浓缩活心丸中体外培育牛黄含量的检测方法与流程

本发明涉及属于药物检测领域，具体涉及一种浓缩活心丸中体外培育牛黄含量的检测方法。

背景技术：

体外培育牛黄具有清心，豁痰，开窍，凉肝，熄风，解毒的功效。用于热病神昏，中风痰迷，惊厥抽搐，癫痫发狂，咽喉肿痛，口舌生疮，痈肿疔疮。体外培育牛黄是国家一类中药新药，药学研究表明体外培育牛黄的性状、结构、成分及其含量、药理、临床疗效与天然牛黄基本一致，无明显不良反应。牛黄中的胆红素是解热、抗炎和抗感染的主要活性成分，以胆红素作为指标成分对牛黄进行含量测定是科学、合理的。

体外培育牛黄是浓缩活心丸中的一种成分，活心丸为2010年度国家药品标准提高品种，由广州悦康生物制药有限公司生产。现行标准收载于部颁标准中药成方制剂第十八册(标准文号：ws3-b-3452-98)。在原标准中并没有关于体外培育牛黄的含量测定，因此有必要为其提供一种专属性强、精密度好的体外培育牛黄含量的检测方法，更好的对浓缩活心丸的质量进行全面的控制。

技术实现要素：

本发明是要解决活心丸质量检测原有标准中没有对体外培育牛黄进行定量测定的问题，提出的一种浓缩活心丸中体外培育牛黄含量的检测方法，提高对浓缩活心丸的质量控制。

本发明提供的浓缩活心丸中体外培育牛黄含量的检测方法，所述浓缩活心丸的处方为：灵芝20g，人工麝香1.2g，熊胆2.4g，体外培育牛黄1.2g，珍珠2.4g，人参18g，蟾酥1.8g，附子(黑顺片)9g，冰片1.2g，红花2.0g；，所述浓缩活心丸中体外培育牛黄含量的检测方法包括以下几个步骤：步骤1、对照品溶液的制备：取胆红素对照品适量，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含15μg的溶液；步骤2、供试品溶液的制备：取所述浓缩活心丸，研细，取约50mg，精密称定，置具塞容器中，精密加入含0.15％十六烷基三甲基氯化铵的10％草酸溶液3-10ml，涡旋至充分混匀，精密加入水饱和的二氯甲烷25ml，称定重量，超声处理45-60min后，放冷，再称定重量，用水饱和的二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，离心，取二氯甲烷液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；步骤3、精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

进一步优化为，在步骤2中加入含0.15％十六烷基三甲基氯化铵的10％草酸溶液量为3ml。

进一步优化为，在步骤2中超声处理要求为：功率350w,频率37khz，处理45min。

进一步优化为，在步骤3中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-1％冰醋酸溶液(95:5)为流动相；检测波长为450nm。

优点：本发明所述浓缩活心丸中体外培育牛黄含量的检测方法在准确度试验中测得胆红素平均回收率在101.40～103.59％之间，说明所述检测方法的准确度较好；精密度实验中测得rsd为1.5％(n＝6)，说明所述检测方法重现性良好；缺体外培育牛黄阴性对照样品无干扰，说明所述检测方法专属性强；线性关系考察结果，以进样量(mg)(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，线性回归方程为：胆红素y＝6217.2026x–13.8479，r＝1，说明胆红素在0.01517～1.5169mg的范围内，线性关系良好，所述检测方法能准确有效的测定胆红素含量。本发明所述浓缩活心丸中体外培育牛黄含量的检测方法填补了浓缩活心丸质量原标准中体外培育牛黄含量检测的空白，本发明不仅能够有效鉴别活心丸中微量成份体外培育牛黄的有无，更可以准确有效的测定体外培育牛黄的含量，对浓缩活心丸的质量控制具有重要意义。

附图说明

图1是体外培育牛黄液相色谱图(a胆红素对照品；b样品；c缺体外培育牛黄阴性对照样品)；

图2是胆红素的线性图谱；

图3是胆红素紫外光谱扫描图；

图4是胆红素的高效液相色谱图(不同色谱柱)。

具体实施方式

(一)试验材料

1、仪器：高效液相色谱仪：安捷伦1100；超声仪：elmasonics300h超声波清洗器，功率350w，频率37khz；色谱柱：a：shim-packclc-ods(150mm×4.6mm，5μm)；b：ultimateaq-c18(250mm×4.6mm，5μm)；c：dikmadiamonsil(150mm×4.6mm，5μm)；天平sartoriucp224s、cp225d；

2、试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

3、对照品：胆红素对照品，批号为100077－200805，含量以99.6％计，购自中检院。

4、供试品：批号为12030101、12050101、12060101、12070101、12080101的所述浓缩活心丸，由广州悦康生物制药有限公司提供。

5、阴性样品：缺体外培育牛黄阴性样品。由广州悦康生物制药有限公司制备提供。

(二)实施例

实施例1

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-1％冰醋酸溶液＝95:5为流动相；检测波长为450nm。理论板数按胆红素峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备：取胆红素对照品适量，精密称定，加二氯甲烷制成每1ml含15μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：分别取上述5批供试品，研细，各取约50mg，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入(含0.15％十六烷基三甲基氯化铵)的10％草酸溶液3ml，涡旋至充分混匀，精密加入水饱和的二氯甲烷25ml，称定重量，以功率350w、频率37khz超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用水饱和的二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，离心，取二氯甲烷液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μl，注入液相色谱仪，测定，即得各供试品中胆红素含量，结果见表1。

表1供试品含量测定结果

以下通过验证试验说明本发明检测方法的可行性。

(三)验证试验

1、准确度(加样回收率试验)考察

回收用对照溶液的制备：精密称取质量分数为99.6％的胆红素对照品0.01523g，置100ml容量瓶中，加二氯甲烷使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含胆红素0.1523mg的回收用对照品溶液；取含胆红素8.8876mg/g，批号为12070101的供试品，研细，取6份，每份约25mg，精密称定，精密加入回收用对照品溶液1.5ml。按含量测定方法测定，计算胆红素的回收率。结果见表2，胆红素的回收率为102.6％，rsd为0.8％(n＝6)，说明本方法的准确度较好。。

表2准确度(加样回收)试验结果

2、精密度(重复性)考察

取批号为12070101的供试品，研细，取6份，每份约50mg，精密称定，依上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果见表3，胆红素rsd为1.5％(n＝6)，说明本方法重现性良好。

表3重复性试验结果

3、专属性考察

按供试品溶液的制备方法同法制成缺体外培植牛黄的阴性样品溶液，吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液10μl，注入液相色谱仪，结果表明缺体外培植牛黄阴性对照样品无干扰，见图1。

4、线性关系的考察

精密称取质量分数为99.6％胆红素对照品0.01523g，置100ml容量瓶中，加水饱和的二氯甲烷使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含胆红素0.1517mg的溶液，作为对照品溶液母液。

ⅰ：精密吸取对照品溶液母液2.5ml，置25ml容量瓶中，加水饱和二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含胆红素0.01517mg的溶液，作为对照品溶液ⅰ。

ⅱ：每1ml含胆红素0.1517mg的对照品溶液母液，作为对照品溶液ⅱ。

分别精密吸取对照品溶液ⅰ各1、4、8、10μl，对照品溶液ⅱ各2、5、10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，结果见表4。以进样量(mg)(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，线性回归方程为：胆红素y＝6217.2026x–13.8479，r＝1。结果：胆红素在0.01517～1.5169mg的范围内，线性关系良好，见图2。

表4线性关系的考察结果

5、耐用性考察

(1)供试品溶液的制备

①加入草酸溶液的考察

取批号为12070101的供试品，研细，分别称取5份，每份各50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入含0.15％十六烷基三甲基氯化铵的10％草酸溶液0ml、1ml、3ml、5ml、10ml，涡旋至充分混匀，精密加入水饱和二氯甲烷25ml，称定重量，以功率350w、频率37khz超声处理45分钟，再称定重量，用水饱和的二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，离心，取二氯甲烷液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按上述检测方法分别测定胆红素的含量，结果见表5。

表5加入不同草酸的量的试验结果

结果表明：加入含0.15％十六烷基三甲基氯化铵的10％草酸溶液3～10ml，胆红素的提取效率较高，随着提取溶液加入体积的增大，胆红素的提取效率达到一定值后基本不变，表明样品中的胆红素已被较充分提取。但随着加入草酸溶液的量增大，样品的重复性变差，因此选择加入草酸溶液的量为3ml。

②超声提取时间的考察

取批号为12070101的供试品，研细，分别称取4份，每份各50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入含0.15％十六烷基三甲基氯化铵的10％草酸溶液3ml，涡旋至充分混匀，精密加入水饱和的二氯甲烷25ml，称定重量，以功率350w、频率37khz的超声条件按表6的超声时间进行超声处理，再称定重量，用水饱和的二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，离心，取二氯甲烷液，用孔径为0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别测定胆红素的含量，结果见表6。

表6超声提取时间的结果

结果表明：当超声处理提取45分钟和60分钟的含量偏差不大，从节约时间的角度及样品提取效率两方面考虑，确定超声处理提取时间为45分钟。

经上述方法学考察，确定以下为供试品的处理方法

取供试品，研细，取约50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含0.15％十六烷基三甲基氯化铵的10％草酸溶液3ml，涡旋至充分混匀，精密加入水饱和的二氯甲烷25ml，称定重量，以功率350w、频率37khz超声处理45分钟，再称定重量，用水饱和的二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，离心，取二氯甲烷液，用孔径为0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

6、最大吸收波长的选择

取胆红素对照品适量，加水饱和的二氯甲烷制成每1ml含2mg的溶液，用紫外-可见分光光度计于300nm～500nm波长间扫描，结果在450±2nm处有最大吸收，与中国药典2010年版一部安宫牛黄丸含量测定所用的测定波长450nm一致,故选用450nm为检测波长，见图3。

7、流动相的选择

采用中国药典2010年版一部安宫牛黄丸项下的含量测定中所用的流动相为流动相。结果供试品色谱图中胆红素峰达到基线分离，峰形对称，保留时间适中，见图4。

8、色谱柱考察

①色谱柱的选择：参照中国药典2010年版一部安宫牛黄丸含量测定项下的方法；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

②不同色谱柱的考察：取批号为12070101的供试品，按含量测定方法测定胆红素的含量。分别用a：shim-packclc-ods(150mm×4.6mm，5μm)；b：ultimateaq-c18(250mm×4.6mm，5μm)；c：dikmadiamonsil(150mm×4.6mm，5μm)三种品牌的色谱柱测定。用三种品牌的色谱柱测定，结果无明显差异，胆红素含量测定的结果rsd为1.9％，见表7及图4。

表7不同色谱柱的测定结果

9、稳定性考察

取批号为12070101的供试品，按样品制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，在0h、3h、8h、16h、21h、25h时测定其峰面积，结果见表8。

表8稳定性实验测定结果

结果表明：样品在25小时内稳定。

10含量限度的制订

中国药典2010年版一部中―体外培育牛黄”的胆红素含量限度为―本品按干燥品计算，含胆红素(c33h36n4o6)不得少于35.0％”，水分限度均为不得过9.0％。所述浓缩活心丸中体外培育牛黄含量采用高效液相色谱法，中国药典2010年版一部中―体外培育牛黄”的胆红素含量测定方法为紫外—可见分光光度法，二者方法不具有可比性。

紫外—可见分光光度法的结果要高于高效液相色谱法，两种方法的差值在5～8％之间，以10％的差值计算，则采用高效液相色谱法，体外培育牛黄的胆红素含量限度为不得少于25.0％。则所述浓缩活心丸中胆红素理论含量限度应为每1g不少于15mg。考虑到原料来源及大生产等因素的影响，且胆红素易分解，以测得5批样品的平均值的75％制订含量限度。即―所述浓缩活心丸每1g含体外培育牛黄以胆红素(c33h36n4o6)计，不得少于5.5mg”。

综上所述，本发明浓缩活心丸中体外培育牛黄含量的检测方法具有准确度和重现性好、专属性强、稳定性佳的优点，能够有效的检测出浓缩活心丸中体外培育牛黄的含量，为浓缩活心丸的质量控制提供重要保障。以上通过实例和数据考察试验对本发明浓缩活心丸中体外培育牛黄含量的检测方法的具体内容进一步做了详细说明和方法验证，但不应将理解为本发明仅限于实例，因为根据上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可做出其他多种形式的修改、替换和变更，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明。