一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法与流程

本发明涉及一种光谱检测方法，具体是一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法。

背景技术：

胱氨酸(cystine，Cys) (C6H12N2O4S2，Mr=240.30)是两分子半胱氨酸经氧化得到的氨基酸，是一种含硫氨基酸，属于二硫化物类，学名“二(β-硫-α-氨基丙酸)”；是构成蛋白质的基本单位，广泛存在于头发、骨、角蛋白中，人发中的含量约为5％（以质量计），人体中的正常值为4.40～11.52μmol/L。

胱氨酸在医药上作为营养强化剂，有促进机体细胞氧化和还原功能，改善肝脏功能、促使白细胞增生等作用，并可中和毒素、阻止病原菌生长；由于胱氨酸在生理学研究中的重要性，是应用广泛的氨基酸类药物；胱氨酸片剂收载在《中华人民共和国药典》（2015年版）（二部）（化学药品1896），采用的是传统的溴酸钾滴定比色法，操作繁琐且误差较大；随着技术发展，相关仪器分析方法研究甚多，目前报道的有原子发射光谱法（ICP-AES ）、氨基酸分析仪测定法（AA）、高效液相色谱法（HPLC） 、分光光度法(UV)、高效毛细管电泳法(HPCE) 、电化学法（EC）、流动注射荧光光度法(FI-FL)、高效液相色谱－质谱法（HPLC-MS）等；这些方法常受到共存氨基酸的干扰，对非单一胱氨酸体系选择性不好；电化学分析法通常采用不同种类的氨基酸选择性电极对各种氨基酸进行测定；利用胱氨酸在电极上发生氧化反应时所呈现出的电活性，可不经衍生化处理，利用胱氨酸与金属离子配位反应可间接测定其含量，但是存在干扰较大的问题；高效液相色谱法特别是对柱前衍生-反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析方法更加灵敏（可测知<1pmol水平）和快速（完成一种蛋白质的水解、分离和测定只需12～30min）；但RP-HPLC要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物，因此，存在仪器设备昂贵，衍生化试剂较难选择且衍生化时间长衍生化产物组分复杂等问题；其他仪器分析方法均需通过显示剂对胱氨酸进行衍生化后间接测定，存在衍生化时间长、衍生化产物组分复杂和稳定性差等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法，该方法包括以下步骤：

步骤一：胱氨酸标准溶液的配制，用电子天平称取1.2015g的L-胱氨酸，用适量的氢氧化钠溶解，调节pH，并用蒸馏水定容至50mL的容量瓶中，配制成0.1mol∕L的溶液，之后可以根据需要将储备液进行稀释，临用配制作为操作液；

步骤二：称取0.6057g的三羟甲基氨基甲烷（Tris），用蒸馏水溶解并定容至50mL的容量瓶中，配制成0.1mol/L的溶液；将50mL0.1mol/L Tris溶液与7.0mL0.1mol/L的盐酸混匀并稀释至100mL，配制成0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液；

步骤三：荧光光谱的实验，准确移取1mL 0.1 mol/L胱氨酸标准溶液至10mL比色管中，加Tris-HCl缓冲溶液，再加蒸馏水定容L，摇匀，室温静置15 min；在水浴加热后，于Cary Eclipse 和F-7000荧光分光光度计上测量；设置各项荧光光谱测量参数如下：激发波长：410 nm；狭缝比5.0nm/5.0nm；发射光谱波长范围：415～700 nm；扫描速度：中速； 将反应后胱氨酸溶液在FLS920荧光光谱仪上测定其荧光量子产率，在FS5荧光光谱仪上测定荧光寿命；

步骤四：胱氨酸片样品的荧光光谱测定；准确移取市售胱氨酸片10片，用研钵研细，用电子天平准确称取0.1g，加到10mL洁净干燥的比色管中，加少量碱溶后加水定容超声溶解后，过滤；取1mL于10mL洁净干燥的比色管中，加的Tris-HCl缓冲溶液，再加蒸馏水定容，摇匀，室温静置15 min；水浴加热后，制成溶液；于荧光分光光度计上，设置狭缝5.0nm/5.0nm，最佳激发波长Ex=410nm，在415～700nm扫描范围内进行荧光光谱分析；同时用二次水进行空白实验。

作为本发明进一步的方案：所述Tris-HCl缓冲溶液的pH=8.9。

作为本发明再进一步的方案：所述Tris-HCl缓冲溶液用量为5mL。

所述水浴加热时间为12小时。

作为本发明再进一步的方案：所述水浴加热的加热温度为90℃。

作为本发明再进一步的方案：按实验方法中的步骤，取反应后碱性胱氨酸溶液于荧光分光光度计上连续测定标准溶液荧光9次，取其荧光强度计算其标准偏差为6.119，则RSD值为1.08%，偏差较小，说明该荧光体系有较好的精确性。

作为本发明再进一步的方案：所述荧光强度在一定范围内随着胱氨酸浓度的增加而增强，线性范围为1×10^-4mol/L -1×10^-3 mol/L，相关系数r=0.9927拟合的线性方程为：Y=-19.02+4.524×10⁴C(mol/L)；出限QL=3SD/K=4.0×10^-5mol/L，K为工作曲线的斜率。

作为本发明再进一步的方案：取1支25mL洁净干燥的比色管，按实验方法中的步骤，在水浴温度90℃下加热12小时，于2小时内在荧光分光光度计上每隔10min测定其荧光强度，结果表明，在后100min内荧光强度基本不变。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明精密度高，准确度好；反应条件温和，所用仪器成本较低；无需复杂前处理过程，操作过程简单，省时省力；所用溶剂简单易得，对操作人员伤害小，污染少。

附图说明

图1为一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法的胱氨酸荧光光谱图。

图2为一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法的荧光寿命图。

图3为一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法中不同pH值荧光强度的影响示意图。

图4、5为一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法的缓冲溶液的用量对荧光强度的影响示意图。

图6为一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法中加热时间对荧光强度的影响示意图。

图7、8为一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法的加热温度对荧光强度的影响示意图。

图9为一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法中体系的稳定性实验示意图。

图10、11为一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法的胱氨酸标准溶液的工作曲线示意图。

图12为一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法中胱氨酸片含量测定结果（n=6）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1～12，本发明实施例中，一种胱氨酸片中胱氨酸含量的直接荧光光谱检测方法，该方法包括以下步骤：

步骤一：胱氨酸标准溶液的配制，用电子天平称取1.2015g的L-胱氨酸，用适量的氢氧化钠溶解，调节pH，并用蒸馏水定容至50mL的容量瓶中，配制成0.1mol∕L的溶液，之后可以根据需要将储备液进行稀释，临用配制作为操作液；

步骤二：称取0.6057g的三羟甲基氨基甲烷（Tris），用蒸馏水溶解并定容至50mL的容量瓶中，配制成0.1mol/L的溶液；将50mL0.1mol/L Tris溶液与7.0mL0.1mol/L的盐酸混匀并稀释至100mL，配制成0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液；

步骤三：荧光光谱的实验，准确移取1mL 0.1 mol/L胱氨酸标准溶液至10mL比色管中，加Tris-HCl缓冲溶液，再加蒸馏水定容L，摇匀，室温静置15 min；在水浴加热后，于Cary Eclipse 和F-7000荧光分光光度计上测量；设置各项荧光光谱测量参数如下：激发波长：410 nm；狭缝比5.0nm/5.0nm；发射光谱波长范围：415～700 nm；扫描速度：中速； 将反应后胱氨酸溶液在FLS920荧光光谱仪上测定其荧光量子产率，在FS5荧光光谱仪上测定荧光寿命；

步骤四：胱氨酸片样品的荧光光谱测定；准确移取市售胱氨酸片10片，用研钵研细，用电子天平准确称取0.1g，加到10mL洁净干燥的比色管中，加少量碱溶后加水定容超声溶解后，过滤；取1mL于10mL洁净干燥的比色管中，加的Tris-HCl缓冲溶液，再加蒸馏水定容，摇匀，室温静置15 min；水浴加热后，制成溶液；于荧光分光光度计上，设置狭缝5.0nm/5.0nm，最佳激发波长Ex=410nm，在415～700nm扫描范围内进行荧光光谱分析；同时用二次水进行空白实验。

所述Tris-HCl缓冲溶液的pH=8.9。

所述Tris-HCl缓冲溶液用量为5mL。

所述水浴加热时间为12小时。

所述水浴加热的加热温度为90℃。

按实验方法中的步骤，取反应后碱性胱氨酸溶液于荧光分光光度计上连续测定标准溶液荧光9次，取其荧光强度计算其标准偏差为6.119，则RSD值为1.08%，偏差较小，说明该荧光体系有较好的精确性。

所述荧光强度在一定范围内随着胱氨酸浓度的增加而增强，线性范围为1×10^-4mol/L -1×10^-3 mol/L，相关系数r=0.9927拟合的线性方程为：Y=-19.02+4.524×10⁴C(mol/L)；出限QL=3SD/K=4.0×10^-5mol/L，K为工作曲线的斜率。

取1支25mL洁净干燥的比色管，按实验方法中的步骤，在水浴温度90℃下加热12小时，于2小时内在荧光分光光度计上每隔10min测定其荧光强度，结果表明，在后100min内荧光强度基本不变。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。