一种高通量兽药残留检测的蛋白质抗体芯片及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，本发明更具体涉及了一种高通量兽药残留检测的蛋白质抗体芯片及其应用。

背景技术：

食品安全是关系到国泰民安的生计大事。近年来食品安全事件频频爆出，抗生素乱用现象比比皆是，人们通过食入含有兽药残留的食品，严重影响身体健康。因此，我国从立法层面上狠抓食品安全，其中，兽药残留就是食品中必须遏制的。而当前我们国家对食品中药物残留的检测大都是单项检测，因此，提供一种高通量检测的先进技术方法是检测领域迫切所求。

本项发明专利所涉及的食品中兽药残留的检测，将实现微量的进样量大规模高通量的筛选，大大提高了食品检测的效率，避开现有ELISA和胶体金一次只能检测一种兽药的弊端，可节约生产成本，为客户提供更加快捷、准确的检测，将成倍提高工作效率。在节能减排环境污染方面，该检测方法只用到微量的缓冲体系，避免了现有的LC-MS\MS、GC-MS\MS等仪器设备所必需使用的有毒试剂如乙腈、正己烷等，对我国的环境起到了充分的保护作用。用蛋白质芯片检测食品中的兽药残留的应用，迄今尚无文献报道。因此，研制一种高通量兽药残留检测的蛋白质抗体芯片具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明提供一种适用于高通量兽药残留检测的蛋白质抗体芯片及其应用。即采用双抗夹心法，把多种兽药的特异性抗体薄层以微阵列的形式，均匀固定在固相载体表面上，待测样品中的抗原与固定在载体上的蛋白质结合的同时，也结合经过荧光标记后的特异性靶向抗体，根据荧光强弱程度判别阳性结果。本发明所述蛋白质抗体芯片技术能够实现食品中兽药残留高通量检测应用。该蛋白质抗体芯片，无毒无害无污染，把原本单一检测的兽药方法集成在一块芯片上，大大提高了效率，具有显著的社会和经济效益。

为实现此目的，本发明采用如下技术方案：

一种高通量兽药残留检测的蛋白质抗体芯片，采用双抗夹心法，把多种兽药的特异性抗体薄层以微阵列的形式，均匀固定在固相载体表面上，制备获得蛋白质抗体芯片。

所述特异性抗体是兽药抗原的特异性靶向抗体。所述特异性靶向抗体是兽药抗原的经过荧光素、同位素标记的特异性靶向抗体。

所述的蛋白质芯片为抗体芯片，所述的兽药残留包括但不限于氯霉素、土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、孔雀石绿、结晶紫、阿莫西林、庆大霉素、头孢拉定、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、磺胺类等。

所述的蛋白质芯片涉及的特异性抗体是兽药抗原的特异性靶向抗体；这些抗体包括但不限于氯霉素、土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、孔雀石绿、结晶紫、阿莫西林、庆大霉素、头孢拉定、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、磺胺类等兽药的特异性结合位点的抗体。

所述的蛋白质芯片涉及的固相载体是经过活化处理的载玻片、醋酸纤维膜或硝酸纤维膜。而玻璃片因为其来源简便、低价、稳定性好、惰性好等优点，被选作为抗体固定载体。该载玻片先用N，N-二乙氧基氨丙基三乙氧基硅烷做表面处理，再用多聚赖氨酸、氨基修饰，偶联多种兽药的特异性抗体分子基团，使其固定在玻璃载体的表面上。

所述的蛋白质芯片涉及的特异性靶向抗体是兽药抗原的经过荧光素、同位素标记的特异性靶向抗体。

所述的兽药残留检测蛋白质抗体芯片主要用于对食品中是否含有各种兽药的高通量检测，包括但不限于氯霉素、土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、孔雀石绿、结晶紫、阿莫西林、庆大霉素、头孢拉定、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、磺胺类等兽药的检测应用。

一种高通量兽药残留检测的蛋白质抗体芯片的制备，其具体制备步骤如下：

1）把醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜或载玻片进行活化处理；

2）把兽药特异性抗体固定在醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜或载玻片上；

3）将待测样品置于上述载体上，放置于封闭杂交盒里，温度37℃，湿度35%，温育，时间1-3h，把未结合样品洗去；

4）把经过荧光标记的酶放置于封闭杂交盒里，温度37℃，湿度35%，温育，时间1-3h，把未结合样品洗去；

5）把反应过的芯片放置到成像系统读片，根据荧光强弱程度判别阳性结果。

本发明的显著优点是：

1）高通量：多重采样，在单一芯片上多指标并行分析；

2）快速精确：多指数测定结果以更准确的诊断；

3）微型化：进样量只需要几微升；

4）高度集成：生物芯片及相关仪器集成的免疫反应，检测和结果分析于一身，建立一个新的检测平台；

5）信息化：数据结果易于检索；

6）升级潜力巨大：易于增加新检测项目。

7） 成本低：小型化可节省材料、能源、人力资源等生产成本。

附图说明

图1 兽药残留检测蛋白质芯片的制备模式。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

采用玻璃片作为固相载体，即采用载玻片：首先，用N，N-二乙氧基氨丙基三乙氧基硅烷对载玻片表面进行处理，用多聚赖氨酸进行修饰，把兽药（氯霉素、土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、孔雀石绿、结晶紫、阿莫西林、庆大霉素、头孢拉定、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、磺胺类）的特异性抗体标记，应用点样仪，每类抗体点样1 nl，即把抗体固定在该载玻片上，即得本发明所述的兽药残留蛋白质检测芯片。如图1所示。

1：氯霉素，2：土霉素，3：四环素，4：金霉素，5：强力霉素，6：呋喃唑酮，7：呋喃西林，8：呋喃妥因，9：呋喃它酮，10：孔雀石绿，11：结晶紫，12：阿莫西林，13：庆大霉素，14：头孢拉定，15：环丙沙星，16：氧氟沙星，17：诺氟沙星，18：磺胺类，19：预留检测项目，20：预留检测项目，21：预留检测项目，22：预留检测项目，23：预留检测项目，24：预留检测项目。

实施例2

取新鲜鱼肉5g，绞碎，匀浆，加入“兽药残留检测试剂盒” (福建蓝昊生物科技有限公司提供)的提取剂1，提取兽药，再加入提取剂2净化，离心，取上清液为待测样品；吸取待测样品置于上述载玻片上，放置于封闭杂交盒里，温度37℃，湿度35%，温育，时间1小时，把未结合样品洗去；把经过荧光标记的酶放置于封闭杂交盒里，温度37℃，湿度35%，温育，时间1-3小时，把未结合样品洗去；把反应过的芯片放置到成像系统读片。