瓶中，40℃旋转蒸发至近干，得待测样品；

3）向所得待测样品中加入1.00ml38vol%甲醇溶液，再加入5ml正己烷，漩涡混合1min后转移至10ml具塞离心管中，再于4000r/min离心10min，弃去上层正己烷，取下层溶液过0.45μm微孔滤膜，供液相色谱分析。

所述二氯甲烷-乙酸乙酯混合液中二氯甲烷的体积分数为75%。

所述液相色谱的条件为：色谱柱：c18色谱柱，150mm×4.6mmi.d.，粒径3.5μm；流动相：甲醇-水混合液，梯度洗脱；洗脱程序为：0-8min，甲醇体积38%，8-11min，甲醇体积由38%提升到70%，11-17min，甲醇体积保持为70%，17-18min，甲醇体积由70%降至38%，18-22min，甲醇体积保持为38%；流速：0.8ml/min柱温：35℃；进样体积：20μl；紫外检测波长：240nm。

本发明采用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液对水产样品进行提取后，采用正己烷去脂，再利用高效液相色谱-紫外检测仪，以甲醇-水混合液为流动相，可同时对水产品中乙酰甲喹及其主要代谢物加氢乙酰甲喹（m1）、加氢脱一氧乙酰甲喹（m2）、加氢脱二氧乙酰甲喹（m10）、脱一氧乙酰甲喹（m3）、脱二氧乙酰甲喹（m4）进行定量检测，其操作简单、结果准确可靠。

附图说明

图1为6种标准品的光谱图；

图2为含6种标准品的标准工作液的液相色谱图；

图3为根据标准工作液中标准品浓度及其响应峰面积建立的标准工作曲线；

图4为待测虾肉样品经处理后的液相色谱图；

图5为待测鳗鲡肌肉样品经处理后的液相色谱图；

图6为待测蟹肉样品经处理后的液相色谱图；

其中，meq为乙酰甲喹、m1为加氢乙酰甲喹、m2为加氢脱一氧乙酰甲喹、m10为加氢脱二氧乙酰甲喹、m3为脱一氧乙酰甲喹、m4为脱二氧乙酰甲喹。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实验前，先利用hplc结合二极管阵列检测器采集6种标准品190~600nm的3d图并截取标准品的光谱图，其结果如图1。从图1可以看出，6种标准品在240nm波长处均有较大吸收，较373nm（单独检测meq的常用波长）的灵敏度高一倍以上。故选择240nm为检测波长。

实施例

1）分别准确称取0.01g（精确至0.0001g）乙酰甲喹（meq）、加氢乙酰甲喹（m1）、加氢脱一氧乙酰甲喹（m2）、加氢脱二氧乙酰甲喹（m10）、脱一氧乙酰甲喹（m3）、脱二氧乙酰甲喹（m4）标准品（纯度≥99.0%），用甲醇溶解并定容至100ml，配成100μg/ml的标准贮备液，置4℃冰箱中冷藏保存（保存期不超过3个月）；

2）将步骤1）制得的标准贮备液加38vol%甲醇溶液稀释至浓度范围为0.05μg/ml～1μg/ml，取适量混合后过0.45μm微孔滤膜，得标准工作液；

3）将所得标准工作液进行液相色谱分析，并根据标准工作液的浓度及乙酰甲喹及代谢物响应峰面积建立标准工作曲线；

所述液相色谱的条件为：色谱柱：c18色谱柱，150mm×4.6mmi.d.，粒径3.5μm；流动相：甲醇-水混合液，梯度洗脱（其洗脱程序如表1）；流速：0.8ml/min柱温：35℃；进样体积：20μl；紫外检测波长：240nm。

表1液相色谱洗脱程序

4）将虾类去头、壳、肠线，蟹类去壳，鱼类去骨、内脏，取可食用部分进行匀浆（如不能及时检测，-18℃以下保存备用）；

5）取步骤1）所得浆液5g（精确至0.01g）于50ml塑料离心管中，加20ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合液振摇混匀，超声提取15min后，4000r/min离心10min，所得残渣再加入15ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合液，重复提取1次；合并上清液于100ml鸡心瓶中，40℃旋转蒸发至近干，得待测样品；

6）向所得待测样品中加入1.00ml38vol%甲醇溶液，再加入5ml正己烷，漩涡混合1min后转移至10ml具塞离心管中，再于4000r/min离心10min，弃去上层正己烷，取下层溶液过0.45μm微孔滤膜，进行液相色谱分析（分析间每20次样品测定后应加入一个与样品峰面积相近的标准工作液，如果测得的值与原值相对平均偏差超过5%，则应重新进行标准曲线的制作）；

7）结果计算：试样中乙酰甲喹及代谢物的含量按式（1）进行计算：

…………………………………………………（1）

式中：

x——试样中乙酰甲喹及代谢物的含量（以质量分数计），单位为微克每克（μg/g）；

c——由标准工作曲线得出的乙酰甲喹及代谢物浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；

v——试样最终定容体积，单位为毫升（ml）；

f——试样稀释倍数；

m——试样质量，单位为克（g）。

图2为标准工作液的液相色谱图，图3为根据标准工作液的浓度及乙酰甲喹及代谢物响应峰面积建立的标准工作曲线。由图3可见，工作曲线的线性相关系数r²≥0.999。

图4-6为待测虾肉、鳗鲡肌肉、蟹肉经处理后的液相色谱图，表2为测定的精密度与回收率。

表2精密度与回收率

由表2可见，本发明方法rsd＜5%，平均回收率为95.5%~99.8%，证明该方法准确可靠。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。