一种基于花粉的植物亲缘关系鉴定方法与流程

本发明属于植物鉴定技术领域，特别是涉及一种基于花粉的植物亲缘关系鉴定方法。

背景技术：

植物分类学是一门主要研究整个植物界的不同类群的起源，亲缘关系，以及进化发展规律的一门基础学科。也就是把纷繁复杂的植物界分门别类一直鉴别到种，并按系统排列起来，以便于人们认识和利用植物。

据不完全统计，生存在地球上的植物大约有50万种以上(种子植物250000种左右)。而关于植物的亲缘关系，迄今主要是从植物形态学与dna分子标记等方面开展研究。而从形态学入手，肉眼判断的误差太大，鉴定亲缘关系时效率与准确度不高，且对形态不完整甚至只有花粉样品的植物束手无策；而dna分子标记法可对两种植物的dna测序并对比，但这种方法显然过程繁琐且成本过高。

种子是种子植物的繁殖体系，尽多地保留了植物的遗传物质，但很多天然杂交或人工杂交育种的植物为三倍体植物，以石蒜属为例，它们正常开花但种子败育。故以植物花粉入手对于鉴定植物间的亲缘关系较为科学准确。

例如，cn107488712a公开了一种快速分析和检测小麦族植物染色体构型的多色原位杂交方法，该方法将mc-gish应用到花粉母细胞减数分裂过程中染色体配对行为的分析中，一次杂交即可有效鉴定小麦族不同基因组在减数分裂过程中的染色体配对情况，能够用于分析小麦族不同基因组之间的亲缘关系。然而该方法鉴定过程繁琐，成本过高，不利于大规模鉴定。

综上，本发明针对上述现有技术的缺陷及市场需求，开发出一种基于花粉的植物亲缘关系鉴定方法，该方法以电化学手段，通过简单易行的方法实现了植物亲缘关系的快速鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于花粉的植物亲缘关系鉴定方法。本发明具有鉴定过程简单易行，鉴定速度快，成本低等优点。

为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：

一种基于花粉的植物亲缘关系鉴定方法，包括如下步骤：

(1)将n种样品的植物花粉分别加入到m种不同溶剂中进行萃取，得到nm种花粉萃取液；其中，n≥2，m≥2。花粉粒没有特殊要求，完整程度越高越好；

(2)将所述nm种花粉萃取液分别和石墨烯分散液混合进行包埋，得到nm种包埋体系。在本发明中，所述石墨烯分散液的比表面积远远大于植物组织，能够实现对植物组织的包埋，形成均匀的分散液；

(3)将所述nm种包埋体系分别涂覆于丝网印刷电极表面，得到nm种修饰电极。所述涂覆的实施方式没有特殊要求，待溶剂自然蒸发完毕之后得到干燥的修饰电极；

(4)将所述nm种修饰电极各自分别置于磷酸缓冲液中进行脉冲伏安扫描，由nm种修饰电极各自得到的多回路电化学信号构建得到电化学图谱；

(5)比对同种溶剂中不同样品的电化学图谱的相似度，电化学图谱重合度越高，植物亲缘关系越近。

优选的，所述步骤(1)中样品的植物花粉粒数量与溶剂的体积之比为1:(30～200)μl。

优选的，所述步骤(1)中溶剂包括水、无水乙醇、甲醇、乙二醇、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)或正己烷中的一种。

优选的，所述步骤(2)石墨烯分散液的浓度为0.1～1mg/ml。

优选的，所述步骤(2)中花粉萃取液和石墨烯分散液的体积比为(50～120):(5～12)。

优选的，所述步骤(3)中每个丝网电极表面涂覆1～8μl的包埋体系。

优选的，所述步骤(4)磷酸缓冲液由磷酸二氢钾和磷酸二氢钠溶于水配制而成，其中磷酸二氢钾和磷酸二氢钠的浓度独立地为0.03～0.3mol/l。

优选的，所述步骤(4)中脉冲伏安扫描的扫描区间为1.2v～-0.2v；扫描速度为80～150mv/s；采样间隔为1～5mv。

本发明提供了一种以电化学分析为基础，以不同植物花粉为施行对象的植物亲缘关系分析方法。用不同溶剂萃取植物花粉得到不同提取物，将提取物修饰于电极表面，对修饰过的电极进行脉冲伏安扫描，把得到的电化学信号转化为电化学图谱，通过比较不同样品在同种溶剂中电化学图谱的相似度来判断两者的亲缘关系远近。本发明提供的鉴定方法简单易行，能快速鉴定形态相近植物的亲缘关系。

本发明具有的有益效果是：

1.本发明提出的整个分析过程无需昂贵试剂和仪器，大大降低了同属植物亲缘关系鉴别的成本。

2.利用植物花粉作为检测样品，极大地避免了因为生长环境所导致的植物组织成分差异。

3.本发明提出的植物亲缘分析方法可有潜力制作成微型试剂盒产品，具有实地检测的潜力。

附图说明

图1为中国石蒜、稻草石蒜、忽地笑、广西石蒜和玫瑰石蒜在乙二醇中的标准电化学图谱。

图2为中国石蒜、稻草石蒜、忽地笑、广西石蒜和玫瑰石蒜在水中的标准电化学图谱。

图3为长筒石蒜、黄长筒石蒜、香石蒜、红蓝石蒜和安徽石蒜在乙二醇中的标准电化学图谱。

图4为长筒石蒜、黄长筒石蒜、香石蒜、红蓝石蒜和安徽石蒜在水中的标准电化学图谱。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

实施例1：鉴别10种种名已知的石蒜属植物的亲缘关系。

(1)缓冲液的配制：

将磷酸二氢钾和磷酸氢二钠溶于水中配制磷酸缓冲液；磷酸二氢钾和磷酸二氢钠的浓度均为0.1mol/l；

(2)植物花粉萃取液制备：

在中国石蒜、稻草石蒜、忽地笑、广西石蒜、玫瑰石蒜、长筒石蒜、黄长筒石蒜、香石蒜、红蓝石蒜和安徽石蒜十个花粉样品中，各取两粒花粉粒分别加入到200μl乙二醇、200μl水中，充分振荡后，得到20份上述10种石蒜属花粉分别在水和甲醇中的花粉萃取液。

(3)石墨烯包埋：

取上述石蒜属的花粉萃取液100μl，各自独立地加入10μl石墨烯分散液中，迅速摇匀，使花粉萃取液充分包埋到石墨烯分散液中，得到20种石蒜属花粉的包埋体系。

(4)电极修饰：

取上述20种石蒜属花粉的包埋体系各2μl，各自独立地滴加于丝网印刷电极表面，待其自然干燥后得到20片滴加了不同包埋体系的修饰电极。

(5)电化学分析：

将20片修饰电极独立地分别置于磷酸缓冲液中形成回路，进行脉冲伏安扫描。其中，所述脉冲伏安扫描的扫描区间为1.2v～-0.2v；扫描速度为100mv/s；采样间隔为1mv。

每种石蒜属叶片均得到2组不同的电化学信号(以乙二醇萃取、以水萃取各一组)，分别构建样品的电化学图谱，得到电化学图谱，结果如附图1～4所示。

其中，图1、2以及图3、4对比可知，同种石蒜花粉在不同萃取液处理后得到的电化学图谱均不同。此外，由组图内不同种的石蒜电图谱对比可知，同种萃取液处理过后不同种石蒜花粉所能得到的电化学图谱相似而不相同，且亲缘关系越近的，电化学图谱重合度越大。例如从图1中可以看到玫瑰石蒜和稻草石蒜均在0.0-0.2v之间有两个电流峰，并在0.9v之间有一个电流峰，虽然峰高不同，但峰形相似。同时，在图2中可以看到玫瑰石蒜和稻草石蒜在0.25v左右处有一个电流峰。结合两图的结果，可以认为玫瑰石蒜和稻草石蒜的电化学活性物质类似，故彼此亲缘关系较近。再例如，图3中长筒石蒜和黄长筒石蒜在0-0.4v之间均有明显的电流峰，在0.8-1.0之间亦有明显的电流峰。同时，在图4中可以看到长筒石蒜和黄长筒石蒜在0.1-0.8v之间均有相似的电流峰。结合两图的结果，可以认为长筒石蒜和黄长筒石蒜的电化学活性物质类似，故彼此亲缘关系较近。

由以上实施例可知，本发明提供了一种以电化学分析为基础，以不同植物花粉为施行对象的植物亲缘关系分析方法。用不同溶剂萃取植物花粉得到不同提取物，将提取物修饰于电极表面，对修饰过的电极进行脉冲伏安扫描，把得到的电化学信号转化为电化学图谱，通过比较两个样品在同种溶剂中电化学图谱的相似度来判断两者的亲缘关系远近。本发明提供的鉴定方法简单易行，能快速鉴定形态相近植物的亲缘关系。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。