浓缩活心丸中蟾酥含量的检测方法与流程

本发明涉及属于药物检测领域，具体涉及一种浓缩活心丸中蟾酥含量的检测方法。

背景技术：

蟾酥是蟾蜍耳后腺及表皮腺体的分泌物，白色乳状液体或浅黄色浆液，有毒。蟾王蟾酥提取浆液，干燥，上色，密封保存后可以入药。有解毒，消肿，强心，止痛的功效。主治疔疮，痈疽，发背，瘰疬，慢性骨髓炎，咽喉肿痛，小儿疳积，心衰，中风、虫牙痛。在临床上应用于治疗心力衰竭、骨关节结核及慢性骨髓炎瘘孔、恶性肿瘤和用于表面麻醉等。

由于蟾酥具有较强的生理活性，同时其毒性也较大，用药不当会出现严重的毒副作用。梁晓萍等专家总结出如长期或过量服用蟾酥可出现循环、消化及神经系统等的中毒症状，因此，对蟾酥及其制剂需要严格控制质量和服用剂量。2015版中国药典规定蟾酥不入汤剂，入丸散内服人体用量0.015～0.03g，按成人60kg体重计算，人的服用剂量为0.00025～0.0005g/kg，对蟾酥的服用剂量有严格的要求。

活心丸为2010年度国家药品标准提高品种，现行标准收载于部颁标准中药成方制剂第十八册(标准文号：ws3-b-3452-98)，但在活心丸的原有标准中并没有对蟾酥的含量进行检测，需要一个浓缩活心丸中蟾酥的含量检测方法，对浓缩活心丸进行更全面的质量检测和控制。

技术实现要素：

本发明要解决浓缩活心丸质量检测原有标准中没有对蟾酥进行定量测定的问题，而提出一种浓缩活心丸中蟾酥含量的检测方法，对浓缩活心丸进行更全面的质量检测和控制。

本发明提供的浓缩活心丸中蟾酥含量的检测方法，其中所述浓缩活心丸的处方为灵芝20g，人工麝香1.2g，熊胆2.4g，体外培育牛黄1.2g，珍珠2.4g，人参18g，蟾酥1.8g，附子(黑顺片)9g，冰片1.2g，红花2.0g；所述浓缩活心丸中蟾酥含量的检测方法包括：步骤1、对照品溶液的制备：取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含华蟾酥毒基30μg、脂蟾毒配基20μg的混合溶液；步骤2、供试品溶液的制备：取所述浓缩活心丸研细，取0.4g，精密称定，精密加入乙醇20ml，称定重量，超声处理后，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；步骤3、精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

进一步优化为，在步骤2中供试品取样量为0.4g。

进一步优化为，在步骤2中超声处理要求为功率350w,频率37khz；处理时间为15min。

进一步优化为，在步骤2超声处理时间为15min。

进一步优化为，在步骤3中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液＝44:56为流动相；检测波长为296nm。

进一步优化为，在步骤3中流动相用磷酸调节ph值至3.2。

优点：本发明所述浓缩活心丸中蟾酥含量的检测方法在准确度试验中测得平均加样回收率华蟾酥毒基为100.4％，rsd为0.9％(n＝6)；脂蟾毒配基为99.4％，rsd为1.2％(n＝6)，说明所述方法的准确度较好；精密度实验中测得华蟾酥毒基rsd为0.4％(n＝6)、脂蟾毒配基rsd为0.6％(n＝6)，说明所述方法重现性良好；缺蟾酥阴性对照样品无干扰，说明所述方法专属性强；线性关系考察结果，以进样量(mg)(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，线性回归方程为：华蟾酥毒基y＝752.8827x+0.6190，r＝1；脂蟾毒配基y＝733.3296x+0.0754，r＝1，说明华蟾酥毒基在0.03159～2.106mg及脂蟾毒配基在0.02122～2.12239mg的范围内，线性关系良好，所述方法能够准确测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量。本发明所述浓缩活心丸中蟾酥含量的检测方法填补了浓缩活心丸质量检测原标准中蟾酥含量检测的空白，不仅能够有效鉴别活心丸中微量成份蟾酥的有无，也能及时准确检测蟾酥的含量，使得对浓缩活心丸的质量控制更加全面、有效。

附图说明

图1是蟾酥液相色谱图(a华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品；b样品；c缺蟾酥阴性对照样品)；

图2-1是华蟾酥毒基的线性图谱；

图2-2脂蟾毒配基的线性图谱；

图3是华蟾酥毒基、脂蟾毒配基紫外光谱扫描图；

图4是蟾酥液相色谱图(色谱柱a：symmetryshieldtmrp18；b：ultimateaq-c18；c：cosmosilpackedcolumn5c18-paq)。

具体实施方式

(一)试验材料

(1)仪器：高效液相色谱仪：安捷伦1100；超声波清洗仪：elmasonics300h超声波清洗器(功率350w，频率37khz)；电子天平：sartorius-cp225d，sartorius-cp224s；色谱柱：a：symmetryshieldtmrp18(250mm×4.6mm，5μm)；b：ultimateaq-c18(250mm×4.6mm，5μm)；c：cosmosilpackedcolumn5c18-paq(250mm×4.6mm，5μm)。

(2)试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

(3)对照品：华蟾酥毒基，批号为110803-200605；脂蟾毒配基，批号为110718-201108，含量以98.9％计。均购自中检院。

(4)供试品：批号为12030201、12050101、12060101、12070101、12080101的浓缩活心丸，由广州悦康生物制药有限公司提供。

(5)阴性样品：缺蟾酥阴性对照样品。由广州悦康生物制药有限公司制备提供。

(二)实施例

色谱条件与系统适应性试验：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液44:56，用磷酸调节ph值至3.2；检测波长为296nm。理论板数按华蟾酥毒基峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含华蟾酥毒基30μg、脂蟾毒配基20μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备：分别取上述5批供试品，研细，各取约0.4g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20ml，称定重量，以功率350w,频率37khz的超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得各供试品中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量，结果如表1。

表1样品含量测定结果

以下通过验证试验说明本发明检测方法的可行性。

(三)验证试验

1、准确度(加样回收率试验)考察

回收用对照品溶液的制备：分别精密称取华蟾酥毒基对照品0.01053g，置50ml容量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含华蟾酥毒基0.2106mg的溶液，作为回收用对照品溶液ⅰ；取质量分数为98.9％的脂蟾毒配基对照品0.01073g，置50ml容量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含脂蟾毒配基0.2122mg的溶液，作为回收用对照品溶液ⅱ。

取含华蟾酥毒基1.41mg/g、脂蟾毒配基0.69mg/g，批号为12070101的供试品，研细，取6份，每份约0.2g，精密称定，精密加入对照品溶液ⅰ2ml和对照品溶液ⅱ1ml。按含量测定方法测定，计算华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的回收率。结果华蟾酥毒基为100.4％，rsd为0.9％(n＝6)；脂蟾毒配基为99.4％，rsd为1.2％(n＝6)，见表2。

表2准确度(加样回收)试验结果

结果表明：该方法不同成份的平均回收率在99.4～100.4％之间，说明该方法的准确度较好。

2、精密度(重复性)考察

取批号为12070101的供试品研细，取6份，每份约0.4g，精密称定，依上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果见表3。华蟾酥毒基rsd为0.4％(n＝6)、脂蟾毒配基rsd为0.6％(n＝6)，说明本方法重现性良好。

表3重复性试验结果

3、专属性考察

按供试品溶液的制备方法同法制成缺蟾酥的阴性对照样品溶液，吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照样品溶液10μl，注入液相色谱仪，结果表明缺蟾酥阴性对照样品无干扰，结果见图1。

4、线性关系的考察

分别精密称取华蟾酥毒基对照品0.01053g，置50ml容量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含华蟾酥毒基0.2106mg的溶液作为华蟾酥毒基对照品母液；取质量分数为98.9％的脂蟾毒配基对照品0.01073g，置50ml容量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含脂蟾毒配基0.2122mg的溶液，作为脂蟾毒配基对照品母液。

ⅰ精密吸取华蟾酥毒基对照品溶液母液3ml和脂蟾毒配基对照品溶液母液2ml，置20ml容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含华蟾酥毒基0.03159mg、脂蟾毒配基0.021224mg的溶液，作为混合对照品溶液ⅰ。

ⅱ华蟾酥毒基对照品溶液母液和脂蟾毒配基对照品溶液母液，即每1ml含华蟾酥毒基0.3159mg、脂蟾毒配基0.21224mg的溶液，作为对照品溶液ⅱ。

分别精密吸取混合对照品溶液ⅰ1μl、3μl、6μl、10μl，混合对照品溶液ⅱ5μl、10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，结果见表4。

表4线性关系的考察结果

以进样量(mg)(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，线性回归方程为：华蟾酥毒基y＝752.8827x+0.6190，r＝1；脂蟾毒配基y＝733.3296x+0.0754，r＝1。结果表明：华蟾酥毒基在0.03159～2.106mg及脂蟾毒配基在0.02122～2.12239mg的范围内，线性关系良好，结果见图2-1、2-2。

5、耐用性考察

(1)供试品溶液的制备

①提取方法的考察

方法1取批号为12070101的供试品，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

方法2取批号为12070101的供试品，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

方法3取批号为12070101的供试品，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

分别测定华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的总含量，结果见表5。

表5不同提取方法的试验结果

比较了不同的提取方法，结果三个方法的含量结果基本一致，从环保角度及操作的简便性两方面考虑，选择方法1作为提取方法。

②提取时间的考察

取批号为12070101的供试品，研细，分别称取4份，每份0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20ml，密塞，称定重量，按表5超声时间进行超声处理提取。

分别测定华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量，结果见表6。

表6不同超声处理提取时间考察结果

结果表明：不同的超声处理提取时间，含量偏差不大，从节约时间角度及样品提取效率两方面考虑，选用超声处理提取15分钟。

③不同浓度提取溶剂的考察

取批号为12070101的供试品，研细，分别称取4份，每份各0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入下表不同浓度乙醇各20ml，密塞，称定重量，按照拟定提取方法进行样品处理。

分别测定华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量，结果见表7。

表7不同浓度提取溶剂的考察结果

结果表明：75％乙醇及乙醇提取的含量结果相差不大，为了操作的简便性，选用乙醇为提取溶剂。

④取样量的考察

取批号为12070101的供试品，研细，称取5份，分别为0.1g、0.2g、0.4g、0.8g、1g，分别具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20ml，密塞，称定重量，超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

分别测定华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量，结果见表8。

表8取样量考察的结果

结果表明：各取样量的含量相差不大，为了操作方便，故将样品取样量定为0.4g。

经上述方法学考察，确定以下为供试品的处理方法

取所述浓缩活心丸，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20ml，密塞，称定重量，超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

6、最大吸收波长的选择：取两种对照品适量分别加流动相使溶解，并稀释成适当浓度，经紫外光谱扫描测定，华蟾酥毒基在294nm、脂蟾毒配基在299nm处有最大吸收，见图3，并参照《中国药典》2010年版一部蟾酥含量测定的测定波长为296nm，并结合二者均接近的最大吸收波长，确定296nm作为测定吸收波长。

7、流动相的选择

采用中国药典2010年版一部蟾酥及中国药典2010年版第一增补本益心丸项下的含量测定中所用的流动相为流动相。结果供试品色谱图中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰达到基线分离，峰形对称，保留时间适中，见图4。

8、色谱柱

①色谱柱的选择：参照中国药典2010年版一部蟾酥及中国药典2010年版第一增补本益心丸含量测定项下的方法；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

②不同色谱柱的考察：取批号为12070101的供试品，按含量测定方法测定华蟾酥毒基、脂蟾毒配基总含量。分别用a：symmetryshieldtmrp18(250mm×4.6mm，5μm)；b：ultimateaq-c18(250mm×4.6mm，5μm)；c：cosmosilpackedcolumn5c18-paq(250mm×4.6mm，5μm)三种品牌的色谱柱测定。结果见表9及图4。

表9不同色谱柱的测定结果

结果表明：用三种品牌的色谱柱测定，结果无明显差异，华蟾酥毒基、脂蟾毒配基rsd分别为1.5％、3.3％。

9、稳定性考察

取批号为12070101的供试品，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，0、3、8、16、21、25小时测定其峰面积，结果见表10。

结果表明：样品在25小时内稳定。

表10稳定性考察测定结果

结果表明：样品在25小时内稳定。

10、限度的制订

由于未收集到对应批次的药材作转移率考察，仅对收集到的广州悦康生物制药有限公司提供的5批样品进行含量测定。根据所述浓缩活心丸处方量(1.8g/千丸)及蟾酥药材的含量(中国药典2010年版规定蟾酥含量为以干燥品计，含华蟾酥毒基和脂蟾毒配基不得少于6.0％，水分不得过13.0％)，并根据5批样品的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总含量平均测定结果为2.28mg/g，考虑到药材来源及大生产等因素影响，将平均值下浮20％，暂定所述浓缩活心丸含量测定的限度为每1g含蟾酥以华蟾酥毒基(c26h34o6)和脂蟾毒配基(c24h32o4)的总量计应不得少于1.8mg。

综上所述，本发明浓缩活心丸中蟾酥含量的检测方法具有准确度和重现性好、专属性强、稳定性佳的优点，能够有效的检测出浓缩活心丸中蟾酥的含量，为浓缩活心丸的质量控制提供重要保障。以上通过实例和数据考察试验对本发明浓缩活心丸中蟾酥含量的检测方法的具体内容进一步做了详细说明和方法验证，但不应将理解为本发明仅限于实例，因为根据上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可做出其他多种形式的修改、替换和变更，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明。