一种基于图像识别法细胞计数仪的人工计数和校验装置的制作方法

本发明涉及生命科学研究和临床应用领域，特别涉及一种基于图像识别法细胞计数仪的人工计数和校验装置。

背景技术：

细胞作为科研、临床及制药等行业的研究对象，已得到众多研究者的关注和应用。在细胞研究中，细胞计数是必不可少的工作之一，如何快速准确的完成细胞计数是每位研究者首要考虑的问题，不正确的计数方法和结果会导致实验结果和实验方向的偏差。

目前，已在应用的细胞计数方法有两类：图像识别法和流式细胞法，每种方法的步骤如下：

1.显微镜计数法：属于图像识别法。研究者将细胞染色后放置在显微镜下观察，使用标准的玻璃计数板，人工数出标准玻璃计数板中细胞数量，并且能根据细胞的着色情况准确判断出细胞的死活状态，从而分别计算出死、活细胞的浓度和总数。此方法所见即所得，准确性高。为细胞计数的金标准。此方法需要有经验的专业人员操作。要求标准玻璃计数板的刻线标识要准确、清晰。制作标准玻璃计数板的难度大、成本高。每次使用后，标准玻璃计数板需要清洗后备用。玻璃盖玻片易破碎，对研究者构成潜在伤害，增加了生物安全性风险。

2.流式细胞计数仪法：属于流式细胞法。研究者将细胞样品处理为单细胞混悬液，上机后，仪器自动给出细胞的种类、数量、浓度。自动化程度高。但不能保留细胞的真实图像，也不能判断细胞死活状态。有个别机型在尝试将图像识别技术与流式技术融合，希望能解决真实细胞图像问题。细胞标本的处理过程较图像识别法复杂，仪器、试剂及耗材的成本高，结果不便于回溯。

3.全自动细胞计数仪：属于图像识别法。研究者将细胞染色后，细胞悬液定量加入一次性的计数板中。也可以将标本先涂抹到载玻片上后再染脱色处理，制成细胞玻片。插入仪器，仪器自动调焦、拍照、图像识别、提供详细的报告单。仪器中内置了一套全电动的显微镜，并增加了自动调焦、自动图像识别软件技术，实现了全自动化。此方法结合了显微镜计数法的优点：所见即所得，直观明了，图片可留档回溯，同时又揉合了最新的感光芯片技术、图像识别软件技术、自动化控制技术。此方法自动化程度与流式细胞法相当，图片能留档回溯，能判断培养细胞的死活状态，能识别细胞的形态和荧光标记颜色。

随着全自动细胞计数仪的普及，逐渐取代了人工的显微镜计数法。研究者对全自动细胞计数仪的准确性问题尤为关注，即仪器计数的准确性和校准方法。

显微镜计数法在使用时，研究者所见即所得，准确性高。为细胞计数的金标准。但要根据实验目的选择使用不同类型的玻璃标准计数板，比如临床上最常使用的血细胞计数板(本发明以血细胞计数板为例，不排除使用其他标准的刻线板)。因为标准计数板上有精密加工的刻线标识，便于研究者观察并计算标准体积下细胞的浓度(即已知高度下单位面积中细胞的数量)。

大多数全自动细胞计数仪使用一次性塑料计数板。从生物安全角度考虑为一次性使用；从制造工艺上和成本上考虑为不带刻线标识；刻线标识对识别软件有一定的干扰；个别机型可以兼容带刻线的血细胞计数板，但血细胞计数板的高度和一次性塑料计数板高度、计数区域面积都有很大差异；

细胞悬液不是溶液，是悬浮液。细胞在液体中不是均匀分布，而是呈颗粒状悬浮在液体中。再加上细胞是有生命的，细胞分裂无时无刻不在进行。造成细胞悬液是一种颗粒大小不同的悬浮液。

细胞在计数板中的分布不是均匀的，不同区域差异很大，并且是随机的。两次取样计数也会存在取样误差。取样时样品是否混匀，也会出现误差。

基于此，经长期实验观察，细胞在显微镜下人工计数和全自动细胞计数仪计数存在约30％的浓度偏差。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于图像识别法细胞计数仪的人工计数和校验装置，在现有全自动细胞计数仪的基础上做了更新，解决了人工显微镜计数和全自动细胞计数仪计数出现较大偏差的问题，同时解决了全自动细胞计数仪细胞浓度标定和细胞直径标定问题。

本发明是通过以下技术方案来实现的：一种基于图像识别法细胞计数仪的人工计数和校验装置，包括全自动细胞计数仪，所述全自动细胞计数仪包括控制主机，所述控制主机具有一个人机界面，该控制主机具有整机硬件控制模块自动调焦模块以及自动图像识别模块，还包括一摄像头、显微光路组、荧光滤块模组、物镜模组、荧光光源及透镜组、自动样品台以及可见光光源及透镜组，该全自动细胞计数仪还设置有一个电动载物台以及一个更换卡槽机构，主机内部主板录入一个虚拟刻线软件包以及人工计数软件，并使用多种类的细胞计数板。

作为优选的技术方案，细胞计数板为一次性细胞计数板，该一次性细胞计数板有单孔、双孔以及十孔，样品腔高度0.1mm，样品腔两端有进样孔和出样孔，或者使用玻璃的血细胞计数板、尿沉渣计数板、玻璃载玻片。

作为优选的技术方案，通过虚拟刻线软件包生成在显示器上显示出的图案，模拟实际图案尺寸，实现定量观察特定图案中细胞的数量。

作为优选的技术方案，所述人工计数软件使用虚拟刻线软件包中的虚拟刻线，记录人工计数细胞的死活状态，并记录其结果。

作为优选的技术方案，人工计数软件还包括将人工计数数据添加到仪器，使用软件计算细胞的浓度和细胞直径，将人工计数结果与仪器计数结果进行比对，并将人工计数结果作为金标准，修正仪器的计数结果，起到校正的作用。

作为优选的技术方案，电动载物台的有效移动范围不小于5×5mm，保证仪器的计数区域和血细胞计数板的计数区域相同。

作为优选的技术方案，全自动细胞计数仪的调焦机构的调焦范围在0-8mm，兼容血细胞计数板。

作为优选的技术方案，更换卡槽机构适应一次性计数板、玻璃的血细胞计数板、临床常用的玻璃载玻片、尿沉渣计数板，或可更换不同种类的卡槽以适应不同的计数板。

本发明的有益效果是：1、避免两次取样误差，只需将细胞悬液加入一次性细胞计数板中，插入全自动细胞计数仪。不需要将细胞悬液加入到血细胞计数板中，避免两次取样时细胞悬液不均匀的误差；

2、不需要用独立的显微镜。直接使用全自动细胞计数仪中的显微光路及摄像头成像系统，研究者可通过仪器屏幕观察到清晰的细胞图像，类似于在显微镜加装摄像头后使用电脑屏幕观察细胞；

3、使用多种类的一次性细胞计数板。计数板的种类可扩展性强，计数片上不增加刻线标识，易于塑料模具批量化。一次性使用可保护研究者，提高生物安全性。用后可焚烧销毁，保护环境；

4、虚拟刻线软件包，便于研究者自定义刻线类型，仪器默认的刻线经过严格标定，稳定可靠，避免计数板上真实刻线的加工偏差；

5、人工计数软件，在同一台仪器上实现人工计数和仪器自动计数的浓度校验。软件内置可自定义的浓度计算公式以及可自定义的体积补偿系数，便于校正一次性细胞计数板和血细胞计数板的体积偏差，研究者如同使用金标准的显微镜法一样直观的得到细胞死活状态和浓度结果；

6、解决了研究者对不同细胞计数方法之间细胞浓度存在较大偏差的问题；

7、改进后的全自动细胞计数仪，既能人工计数，也能自动计数，并且可以用人工计数结果标定自动计数结果；

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是血细胞计数板外观及刻线图案示意图；

图2是一次性细胞计数板的计数位置示意图；

图3是虚拟刻线软件界面图；

图4是人工计数软件界面图。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

如图1-图4所示，实施例一(全自动细胞计数仪的人工计数方法)：

步骤一.细胞悬液制备：与显微镜计数法和全自动细胞计数仪相同，尽量减少细胞的聚团；

步骤二.使用移液器将15ul细胞悬液加入一次性细胞计数板中；

步骤三.将一次性细胞计数板插入仪器的样品槽中；

步骤四.选择人工计数模式；

步骤五.选择计数位置“1”，载物台自动移到计数片的“1”号位置；

步骤六.选择调焦，仪器自动调焦，也可以使用调焦条手动补偿；

步骤七.打开虚拟刻线，仪器默认为打开(不用时可以隐藏)；

步骤八.人工数出刻线内死活细胞数量，计数规则同血细胞计数板，对于压线的细胞采用“数上不数下，数左不数右”的原则。

步骤九.将死活细胞数量填入预设好的对话框；

步骤十.使用“抓图”功能保存原始图片；

步骤十一.重复第5-10步骤，将“2”号位置、“3”号位置、“4”号位置结果均填入相应对话框；

步骤十二.使用“生成报告”，自动生成细胞浓度报告；

步骤十三.使用帮助键“？”，可查询浓度计算公式、稀释倍数、面积补偿系数等；

步骤十四.人工计数界面上同时显示仪器自动计数结果。

实施例二(全自动细胞计数仪的标定方法)：

步骤一、使用全自动细胞计数仪得到细胞悬液中细胞的死活比例和浓度；

步骤二、按“实施例一”步骤得到人工计数的细胞悬液中细胞的死活比例和浓度；

步骤三、检查自动计数的细胞标记图，审核仪器是否有错标、漏标的情况；

步骤四、比较两种结果的差异，通过调节“面积补偿系数”和修正仪器识别错误，得到和人工计数相同的结果，即完成仪器的浓度校准；

步骤五、使用标准的微球，可以实现仪器的细胞直径校准；

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。