一种特异性识别及灵敏检测人血清蛋白的荧光试剂合成方法及应用与流程

发明涉及到一种荧光探针法测定人血清蛋白浓度及识别其与牛血清蛋白的方法，属于生物大分子含量及结构研究领域。

背景技术：

在临床诊断中，尿液中人血清蛋白的识别鉴定是肾脏疾病的早期信号，并且人血清中蛋白含量的不足也能预示提示肝功能的衰竭。除此之外，在生物化学或药理学应用领域，低成本的牛血清白蛋白(BSA)被广泛用来替代人血清白蛋白(HSA)。然而，牛血清白蛋白只有75.8％的生物功能与人血清白蛋白相似，是不能代替人血清蛋白去替换流体并帮助手术患者修复血容量的。因此，在治疗过程中区分人血清蛋白和牛血清蛋白，同时实现对蛋白含量的定量检测就显得尤为重要。目前，针对白蛋白检测的免疫化学方法层出不穷，但多数由于程序较为复杂且试剂和仪器较昂贵，不利于日常检测。而随着科学技术的发展，操作简单，灵敏度高且无破坏性的非共价荧光探针技术受到了广泛关注。

本文报道了一个合成简单，成本低廉的荧光探针，DB-15C5。DB-15C5具有典型的扭转的分子内电荷转移特征，因此在生理缓冲体系(PBS缓冲液)中几乎没有荧光，若一旦进入到HSA或者BSA结构中，就会发出绿色荧光，而对比其他几种蛋白并没有明显现象。DB-15C5与HSA结合后的荧光强度远远高于与BSA结合的荧光强度，紫外灯下照射就可以看出其区别，可以实现快速鉴别人血清蛋白和牛血清蛋白。荧光强度与HSA浓度之间存在很好的剂量关系，可以作为一种灵敏的HSA识别探针试剂，定量测定生理缓冲液以及人工尿液中血清蛋白的含量。探针试剂的浓度50μM，能对5μM的人血清蛋白进行识别。生理缓冲液中定量检测人血清蛋白范围0-5.6μM，最低检测限0.112mg/L；人工尿液中范围0.0-1.2μM，最低检测限1.95mg/L。此类方法较为直观，具有操作简单，灵敏度高和成本低廉等特点，值得推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种操作简单，灵敏度高和成本低廉的荧光探针法测定人血清蛋白浓度及鉴别其与牛血清蛋白。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

(1)合成荧光探针试剂DB-15C5：称量二苯氨基-4-苯甲醛0.27g(1mmol)，加入50毫升三颈瓶中，温度设定为85℃，加入无水乙醇，加热回流至刚好全溶。称量4-氨基苯并-15-冠-5-醚0.28g(1mmol)，加入无水乙醇溶解，缓慢滴加到醛溶液中，冷凝回流4h，反应完成后静置过夜，析出黄绿色晶体，过滤，真空干燥得到产物DB-15C5。

(2)荧光识别HSA测定方法：取DB-15C5母液10μL于石英荧光比色皿中，再加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2～7.4)，得到5.0×10^-5mol/L的待测液。加入蛋白储备液200μL，在荧光分光光度计上设置360nm为激发波长，磷酸盐缓冲液体系激发和发射狭缝调为2.5，5nm，人工尿液体系均为2.5nm。得到DB-15C5在不同蛋白存在时的荧光光谱。

(3)定量测定HSA含量：通过DB-15C5在不同浓度HSA存在时的荧光光谱，固定发射波长500nm，读取荧光强度，以荧光强度(I)对HSA浓度(C_HSA)作图，建立得到标准曲线。测定DB-15C5在未知样品中的荧光强度，通过标准曲线得到HSA含量。

所述荧光试剂DB-15C5的结构以核磁共振(NMR)谱以及质谱(MS)鉴定：¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ8.637(s,1H),7.720(d,J＝8.8Hz,2H),7.319(m,4H),7.154(m,8H),6.890(m,3H),4.191(m,4H),3.937(t,J＝4.8Hz,4H),3.772(s,8H).¹³C NMR(CDCl₃,100MHz):δ158.144,150.535,149.499,147.322,146.944,146.285,129.667,129.560,129.438,125.356,123.926,121.615,114.579,112.566,107.789,71.066,71.022,70.526,70.417,69.658,69.517,69.444,68.759.HRMScalcd for C₃₃H₃₄N₂O₅[M+Na]⁺561.2665,found 561.2665，产率33.4％，产品纯度95％以上。

所述的荧光测定时溶液配制缓冲液所用水均为二次蒸馏水或更高纯度的水。

所述的缓冲液为由NaCl 8g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄ 1.44g(如果是Na₂HPO₄·12H₂O，则3.63g)溶于1000mL水中配制而成。

所述的人工尿液由尿素1.02068g,乳酸0.0099088g,柠檬酸0.042028g,碳酸氢钠0.210025g,氯化钙0.027745g,氯化钠0.52596g,七水硫酸镁0.049294g,硫酸钠0.14204g,磷酸二氢钾0.095263g,磷酸氢二钾0.159754g,氯化铵0.133725g溶于100ml蒸馏水并调节pH为6.0配制而成。

根据权利要求1所述的DB-15C5溶液配制采用1％(v％)乙醇助溶。

所述的荧光光谱需要在荧光分光光度计上测试得到。

本发明将用于荧光鉴别HSA与其他蛋白，尤其是HSA与BSA，并可以定量检测HSA。

DB-15C5在生理缓冲液中的荧光强度非常微弱，一旦进入到HSA结构中，就会发出绿色荧光，而对比其他几种蛋白并没有明显现象。DB-15C5与HSA结合后的荧光强度远远高于与BSA结合的荧光强度，紫外灯下照射就可以看出其区别，可以实现快速鉴别人血清蛋白和牛血清蛋白。荧光强度与HSA浓度之间存在很好的剂量关系，可以作为一种灵敏的HSA识别探针试剂，定量检测HSA含量。此类鉴别方法较为直观，具有操作简单，灵敏度高和成本低廉等特点，值得推广。

附图说明

图1为检测试剂DB-15C5的合成路线。

图2为荧光试剂DB-15C5(50μM)在人工尿液中(左)、加入HSA(10μM)(中)、加入BSA(10μM)(右)体系中的荧光图。

图3为荧光试剂在PBS体系中对不同蛋白的荧光响应图谱(A)及在不同蛋白中的荧光强度(B)。

图4为PBS体系中DB-15C5在不同浓度HSA存在时的荧光光谱及标准曲线。

图5为荧光试剂在人工尿液中对不同蛋白的荧光响应图谱(A)及在不同蛋白中的荧光强度(B)。

图6为人工尿液体系中DB-15C5在不同浓度HSA存在时的荧光光谱及标准曲线。

图7为不同pH中，DB-15C5(50μM)和DB-15C5+HSA(5μM)的荧光强度。

图8为分子对接计算得到的DB-15C5与HSA结合能最低时的结合模式。

具体实施方式

下述试验和实例用于进一步说明但不限于本发明。

(1)在PBS介质中，DB-15C5用于鉴别HSA和BSA，方法如下：

称量DB-15C5 0.01345g，准确加入无水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇将母液稀释为1.0×10^-4mol/L溶液备用，用保鲜膜和锡箔纸包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同时，将人血清蛋白(HSA)以磷酸盐缓冲液配制成1.0×10^-4mol/L溶液备用。

取DB-15C5母液10μL于石英荧光比色皿中，再加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2～7.4)，得到5.0×10^-5mol/L的待测液。加入蛋白储备液200μL，在荧光分光光度计上设置360nm为激发波长。激发和发射狭缝调为2.5，5nm。在370～700nm范围进行扫描，得到DB-15C5在不同蛋白存在时的荧光光谱(图3)。

DB-15C5由于TICT性质，在PBS体系中几乎没有荧光，但是5μM的HSA的加入，可以迅速点亮化合物荧光，荧光强度增加了接近32倍，灵敏度较高。相比之下，DB-15C5在BSA体系中，荧光强度仅为前者的1/6，可以明显区分HSA与BSA。

(2)PBS介质中DB-15C5定量测定HSA含量，其方法如下：

称量DB-15C5 0.01345g，准确加入无水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇将母液稀释为1.0×10^-4mol/L溶液备用，用保鲜膜和锡箔纸包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同时，将人血清蛋白(HSA)以磷酸盐缓冲液配制成1.0×10^-4mol/L溶液备用。

取1.0×10^-4mol/L DB-15C5溶液40μL加入石英荧光比色皿中，加入960μL磷酸盐缓冲液混合均匀，依次加入HSA溶液(0～8.0μM)，在荧光分光光度计上设置360nm为激发波长，激发和发射狭缝调为5nm，10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到DB-15C5在不同浓度HSA存在时的荧光光谱(图4)。

读取DB-15C5在不同浓度HSA存在时、发射波长500nm的荧光强度，以荧光强度(I)对HSA浓度(C_HSA)作图，建立得到标准曲线(I＝191.6047+1152.3207C_HSA,R²＝0.9955)。线性范围0.0to 5.6μM，检测限1.7nM(0.112mg/L)。测定DB-15C5在样品中的荧光强度，通过标准曲线得到HSA含量。

(4)人工尿液介质中DB-15C5定量测定HSA含量，其方法如下：

称量DB-15C5 0.01345g，准确加入无水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇将母液稀释为1.0×10^-4mol/L溶液备用，用保鲜膜和锡箔纸包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同时，将人血清蛋白(HSA)以磷酸盐缓冲液配制成1.0×10^-4mol/L溶液备用。

取DB-15C5母液10μL于石英荧光比色皿中，再加入1mL人工尿液(pH 6.0)，得到5.0×10-5mol/L的待测液。加入蛋白储备液200μL，在荧光分光光度计上设置360nm为激发波长。激发和发射狭缝调均为2.5nm。在370～700nm范围进行扫描，得到DB-15C5在不同蛋白存在时的荧光光谱(图5)。

DB-15C5由于TICT性质，在尿液中几乎没有荧光，但是5μM的HSA的加入，可以迅速点亮化合物荧光，荧光强度增加了接近32倍，灵敏度较高。除此之外，DB-15C5也有较好的选择性，我们一共测试了八种蛋白的荧光响应图谱，发现HSA，BSA，酪蛋白能够点亮化合物荧光，但是在HSA中荧光明显比后两者强。说明DB-15C5可以实现人工尿液中的HSA识别。

(5)人工尿液中DB-15C5定量测定HSA含量，其方法如下：

称量DB-15C5 0.01345g，准确加入无水乙醇5mL，得到5.0×10^-3mol/L的母液。用乙醇将母液稀释为1.0×10^-4mol/L溶液备用，用保鲜膜和锡箔纸包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存。同时，将人血清蛋白(HSA)以磷酸盐缓冲液配制成1.0×10^-4mol/L溶液备用。

取1.0×10^-4mol/L DB-15C5溶液40μL加入石英荧光比色皿中，加入960μL人工尿液混合均匀，依次加入HSA溶液(0.0–1.2μM)，在荧光分光光度计上设置360nm为激发波长，激发和发射狭缝调为5，10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到DB-15C5在不同浓度HSA存在时的荧光光谱(图6)。

读取DB-15C5在不同浓度HSA存在时、发射波长500nm的荧光强度，以荧光强度(I)对HSA浓度(C_HSA)作图，建立得到标准曲线(I＝1166.0110+1845.8791C_HSA,R²＝0.9954)，检测限：29.5nM(1.95mg L^-1)。测定DB-15C5在样品中的荧光强度，通过标准曲线得到HSA含量，将计算得到的含量值与实际加入值相比较，得到回收率(表1)，判断方法可行。

表1.标准加入法测定结果

(4)pH对检测体系影响小

检测体系较为稳定。由图7看出，在不同pH条件下，体系的荧光强度值变化不大，尤其是在pH 6-10之间，体系荧光强度稳定，因此，在生理环境及产生异样的情况下，HSA含量检测不受影响。

(5)DB-15C5对HSA产生特异性识别的工作原理

借助分子对接理论模拟，得出DB-15C5与HSA产生结合的位点。如图8所示，DB-15C5可以进入到HSA位于subdomains IIA(Sudlow site I)和IIIA(Sudlow site II)的α-螺旋区域，结合自由能达到-10.47kcal/mol。结合中冠醚基团与组氨酸His242残基之间有氢键作用力表明冠醚基团在识别过程中发挥重要作用。