一种测定北芪菇中含硫氨基酸含量的方法与流程

本发明涉及北芪菇中氨基酸的提取与含量测定领域，尤其涉及一种测定北芪菇中含硫氨基酸含量的方法。

背景技术：

北芪菇，担子菌门下伞菌目侧耳属平菇，以北岳恒山正宗黄芪边角料和多种中草药及农作物副产品为培养料经多年培育而成的侧耳属平菇，是山西浑源富硒地区开发的新型食用菌。北芪菇中含有丰富的赖氨酸（1.19g/100g）和硒（0.54ppm/100g）可能与吡咯赖氨酸和l-硒代半胱氨酸或l-硒-甲基硒代半胱氨酸的生物合成存在着密切的关系，有望在抑制肿瘤、抗氧化、辅助治疗心血管疾病、解毒排毒等方面进行开发。根据相关部门的评测表明，北芪菇中氨基酸的含量占六分之一左右，其中人体所必需的8种氨共酸含量相对都比较高，是全能营养型的食用菌，其营养成份远超于普通平菇，含有较高的食用价值和药用价值。具有脱气排脓、补气固表、强身健体、保护肝脏、催乳、润肤等多种功能。

含硫氨基酸是由胱氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸三种氨基酸组成的，是人类和动物生长过程中所必需的基本氨基酸之一。北芪菇中大多数含硫氨基酸与很多有机质结合成复杂的超分子结构，并且以肽键相连结合于蛋白质中，所以需通过一定的手段将氨基酸水解至游离态。但是含硫氨基酸的-s-键在常规蛋白质水解过程中很容易被氧化破坏，很容易于发生氧化反应而影响后续的分析检測，进而不能准确的进行定量分析。

常用的水解方法为碱水解是样品用koh、naoh等在110℃下水解，但是少数氨基酸容易消旋，而半胱氨酸等氨基酸会被破坏。蛋白质酶水解是利用水解酶将蛋白质的肽键水解断裂开，生成短肽或氨基酸，但是水解时间比较长，且需要几种酶协同作用才能水解完全，否则水解不彻底，导致氨基酸含量测定出现严重偏差。还有一些测定方法，如：还原衍生法、氧化法等，但多数存在一些问题，且只能测定出两种含硫氨基酸中的其中一种。

为解决北芪菇中含硫氨基酸的含量测定易受到干扰、结果不可靠、试验条件复杂、成本高的问题，本发明提供了一种易于操作、对实验设备要求简单、且含量测定准确度高的北芪菇中含硫氨基酸的含量测定方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种测定北芪菇中含硫氨基酸含量的方法，用以克服上述技术缺陷。

本发明是通过如下技术方案来实现的：一种测定北芪菇中含硫氨基酸含量的方法，以北芪菇为原料，氧化水解，超滤离心处理后进行柱前衍生，其衍生物经过梯度洗脱，根据标准品的峰面积测得含硫氨基酸的含量，其中，以北芪菇为原料，粉碎筛选，经过过甲酸氧化保护，采用6mol/l的盐酸溶液进行酸水解，超滤离心，取上清液与衍生缓冲溶液混合，以2,4-二硝基氟苯为衍生试剂进行衍生，所得衍生物样液经高效液相色谱在体积比为1:1的乙腈-水和0.05mol/l乙酸钠为流动相，梯度洗脱，360nm波长下检测，对磺基丙氨酸衍生产物和蛋氨酸砜衍生产物进行分离，测定不同浓度梯度下胱氨酸标准品、蛋氨酸标准品的峰面积，绘制标准曲线，分别测得胱氨酸和蛋氨酸的含量，得到含硫氨基酸的含量。

进一步地，具体过程为：

步骤a，以北芪菇为原料，粉碎筛选，保存于-4℃冰箱备用；

步骤b，按体积比9:1将浓度为88％的甲酸溶液与30％的过氧化氢溶液混合形成过甲酸过氧化氢溶液；称取北芪菇40~60mg，置于烧杯中，添加过甲酸过氧化氢溶液，料液比为1:40，将该混合液放入冰水浴并一同放于冰箱中反应16h，加入偏重亚硫酸钠溶液终止剂，震荡摇匀，静置，得到氧化液备用；

步骤c，向上述氧化液中加入6mol/l盐酸溶液，密封试管，110℃鼓风干燥环境下水解22-24h；取部分氧化水解后的溶液进行10倍稀释，在双光束紫外可见分光光度计上扫描，获得氧化水解后样液的紫外光谱图；

步骤d，离心过滤，干燥，用超纯水将试管中的氨基酸样品溶出，定容，4000r/min离心5min，取上清液与衍生缓冲溶液混合，于容量瓶中定容，得到样品液待用；

步骤e，以2,4-二硝基氟苯为衍生试剂，样品液超滤后避光保存，加入衍生试剂，恒温水浴中反应1h，反应结束后待其降至常温，用平衡缓冲溶液定容，充分摇匀，静置备用，取部分衍生后的样液，在双光束紫外可见分光光度计上扫描，获得衍生样液的紫外光谱图；

步骤f，配置不同浓度梯度的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜标准品溶液，测定标准品的峰吸收面积，根据浓度和吸收面积的线性关系制得标准曲线；

衍生物样液经高效液相色谱在体积比为1:1的乙腈-水和0.05mol/l的乙酸钠为流动相，360nm波长下检测，梯度洗脱，对样液中磺基丙氨酸衍生产物和蛋氨酸砜衍生产物进行分离，分析样液中磺基丙氨酸衍生产物和蛋氨酸砜衍生产物的出峰时间和峰面积，结合标准曲线，分别测得胱氨酸和蛋氨酸的含量，得到含硫氨基酸的含量。

进一步的，测定过程中，乙酸钠为流动相a，乙腈-水为流动相b，ph为6.8，梯度洗脱程序为0～0.4min，84％a、16％b；0.4～4min，70％a、30％b；4～9.4min，64％a、36％b；9.4～17min，56％a、44％b；17～28min，36％a、64％b；28～34min，0％a、100％b；34～36min，0％a、100％b；36～38min，84％a、16％b。

与现有技术相比较本发明的有益效果在于：柱前衍生高效液相色谱法借助衍生试剂和氨基酸作用，从而生成特定的物质后，根据其转变后的特性进行色谱的分离测定，柱前衍生法对仪器的要求也很低，可以不必严格限制衍生化反应条件，可以允许较长的反应时间及使用各种形式的反应器，衍生的副产物可以降低干扰，任意选定衍生条件使衍生效果达到最佳。高效液相色谱法高效、准确、简便和价格低廉适用于氨基酸的分析，且其需要的样品量少，可回收，样品经过色谱柱后不被破坏，可进行单一成分的分析。高效液相色谱技术结合柱前衍生的方法高效，易操作，实验成本较低，测定结果精准，方法比较新颖，适用于很多物质的研究，适合北芪菇中含硫氨基酸的检测要求。

附图说明

图1为本发明的含量测定的流程图。

图2为蛋氨酸砜标准曲线。

图3为磺基丙氨酸标准曲线。

图4为北芪菇氧化水解后样液的紫外扫描图谱。

图5为正北芪氧化水解后样液的紫外扫描图谱。

图6为北芪菇衍生后样液的紫外扫描图谱。

图7为正北芪衍生后样液的紫外扫描图谱。

图8为北芪菇样液的高效液相色谱图。

图9为正北芪芪样液的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

一种测定北芪菇中含硫氨基酸含量的方法，以北芪菇为原料，氧化水解，超滤离心处理后进行柱前衍生，其衍生物经过梯度洗脱，根据标准品的峰面积测得含硫氨基酸的含量，其中，以北芪菇为原料，粉碎筛选，经过过甲酸氧化保护，采用6mol/l的盐酸溶液进行酸水解，超滤离心，取上清液与衍生缓冲溶液混合，以2,4-二硝基氟苯为衍生试剂进行衍生，所得衍生物样液经高效液相色谱在体积比为1:1的乙腈-水和0.05mol/l乙酸钠为流动相，梯度洗脱，360nm波长下检测，对磺基丙氨酸衍生产物和蛋氨酸砜衍生产物进行分离，测定不同浓度梯度下胱氨酸标准品、蛋氨酸标准品的峰面积，绘制标准曲线，分别测得胱氨酸和蛋氨酸的含量，得到含硫氨基酸的含量。

请参阅图1所示，具体过程为：

步骤a，以北芪菇为原料，粉碎筛选，保存于-4℃冰箱备用；

步骤b，按体积比9:1将浓度为88％的甲酸溶液与30％的过氧化氢溶液混合形成过甲酸过氧化氢溶液；称取北芪菇40~60mg，置于烧杯中，添加过甲酸过氧化氢溶液，料液比为1:40，将该混合液放入冰水浴并一同放于冰箱中反应16h，加入偏重亚硫酸钠溶液终止剂，震荡摇匀，静置，得到氧化液备用；

步骤c，向上述氧化液中加入6mol/l盐酸溶液，密封试管，110℃鼓风干燥环境下水解22-24h；取部分氧化水解后的溶液进行10倍稀释，在双光束紫外可见分光光度计上扫描，获得氧化水解后样液的紫外光谱图；

步骤d，离心过滤，干燥，用超纯水将试管中的氨基酸样品溶出，定容，4000r/min离心5min，取上清液与衍生缓冲溶液混合，于容量瓶中定容，得到样品液待用；

步骤e，以2,4-二硝基氟苯为衍生试剂，样品液超滤后避光保存，加入衍生试剂，恒温水浴中反应1h，反应结束后待其降至常温，用平衡缓冲溶液定容，充分摇匀，静置备用，取部分衍生后的样液，在双光束紫外可见分光光度计上扫描，获得衍生样液的紫外光谱图；

步骤f，配置不同浓度梯度的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜标准品溶液，测定标准品的峰吸收面积，根据浓度和吸收面积的线性关系制得标准曲线；

衍生物样液经高效液相色谱在体积比为1:1的乙腈-水和0.05mol/l的乙酸钠为流动相，360nm波长下检测，梯度洗脱，对样液中磺基丙氨酸衍生产物和蛋氨酸砜衍生产物进行分离，分析样液中磺基丙氨酸衍生产物和蛋氨酸砜衍生产物的出峰时间和峰面积，结合标准曲线，分别测得胱氨酸和蛋氨酸的含量，得到含硫氨基酸的含量。

下面通过实施例具体进行说明。

实施例

步骤a，预处理：

将北芪菇和正北芪，置于通风处阴干至材料发脆以后，放入电热鼓风干燥箱内烘干（40-50℃），用高速多功能粉碎机粉碎，过80目筛筛选，装入玻璃器皿中密封，保存于-4℃冰箱备用。

步骤b，过甲酸氧化：

将体积比为9∶1的88％甲酸溶液与30％过氧化氢溶液混合，常温下反应1h后放入冰水浴中降温冷却30分钟，现配现用，制得过甲酸过氧化氢溶液。分别准确称取北芪菇、正北芪样品各50mg，分别置于烧杯中，各添加过甲酸溶液2ml，放入冰水浴并一同放于冰箱中反应16h，进行氧化保护，选取偏重亚硫酸钠溶液作为氧化终止剂，加入0.5ml氧化终止剂，将其震荡摇匀，静置片刻，得到氧化液备用。

步骤c，酸水解：

向上述氧化液中加入18ml盐酸溶液（6mol/l），密封试管，置于110℃电热鼓风干燥箱中水解22-24h，取部分氧化水解后的溶液进行10倍稀释，在双光束紫外可见分光光度计上扫描，获得氧化水解后样液的紫外光谱图。

步骤d，离心过滤：

准确称取硼砂7.630g、硼酸1.240g，加入超纯水溶解，定容至500ml，充分摇匀后静置，得到衍生缓冲溶液备用；将氧化水解后的溶液进行干燥，用超纯水将试管中的氨基酸样品溶出，并定容至25ml，在高速离心机内4000r/min离心5min；取离心后的上清液与衍生缓冲溶液于25ml容量瓶中定容，得到样品液待用。

步骤e，柱前衍生：

准确称取磷酸氢二钠3.580g、磷酸二氢钾0.910g，加入超纯水溶解，定容至500ml，充分摇匀后静置，得到平衡缓冲溶液备用。取1ml2,4-二硝基氟苯溶于乙腈溶液中，定容于100ml容量瓶，得到衍生试剂备用。取10ml样品液经有机滤膜过滤后置于棕色容量瓶中避光保存，加入5ml衍生试剂，于60℃恒温水浴中反应1h，反应结束后待其降至常温，用平衡缓冲溶液定容，充分摇匀，静置片刻，备用。取部分衍生后的样液，在双光束紫外可见分光光度计上扫描，获得衍生样液的紫外光谱图。

步骤f，高效液相色谱法检测：

分别配置浓度为1µg/ml、5µg/ml、10µg/ml、15µg/ml的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜标准品溶液，用液相测定标准品的峰吸收面积，根据浓度和吸收面积的线性关系制得标准曲线。

用电子天平准确称量4.063g的乙酸钠和0.027g的乙酸于500ml的容量瓶中，加超纯水定容到刻度，充分摇匀，用高压真空泵抽滤，超声脱气20分钟后，得到为液相的流动相a为0.05mol/l的乙酸钠溶液。

将0.45µm有机滤膜用甲醇浸泡，0.20µm水膜用超纯水浸泡，浸泡时间为24h。将色谱甲醇、乙腈和超纯水分别用高压真空泵抽滤三次，放入超声震动仪中超声脱气20分钟后接入高效液相色谱仪。检查并打开电源、流动相正常后，依次打开自动进样器、柱温箱、高压泵、紫外检测器、色谱工作站，以甲醇：超纯水=9:1清洗机器30min以上，直至压力趋于稳定即可进样。

色谱分析条件如下：

色谱柱：c18，4µm，4.6mm×150mm（美国安捷伦）。流动相a为0.05mol/l乙酸钠，流动相b为乙腈-水（1:1，v/v)；ph6.8；梯度洗脱程序：0～0.4min，84％a、16％b；0.4～4min，70％a、30％b；4～9.4min，64％a、36％b；9.4～17min，56％a、44％b；17～28min，36％a、64％b；28～34min，0％a、100％b；34～36min，0％a、100％b；36～38min，84％a、16％b。检测波长为360nm，流速为1.2ml/min，进样量为20µl，柱温为31℃。观察并记录图谱。

测定结束后用甲醇：超纯水体积比例为1:9的液体清洗整个系统，流速为1ml/min，清洗1小时，其中超纯水是为了清洗本次实验给系统带进去的盐，少量的甲醇起到保护色谱柱的作用。再用9:1的甲醇：超纯水再次清洗，流速为1ml/min，清洗1小时后停泵，关闭色谱工作站，再依次关闭自动进样器、柱温箱、高压泵、紫外检测器，最后关机。

根据标准曲线分析胱氨酸和蛋氨酸含量。

结果分析：

1.含硫氨基酸标准品的标准曲线分析：

分别测定蛋氨酸砜标准品、磺基丙氨酸标准品在不同浓度下的峰面积，可得蛋氨酸的标准曲线如图2，磺基丙氨酸标准品如图3。相关系数分别为0.9998和0.9999，说明液相的色谱峰面积和物质的质量浓度回归性良好。

2.氧化水解后样液紫外扫描结果分析：

对氧化水解后的北芪菇样液和正北芪样液进行稀释，通过不断试验后得出稀释了10倍的样液在双光束紫外可见分光光度计上扫描的效果比较好，随后检测出紫外光谱图。观察图4、图5，发现扫描图谱结构很相似，二者含有相同的物质，可以初步推断磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的紫外吸收峰约在197nm左右。

3.柱前衍生后样液紫外扫描结果分析：

对衍生后的样液进行紫外扫描，获得衍生样液的紫外光谱图。如图6、图7所示，北芪菇和正北芪样液的衍生图谱中均出现了两个波峰，分别为192nm、238nm和193nm、237nm，而磺基丙氨酸、蛋氨酸砜衍生产物在240nm处有吸收峰存在。分析192nm处的物质为没有反应完的样液，238nm处的物质为衍生物。初步可以推断含有衍生物。

4.柱前衍生后高效液相检测结果分析：

北芪菇的含硫氨基酸含量分析：

根据图8显示，组分5为磺基丙氨酸衍生产物，峰面积为3832.91797mau*s，参考图2中胱氨酸标准品的线性关系，可得北芪菇中胱氨酸浓度为26.016µg/ml，分离度r为18.54，样液中磺基丙氨酸衍生产物得到完全分离，占总浓度的65.8153％。

组分7为蛋氨酸砜衍生产物，峰面积为1241.46899mau*s，参考图3蛋氨酸砜标准品的线性关系，可得北芪菇中蛋氨酸浓度为11.282µg/ml，分离度r为20.24，样液中蛋氨酸砜衍生产物得到完全分离，占总浓度的21.3273％。

正北芪的含硫氨基酸含量分析：

根据图9显示，组分6为磺基丙氨酸衍生产物，峰面积为2248.14380mau*s，参考图2中的线性关系，可得正北芪中胱氨酸浓度为15.279µg/ml，分离度r为1.05，样液中磺基丙氨酸衍生产物得到完全分离，占总浓度的41.8804％。

组分9为蛋氨酸砜衍生产物，峰面积为1764.52527mau*s，参考图3中线性关系，可得正北芪中蛋氨酸浓度为15.961µg/ml，分离度r为18.75，样液中蛋氨酸砜衍生产物得到完全分离，占总浓度的32.9218％。

结论：

本发明以过甲酸作氧化剂，以盐酸作水解剂，采用氧化水解处理北芪菇、正北芪，将蛋白质中的甲硫氨酸和半胱氨酸分别氧化保护为稳定的蛋氨酸砜和磺基丙氨酸，得到样品，然后以2,4-二硝基氟苯于暗处60℃水浴中反应60min，所得衍生物样液经高效液相色谱在体积比为1:1的乙腈-水和0.05mol/l乙酸钠为流动相，360nm波长下检测，梯度洗脱，对样液中磺基丙氨酸衍生产物和蛋氨酸砜衍生产物进行分离，通过对样液的分析得到磺基丙氨酸衍生产物和蛋氨酸砜衍生产物的出峰时间和峰面积，结合标准品的标准曲线，求得北芪菇中胱氨酸的含量26.016µg/ml，蛋氨酸的含量为11.282µg/ml，正北芪中胱氨酸的含量15.279µg/ml，蛋氨酸的含量为15.961µg/ml。对比可知，北芪菇作为以正北芪的下脚料制成配料培育出的食用菌，其胱氨酸含量高于正北芪，但蛋氨酸含量低于正北芪。总的来说，北芪菇中的含硫氨基酸含量高于正北芪。体现出北芪菇在含硫氨基酸上的生物富集作用，北芪菇内含正北芪的氨基酸成分，在生长发育过程中对含硫氨基酸有一定程度的富集。

本发明方法证实了北芪菇在生长发育过程中会对培养基中的含硫氨基酸起到一定的富集作用。由此看来，北芪菇有较高的生物学转化作用，作为经济型食用菌，拥有极高的营养价值和药用价值，值得广泛栽培。

本发明运用了氧化水解、2,4-二硝基氟苯作为衍生试剂进行柱前衍生辅助对含硫氨基酸的纯化与分离，操作简单，对仪器的要求也很低，具有广泛的适用性，具有很突出的优点，因此可以被广泛应用。高效液相色谱技术结合柱前衍生的方法实现了对北芪菇中含硫氨基酸的测定。通过实施例分析可表明，高效液相色谱技术结合柱前衍生的方法高效，易操作，实验成本较低，测定结果精准，方法新颖，合乎北芪菇中含硫氨基酸的检测要求，适用于很多物质的研究，应大力进行推广。