一种受激辐射损耗方法、超分辨成像方法及显微成像装置与流程

本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种实现双近红外波长激励稀土掺杂上转换纳米材料的受激辐射发光损耗方法，以及利用上述发光损耗方法的超分辨成像方法及显微成像装置。

背景技术：

在常规的光学成像过程中，根据阿贝原则，光学系统所能够达到的极限分辨率大小约为入射光波长的一半。为了提高分辨率，科学家们提出了许多种突破衍射极限的方法，统称为超分辨成像方法。其中一种重要方法就是受激辐射损耗术(Stimulated Emission Depletion,STED)。STED超分辨显微技术需同时使用两束激光，即用于激发纳米探针发射荧光的激发光束，以及用于将激发光斑外围荧光强行淬灭的空心光束。在传统STED技术中，通过受激辐射的方法，位于激发光斑外围的染料发光能级粒子数被损耗激光大量消耗，从而达到损耗外围荧光发光，缩小光斑尺寸，提高分辨率的目的。相比较其他的超分辨成像方法，STED不仅可以达到纳米级的分辨率，并且能够实现视频速度的快速成像，因此成为了生物、医学研究中的一种重要方法。不仅如此，结合双光子激励(Two-Photon Excited,TPE)方法，TPE-STED方法将激发波长从紫外、可见波段转移到近红外波段，极大降低激光对生物组织损伤的同时，也显著地提高了成像深度。

但就目前而言，STED技术在深度组织超分辨成像中仍然面临一定的限制和挑战，主要体现在：(1)损耗激光仍然位于可见光波段，在生物组织中散射严重，在较大的深度中很难达到理想的损耗效果。(2)基于STED原理的损耗光功率较大，会对生物组织造成严重的热损伤。(3)目前常用的STED荧光发光染料普遍存在光漂白或者光闪烁的问题，达不到足够的光稳定性，不能满足长时间成像的需要。(4)成像所使用的光源为高功率飞秒光源，价格昂贵且光学系统复杂，难以推广。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种双近红外激励受激辐射损耗方法，该方法突破传统受激辐射发光损耗的局限，使用稀土掺杂上转换纳米材料作为STED纳米探针，通过对上转换过程中涉及的一个或多个能级进行受激辐射激励，实现对上转换纳米材料发光的高效率光控损耗。使用稀土掺杂上转换纳米材料作为STED纳米探针可以将发光损耗波长从可见光波段移至红外波段，从而解决了现有技术中损耗光的散射问题，打破了传统多光子STED技术的深度限制，同时，稀土掺杂上转换纳米材料无光漂白、光闪烁，可实现无限长时间的实时成像，具有传统STED染料所不具备的光稳定性。

本发明的另一个目的在于提供一种基于上述受激辐射损耗方法的超分辨成像方法，该方法结合了多光子超分辨技术及上转换纳米材料本身的优点，使得激发波长和损耗波长都位于近红外波段，解决了深度组织超分辨成像中损耗波长散射严重的问题，从而确保在较大深度的成像中也可以实现超分辨成像，上转换纳米材料无光漂白、光闪烁的特性为长时间稳定成像提供了保证。

本发明的另一个目的在于提供一种基于上述超分辨成像方法的显微成像装置，该装置中的激发光和损耗光都可用连续光激光器，具有成本低的优点。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种受激辐射损耗方法，包括以下步骤：

(1)利用近红外激发光激发稀土掺杂上转换纳米材料产生上转换发光；所述稀土掺杂上转换纳米材料中的稀土离子按照功能不同分为敏化剂、激活剂；

(2)增加一束近红外损耗激光激励样品材料，这束近红外损耗激光通过引起受激辐射过程，将激活剂中涉及上转换过程的特定能级的电子强迫跃迁至低能级，并辐射光子，近红外损耗激光的波长与受激辐射上下能级的能量间隙匹配；

(3)上一步骤发生的受激辐射过程根据损耗路径的不同，会直接或间接地损耗发光能级粒子数，从而实现对发光能级发光的损耗。

优选的，步骤(2)中所述涉及上转换过程的特定能级包括激活剂中的发光能级、上转换过程中的中间亚稳态能级或能量转移上转换能级。

优选的，步骤(1)中，所述稀土掺杂上转换纳米材料是一种在纳米晶体中掺杂稀土离子的复合型纳米材料，所述纳米晶体采用氟化物或者氧化物，以纳米晶体作为基质，在其中掺杂一种或多种镧系稀土元素离子；

步骤(1)中，所述稀土掺杂上转换纳米材料基于稀土离子丰富的实能级，其敏化剂通过基态吸收对近红外激发光进行吸收后，通过能量传递上转换、激发态吸收将能量传递给激活剂，再由激活剂通过上转换过程发射出紫外、可见或是近红外波段的光，即激发出上转换发光。

优选的，所述敏化剂、激活剂的具体功能如下：

A：在第一激光器激发下，敏化剂吸收单个激发光的光子并将能量传递给激活剂；

B：激活剂吸收一个或多个敏化剂传递的能量后发生上转换过程并发射出上转换发光；

C：在第二激光器激励下，激活剂中一个或多个涉及上转换过程的特定能级的粒子通过受激辐射过程被大量消耗，导致发光能级粒子数急剧下降，上转换发光得到损耗；

所述近红外激发光与近红外损耗激光的波长波段均位于760nm-2000nm之间。

一种基于上述受激辐射损耗方法的超分辨成像方法，包括以下步骤：

在一路，第一激光器发出一束稳定的近红外波长激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波处理后，获得聚焦的高斯型实心光斑；

同时在另一路，第二激光器产生稳定的近红外波长激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，获得受激辐射损耗光斑；第二激光器产生的近红外波长激光的波长能量与激活剂中受激辐射过程上下能级的能量间隙相匹配；

所述聚焦的高斯型实心光斑与所述受激辐射损耗光斑在空间上进行共轴耦合，聚焦的高斯型实心光斑激发稀土掺杂上转换纳米材料产生上转换发光，受激辐射损耗光斑通过引起受激辐射过程，使激活剂中一个或多个涉及上转换过程的特定能级的粒子大量损耗，发光能级粒子数因此急剧下降，实现对发光能级所产生发光的损耗；

收集稀土掺杂上转换纳米材料在上述双光束共轴耦合聚焦光斑作用下发出的光，利用光电探测器检测上述超分辨上转换发光信号，进行XYZ方向扫描，得到荧光成像图片。

一种基于上述超分辨成像方法的显微成像装置，包括激发光生成模块、损耗光生成模块、偏振分光棱镜、多光子显微扫描模块和光电探测模块，所述激发光生成模块用于生成用作近红外激发光的近红外稳态激光束，所述损耗光生成模块用于生成用作近红外损耗激光的近红外空心光束；所述偏振分光棱镜将互相垂直的近红外稳态激光束与近红外空心光束在空间上共轭耦合成一束耦合激光束，该耦合激光束通过多光子显微扫描模块聚焦在载物台上标记了稀土掺杂上转换纳米材料的样品上；光电探测模块用于检测上述样品被激发的超分辨上转换发光信号。

具体的，所述激发光生成模块包括第一近红外连续激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第一滤光片、第一准直扩束镜、第一二分之一波片、第一偏振片，所述第一近红外连续激光器发出的激光束经过第一滤光片、第一准直扩束镜后处理成为一束平行光束，然后利用第一偏振片及第一二分之一波片调节其功率，该光束的波长与稀土掺杂上转换纳米材料的激发波长相匹配。

具体的，所述损耗光生成模块包括第二近红外连续激光器，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第二滤光片、第二准直扩束镜、第二二分之一波片、第二偏振片、空间相位调制板，所述第二近红外连续激光器发出的激光束经过第二滤光片、第二准直扩束镜后处理成为一束平行光束，然后利用第二偏振片及第二二分之一波片调节其功率，然后通过空间相位调制板调制成空心光束，该光束的波长与稀土掺杂上转换纳米材料的激活剂中受激辐射过程上下能级的能量间隙匹配。

具体的，所述多光子显微扫描模块包括沿耦合激光束前进方向依次放置的扫描振镜、高反低透二向色镜和物镜，耦合激光束经过扫描振镜、高反低透二向色镜(反射近红外激发光及近红外损耗激光，透射样品荧光)后被物镜聚焦，所述载物台上的样品放置在物镜的焦面上。

具体的，所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器，聚焦透镜和光电探测器设置在沿耦合激光束前进方向的反方向上，所述光电探测器与外部计算机链连接，稀土掺杂上转换纳米材料标记的样品在近红外损耗激光的激发下发射沿各个方向上的超分辨上转换发光，一部分荧光信号被物镜收集，经过高反低透二向色镜、聚焦透镜后由光电探测器接收。

优选的，所述扫描振镜设置在一旋转装置上，旋转装置由一计算机控制，该计算机与光电探测器连接。在光电探测器接受完一次检测的信号后，就发送信号到计算机，然后该计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，利用聚焦光斑扫描样品的方式获得一幅二维激光扫描荧光图像。

更进一步的，所述载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机。通过该电机，结合旋转装置可以获得三维激光扫描荧光图像。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、与传统的多光子STED技术相比，本发明使用红外波段激光作为损耗光。在较大深度(400微米)的生物体组织中，传统STED技术的可见光波段损耗光散射严重，不能很好地穿透生物组织，严重影响多光子STED技术在深度成像上的表现。与此相比，红外波段的损耗光在生物组织中散射较小，具有较大的穿透深度。本发明可以解决损耗光的散射问题，打破传统多光子STED技术的深度限制。

2、本发明的激发光、损耗激光、上转换发光的波长无光谱重叠，间隔大，上转换荧光光谱不被过滤即可实现全光谱检测，提高灵敏度。滤光片二色镜的自由度大、性能要求低、成本低。

3、与传统的多光子STED技术相比，本发明的激发光和损耗光都可用连续激光器，价格低易产业化。同时，本发明的显微成像系统不需要对激发光和损耗光在时间上进行控制，极大地降低了成像系统的复杂度，为推广多光子超分辨技术及其对应的研究具有重要的作用。

4、本发明所使用的STED纳米探针为稀土掺杂上转换纳米材料，具有无光漂白，无光闪烁，超低背景荧光发光等优良特性。本发明结合了这种材料的光学优势，有利于在超分辨成像中实现无限长时间的实时成像。

5、与其他基于上转换纳米材料作为STED纳米探针的发光损耗方法相比，本发明通过近红外光激励上转换纳米材料受激辐射的方式实现了极高效率的光控损耗，对STED技术的发展与改良具有重要的价值，同时揭示了稀土掺杂上转换纳米材料作为新型STED发光染料应用的无限前景。

附图说明

图1为实施例1受激辐射损耗方法在发光能级的原理示意图。

图2为实施例1受激辐射损耗方法在中间亚稳态能级的原理示意图。

图3为实施例1受激辐射损耗方法在能量传递上转换能级的原理示意图。

图4为本发明实施例1中NaYF₄:18％Yb³⁺/8％Tm³⁺的发光原理图。

图5为本实施例1中获得的材料发射光谱及损耗光谱。

图6为本实施例1中材料NaYF₄:18％Yb³⁺/8％Tm³⁺的透射电镜图。

图7为本发明实施例3显微成像装置的结构示意图。

图7中：1—第一近红外连续激光器、2—第一滤光片、3—第一准直扩束镜(包括第一小孔光阑)、4—第一二分之一波片、5—第一偏振片、6—偏振分光棱镜、7-第二近红外连续激光器、8—第二滤光片、9—第二准直扩束镜(包括第二小孔光阑)、10—第二二分之一波片、11—第二偏振片、12—空间相位调制板、13—反射镜、14—扫描振镜、15—高反低透二向色镜、16—物镜、17—稀土掺杂上转换纳米材料或其标记样品、18—聚焦透镜、19—光电探测器。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

参见图1、图2、图3，本实施例受激辐射损耗方法中采用的近红外激发光与近红外损耗激光的波长波段均位于760nm-2000nm之间，分别用于激发和损耗稀土掺杂上转换纳米材料。稀土掺杂上转换纳米材料是一种在纳米晶体中掺杂稀土离子的复合型纳米材料，纳米晶体采用氟化物或者氧化物，以纳米晶体作为基质，在其中掺杂一种或多种镧系稀土元素离子。稀土掺杂上转换纳米材料中的稀土离子按照功能不同分为敏化剂和激活剂，所述稀土离子中敏化剂、激活剂的具体功能如下：

A：在第一激光器激发下，敏化剂吸收单个激发光的光子并将能量传递给激活剂；

B：激活剂吸收一个或多个敏化剂传递的能量后发生上转换过程并发射出上转换发光；

C：在第二激光器激励下，激活剂中一个或多个涉及上转换过程的特定能级的粒子通过受激辐射过程被大量消耗，导致发光能级粒子数急剧下降，上转换发光得到损耗。

一种受激辐射损耗方法，步骤如下：

(1)利用近红外激发光激发稀土掺杂上转换纳米材料，其敏化剂通过基态吸收过程(Ground State Absorption，GSA)吸收近红外激发光，并通过能量传递上转换过程(Energy Transfer Upconversion，ETU)将能量传递给激活剂。激活剂的电子得到能量后通过上转换过程跃迁至高能级，随后辐射出紫外、可见或是近红外波段的光，即激发出上转换发光。

(2)增加一束近红外损耗激光激励样品材料，这束近红外损耗激光的波长与激活剂中受激辐射过程上下能级的能量间隙匹配，通过引起受激辐射过程，将激活剂中的发光能级(图1)、上转换过程中的中间亚稳态能级(图2)或能量传递上转换能级(图3)的电子强迫跃迁至低能级，并辐射光子；

(3)上一步骤发生的三种受激辐射情况均会直接或间接地损耗发光能级粒子数，从而实现对发光能级发光的损耗。

如图4所示，基于上转换NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺在980nm连续光激发下所发455nm蓝光可以被810nm连续光所损耗。在本实施例中，Yb³⁺作为敏化剂，Tm³⁺充当激活剂。

具体实施过程如下：在980nm激光激发下，Yb³⁺通过基态吸收GSA过程吸收980nm光子，基态的电子跃迁至能级F_5/2，获得能量的Yb³⁺通过能量传递上转换ETU把能量传递给Tm³⁺，Tm³⁺中的电子得到能量，经过了三次上转换跃迁过程：H₆→H₅→F₄→F₂→F₃→H₄→G₄，随后，通过能量传递上转换过程G₄+H₄→F₄+D₂与H₄+G₄→F₄+D₂，电子跃迁至发光能级D₂。D₂能级电子通过自发辐射跃迁至F₄能级，同时发射四光子455nm蓝光。

810nm损耗光的加入使发光能级D₂粒子发生受激辐射，辐射光子的同时跃迁至低能级F₂；使能量传递上转换能级G₄粒子发生受激辐射，辐射光子的同时跃迁至低能级H₅；使能量传递上转换能级H₄粒子发生受激辐射，辐射光子的同时跃迁至低能级H₆；第一种情况直接影响发光能级D₂粒子数，后两种情况间接影响发光能级D₂粒子数，均使D₂能级粒子数急剧下降，从而达到损耗455nm蓝光的目的。

本实施例中的发光损耗结果如图5所示。在980nm激光激发下，材料NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺发出强烈的455nm蓝光。在增加了810nm损耗激光后，材料的蓝光发光被急剧损耗，光控损耗效率超过90％。从光谱上看，上转换发光的波长与激发光、损耗光无光谱重叠，间隔大，亦有利于光谱检测的进行。

本实施例使用稀土掺杂上转换纳米材料代替传统STED染料，利用双近红外光激发材料受激辐射实现高光控损耗效率，且材料荧光发光无光漂白，光闪烁，这在国际范围内尚属首次。图6展示了此上转换纳米材料的形状、大小等性质，其颗粒平均直径为20nm，说明本纳米材料非常适合作为荧光标记物并应用于多种场合的生物成像中。

实施例2

本实施例除下述特征外其他结构同实施例1：

基于实施例1中的受激辐射损耗方法，同样基于上转换纳米材料NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺在980nm激发下所发455nm蓝光可以被810nm光所损耗。本实施例提供了一种超分辨成像方法，该方法包括：

在一路，利用波长为980nm的连续激光器发出一稳定的近红外波长激光，作为激发光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波处理后，获得聚焦的高斯型实心光斑；

同时在另一路，利用波长为810nm的连续激光器产生稳定的近红外波长激光作为近红外损耗激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波后，经过对应810nm波长的空间相位调制板调制并形成空心光束，获得受激辐射损耗光斑；所述近红外损耗激光的波长符合Tm³⁺中三种受激辐射情况：D₂→F₂、G₄→H₅、H₄→H₆上下能级的能量间隙；

所述980nm聚焦实心光斑与所述810nm受激辐射损耗光斑空间上进行共轴耦合，980nm聚焦实心光斑激发NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺稀土掺杂上转换纳米材料产生上转换发光，其中包括455nm的蓝光。810nm的受激辐射损耗光斑通过引起受激辐射过程，将激发光斑外围荧光强行淬灭，具体地，损耗光将Tm³⁺中D₂、G₄、H₄三个能级的粒子强行跃迁至低能级，直接或间接地降低D₂能级的粒子数，从而实现D₂能级455nm蓝色发光的损耗；

收集NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺材料在上述双光共轴耦合聚焦光斑作用下发出的光信号，利用光电探测器进行XYZ方向扫描检测，得到荧光成像图片。

实施例3

基于实施例2中的超分辨成像方法，本实施例提供了一种显微成像装置，该装置的结构参见图7，包括：激发光生成模块、损耗光生成模块、偏振分光镜、多光子显微扫描模块和光电探测模块。所述偏振分光棱镜将互相垂直的近红外稳态激光束与近红外空心光束在空间上共轭耦合成一束耦合激光束，该耦合激光束通过多光子显微扫描模块聚焦在载物台上标记了稀土掺杂上转换纳米材料的样品上；光电探测模块用于检测上述样品被激发的超分辨上转换发光信号。

本实施例采用实施例1中的NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺作为上转换发光标记物。采用中心波长为980nm的第一近红外连续激光器1，其发出的激光作为荧光标记物的激发光，采用中心波长为810nm的第二近红外连续激光器7，其发出的激光经过空间相位调制板后形成空心光束作为受激辐射损耗光，探测由上述两激光束准直共轭耦合聚焦扫描照射后所产生的超分辨四光子荧光信号，实现荧光成像。

具体的，本实施例中激发光生成模块包括第一近红外连续激光器1，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第一滤光片2、第一准直扩束镜(包括第一小孔光阑)3、第一二分之一波片4、第一偏振片5，所述第一近红外激光器发出的激光束经过第一滤光片、第一准直扩束镜(包括第一小孔光阑)后处理成为一束平行光束。然后利用第一偏振片及第一二分之一波片调节其功率，该光束的波长与稀土掺杂上转换纳米材料的激发波长相匹配。

损耗光生成模块包括第二近红外连续激光器7，以及沿该激光器所发射的激光束方向依次放置的第二滤光片8、第二准直扩束镜(包括第二小孔光阑)9、第二二分之一波片10、第二偏振片11、空间相位调制板12，所述第二近红外激光器发出的激光束经过第二滤光片、第二准直扩束镜(包括第二小孔光阑)后处理成为一束平行光束，然后利用第二偏振片及第二二分之一波片调节其功率，然后通过空间相位调制板调制成空心光束。该光束的波长与稀土掺杂上转换纳米材料的激活剂中受激辐射过程上下能级的能量间隙匹配。近红外激发光与近红外损耗光通过偏振分光镜6在空间上进行准直共轭耦合。

经过准直共轭耦合的耦合激光束经过多光子显微扫描模块聚焦到载物台上的NaYF₄：18％Yb³⁺/8％Tm³⁺上转换纳米材料标记的样品上，产生超分辨四光子荧光信号。多光子显微扫描模块包括沿耦合激光束前进方向依次放置的扫描振镜14、高反低透二向色镜15、物镜16，上述超分辨四光子荧光信号为波长455nm的蓝光信号，所述扫描振镜设置在一旋转装置上，旋转装置由一外部计算机控制，该计算机还与后述光电探测器连接。455nm超分辨四光子荧光信号经过物镜、高反低通二向色镜返回后，由光电探测模块探测该455nm荧光信号。

本实施例中光电探测模块包括依次同轴放置聚焦透镜18和光电探测器19。聚焦透镜和光电探测器设置在沿耦合激光束前进方向的反方向上，所述光电探测器与外部计算机链连接。在光电探测器接收完一次检测信号后，就发送信号到计算机，然后该计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，利用聚焦光斑扫描样品的方式得到一幅二维激光扫描荧光图像，所述载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过该电机，结合旋转装置可以获得三维激光扫描荧光图像。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。