一种综合性荧光超分辨显微成像装置的制作方法

本发明涉及显微成像技术领域，特别是涉及一种综合性荧光超分辨率显微成像装置。

背景技术：

细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位，探究细胞内的生命活动可以帮助人们理解人类自身的生命活动。荧光超分辨显微成像技术具有无损、特异性强、穿透深度深等优点，可以观测到如基因转录、蛋白合成与运输、物质交换等众多发生在各细胞器中的生命活动，因而相关荧光超分辨显微成像技术及装置的研究也层出不穷，且有着重要的科学价值和实际意义。

目前，主流的超分辨显微技术有受激辐射耗尽显微镜(stimulatedemissiondepletionmicroscopy,sted)，随机光学重建显微法(stochasticopticalreconstructionmicroscopy，storm)，光激活定位显微镜(photoactivatedlocalizationmicroscopy,palm),结构光照明显微镜(structured-illuminationmicroscopy,sim)，荧光差分显微镜(fluorescenceemissiondifference,fed)等等，它们各自有着自己独特的工作原理，独立的系统，互相独立，这就导致现有的超分辨显微产品往往很难具备，如果需要实现多个功能，需要在同一显微平台上接入不同模块，极大增加了系统复杂度，操作难度以及成本。

sim显微镜由于宽视场、低照明光功率、更小的光毒性等特点，在活体生物细胞超分辨成像领域有着较大的应用前景。目前主流的sim显微镜结构主要是通过物理光栅或者空间光调制器(slm)产生±1级衍射光束，在通过透镜系统以及显微物镜将光束加载至样品表面，以干涉的方式形成周期性干涉条纹，进而对样品进行结构光照明，通过机械移动或者slm上加载的patten调节，进行移相以及条纹旋转，最后得到超分辨图像复原所需的必要数据。对于物理光栅和slm而言，前者需要精密位移伺服系统对其进行平移和旋转，后者受限于slm材料特性(多数为液晶)，它们得到一帧图像的时间一般在数十ms量级，目前报道的最高拍摄速度在100帧左右，换算成超分辨图像帧数大约在6帧左右，对于变化较快的生物活体运动过程，依然不足。

傅里叶移频迭代显微成像(fourierptychographicmicroscopy,fpm)也属于宽场显微技术，由特定结构光或者散斑对样品进行照明，采用与sim图像复原不同的移频迭代算法，减少了图像复原中的伪像，复原质量要明显优于sim。

环状全内反射荧光显微镜(ring-tirf)是利用光线全反射在介质另一面产生倏逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。环状tirf利用一个环状光圈形成tirf照明成像，它的优势在于减少了激光散斑影响，快速的多角度成像减少了3d成像的时间以及单角度成像产生的色差，并提供了进行图像3d断层重建的可能，使系统具备z轴纳米精度层析功能。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种综合性荧光超分辨显微成像装置，可通过分光系统得到四束相干光束，并通过4f-振镜系统任意调整光束在显微物镜入瞳处的入射位置，从而实现包括结构光照明显微成像(sim)，三维结构光照明显微成像(3d-sim)，环形全内角反射荧光显微成像(ring-tirf)，傅里叶移频迭代显微成像(fpm)等功能。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

一种综合性荧光超分辨显微成像装置，包括光源，另外：

具有设置在光路上的第一偏振分束器，以及分别位于第一偏振分束器的反射和透射光路上的第二偏振分束器和第三偏振分束器，用于将光源发出的入射光束分为四束强度相等的光束；

具有设置在四束光束光路上的分束器，用于对四束光束进行合束；

具有一显微物镜，用于将合束后的四束平行光入射在样品上，并发生干涉，形成结构光照明；

还具有分别设置在四束光束光路上的光学开门，用于选择性打开/关闭相应的光束，形成2束光、3束光以及4束光干涉模式、或者1束光的宽场照明或者tirf照明模式。

优选的：具有位于所述光源和第一偏振分束器间的起偏器，用于将光源发出的入射光束变为线偏振光，所述的线偏振光在通过第一偏振分束器后分成强度相同的p光和s光；

具有分别设置在所述p光和s光的光路上的第一1/2波片，用于将所述的p光和s光旋转45°角后分别进入第二偏振分束器和第三偏振分束器，形成四束强度相等光束。

作为优选的，在所述第二偏振分束器透射形成的p偏振光的光路上设置第二1/2波片，用于将p偏振光旋转90°变成s偏振光；

在所述第三偏振分束器反射形成的s偏振光光路上设置第三1/2波片，用于将s偏振光旋转90°变成p偏振光。

作为优选的，具有分别位于四束光束光路上的4f-振镜模块，用于体制各光束在显微物镜后焦面的出射位置，以改变干涉条纹的形状、周期。

作为优选的，所述的4f-振镜模块包括用于x方向扫描的第一检流计振镜、用于y方向扫描的第二检流计振镜、第一反射式/透射式4f系统和第二反射式/透射式4f系统，所述第一反射式/透射式4f系统的前焦面应当与第一检流计振镜重合，第二反射式/透射式4f系统的后焦面应当与第二检流计振镜重合，第一反射式/透射式4f系统的后焦面与第二反射式/透射式4f系统的前焦面应重合，第一检流计振镜与第二检流计振镜处于共轭位置。

作为优选的，所述的第一反射式/透射式4f系统和第二反射式/透射式4f系统为离轴抛物面镜或消色差透镜。

本发明中，所述的分束器包括：第一分束镜，用于将第二偏振分束器分束得到两束光束合束；第二分束镜，用于将第三偏振分束器分束得到两束光束合束；第四偏振分束器，用于对第一分束镜和第二分束镜出射的光束合束。

进一步的，在所述第一分束镜和第二分束镜的出射光路上分别设置涡旋相位板，用于对光束偏振方向进行旋转，使光束以s偏振方式在样品表面产生干涉。

优选的，在第二偏振分束器和第三偏振分束器的透射或/和反射光路上的调节光程差机构，用于调节光束之间的光程差以改变干涉条纹的相位。

作为优选的，所述的调节光程差机构为由压电位移台驱动的镀有金属反射膜的直角棱镜。

本发明的荧光超分辨显微成像装置，不但可实现sim、3d-sim、fpm以及ring-tirf显微技术，而且可通过同一光学装置实现对生物样品的不同超分辨显微技术成像，对样品进行更加全面的超分辨成像研究，以期对细胞动力学进行更加深入的了解，同时又可极大精简了系统模块数量以及系统复杂程度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明综合性荧光超分辨显微成像装置结构示意图；

图2为本发明4f-振镜模块结构示意图；

图3为本发明4f-振镜模块的另一结构示意图；

图4为本发明涡旋相位板旋光方向空间分布图；

图5为线偏光经过涡旋相位板后的偏振分布示意图；

图6为聚焦光斑在显微物镜入瞳面的入射位置示意图；其中，图6(a)为宽场模式下入射位置图，图6(b)为ring-tirf模式下入射光束位置图，图6(c)为sim/tirf-sim模式下入射光束位置图，图6(d)为tirf-sim模式下入射光束位置图，图6(e)为3d-sim模式下入射光束位置图，图6(f)为fpm模式下的入射光束位置图；

图7为本发明装置所产生的部分结构光效果示意图，其中，图7(a)为干涉条纹条纹轴向分布图，图7(b)为网格状干涉条纹图。

符号说明：

准直透镜1，起偏器2，平面反射镜3，第一偏振分束立方体(pbs)4(a)，第二偏振分束器4(b)，第三偏振分束器4(c)，第四偏振分束器4(d)，第一分束镜(bs)5(a)和第二分束镜(bs)5(b)，第一4f-振镜模块6(a)，第二4f-振镜模块6(b)，第三4f-振镜模块6(c)，第四4f-振镜模块6(d)，第一电动shutter7(a)，第二电动shutter7(b)，第三电动shutter7(c)，第四电动shutter7(d)，第一一维压电位移台8(a)和第二一维压电位移台8(b)，第一镀有金属反射膜的直角棱镜9(a)，第二镀有金属反射膜的直角棱镜9(b)，第三镀有金属反射膜的直角棱镜9(c)，第四镀有金属反射膜的直角棱镜9(d)，第一消色差二分之一波片10(a)，第二消色差二分之一波片10(b)，第三消色差二分之一波片10(c)，第四消色差二分之一波片10(d)，第一d型反射镜11(a)，第二d型反射镜11(b)，第三d型反射镜11(c)，第四d型反射镜11(d)，第一涡旋相位板12(a)和第二涡旋相位板12(b)，第一f-θ透镜13(a)，第二f-θ透镜13(b)，第三f-θ透镜13(c)，第四f-θ透镜13(d)，第一管镜(tubelens)14(a)，第二管镜(tubelens)14(b)，第三管镜(tubelens)15，显微物镜16，二向色镜17，成像透镜18，ccd相机19，第一检流计振镜20(a)和第二检流计振镜20(b)，第一反射式/透射式4f系统21和第二反射式/透射式4f系统22。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的综合性荧光超分辨显微成像装置，可通过分光系统得到四束相干光束，并通过4f-振镜系统任意调整光束在显微物镜入瞳处的入射位置，从而实现包括结构光照明显微成像(sim)，三维结构光照明显微成像(3d-sim)，环形全内角反射荧光显微成像(ring-tirf)，傅里叶移频迭代显微成像(fpm)等功能。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

如图1所示，本发明的综合性荧光超分辨显微成像装置包括：

入射光束经由准直透镜1准直后通过起偏器2以及平面反射镜3反射进入第一偏振分束器4(a)分成强度相同的p光和s光，然后再由第一二分之一波片10(a)和第二二分之一波片10(b)旋转45°角后进入第二偏振分束器4(b)和第三偏振分束器4(c)中，形成总共4束强度相等光束；然后通过第一4f-振镜模块6(a)、第二4f-振镜模块6(b)、第三4f-振镜模块6(c)和第四4f-振镜模块6(d)进行光束传播角度以及位置的调制后，通过第一分束镜5(a)和第二分束镜5(b)合束，再通过第三f-θ透镜13(c)、第四f-θ透镜13(d)、第一管镜(tubelens)14(a)和第二管镜(tubelens)14(b)组合成的两组4f系统以及第四偏振分束器4(d)合束后，通过第三管镜(tubelens)15以汇聚形式传输至显微物镜16的后焦面，最后由显微物镜将其以四束平行光方式入射在样品上，并发生干涉，形成结构光照明。

经过第三偏振分束器4(c)反射形成的s偏振光，应通过第三1/2波片10(c)旋转90°变成p偏振光，经过第二偏振分束器4(b)透射形成的p偏振光，应通过第四1/2波片10(d)旋转90°变成s偏振光。

通过四束光路中的第一电动shutter7(a)、第二电动shutter7(b)、第三电动shutter7(c)和第四电动shutter7(d)可选择性打开/关闭相应的光束，形成2束光、3束光以及4束光干涉模式，或者1束光的宽场照明或者tirf照明模式。

通过如图4所示第一涡旋相位板12(a)和第二涡旋相位板12(b)对光束偏振方向进行旋转，以保证光束始终以s偏振方式在样品表面产生干涉，以形成最佳的条纹对比度。

如图5所示，入射光的偏振方向与涡旋相位板快轴相对位置关系应为：入射光偏振方向应当与涡旋相位板的0°快轴方向垂直，从而可以保证出射光的偏振方向始终处于s偏振。

通过第一4f-振镜模块6(a)、第二4f-振镜模块6(b)、第三4f-振镜模块6(c)和第四4f-振镜模块6(d)内的振镜对光束进行x,y方向的调制，使得每束光的出射位置可处于显微物镜后焦面的任意位置，从而改变干涉条纹的形状、周期。

通过第一一维压电位移台8(a)和第二一维压电位移台8(b)的前后移动，调节光束之间的光程差，从而改变干涉条纹的相位。

第一涡旋相位板12(a)和第二涡旋相位板12(b)应处于透镜第一f-θ透镜13(a)、第二f-θ透镜13(b)、第三f-θ透镜13(c)和第四f-θ透镜13(d)的后焦面附近，以保证四束光以汇聚形式通过，从而可以使得光束偏振方向被同一快轴旋转至切向偏振方向。

如图2所示，第一4f-振镜模块6(a)、第二4f-振镜模块6(b)、第三4f-振镜模块6(c)和第四4f-振镜模块6(d)应由第一检流计振镜20(a)和第二检流计振镜20(b)，结合第一反射式/透射式4f系统21和第二反射式/透射式4f系统22构成，其中第一检流计振镜20(a)负责x方向扫描，第二检流计振镜20(b)负责y方向扫描；

第一反射式/透射式4f系统21的前焦面应当与第一检流计振镜20(a)重合，第二反射式/透射式4f系统22的后焦面应当与第二检流计振镜20(b)重合，第一反射式/透射式4f系统21的后焦面与第二反射式/透射式4f系统22的前焦面应重合，保证第一检流计振镜20(a)与第二检流计振镜20(b)处于共轭位置。

本实施例中，若第一4f-振镜模块6(a)、第二4f-振镜模块6(b)、第三4f-振镜模块6(c)和第四4f-振镜模块6(d)中为反射式结构，则第一反射式/透射式4f系统21与第二反射式/透射式4f系统22应选用离轴抛物面镜，如图3所示，若第一4f-振镜模块6(a)、第二4f-振镜模块6(b)、第三4f-振镜模块6(c)和第四4f-振镜模块6(d)中为透射式结构，则第一反射式/透射式4f系统21与第二反射式/透射式4f系统22应选用消色差透镜。

样品受结构光照明产生的荧光信号应通过二向色镜17反射至成像透镜18上，并由成像透镜18成像至ccd相机19上；

四束光路应尽可能对称分布，以保证四束光的相干性，略微的光程差异应由第二镀有金属反射膜的直角棱镜9(b)和第三镀有金属反射膜的直角棱镜9(c)的前后平移来补偿。

本实施例中的综合性荧光超分辨显微成像装置包括以下几种工作模式：

宽场模式为：

关闭第二电动shutter7(b)、第三电动shutter7(c)和第四电动shutter7(d)，开启第一电动shutter7(a)，第一4f-振镜模块6(a)的振镜处于零位，光束处于显微物镜入瞳中心位置入射，如图6(a)所示；

ring-tirf模式为：

关闭第二电动shutter7(b)、第三电动shutter7(c)和第四电动shutter7(d)，开启第一电动shutter7(a)，第一4f-振镜模块6(a)的第一检流计振镜20(a)上加载asin(ωt)驱动信号，第二检流计振镜20(b)上加载acos(ωt)驱动信号，使得入射光束处于如图6(b)所示入瞳面的tirf区域，公式中，a为电压，ω为频率，通过改变a值，可以改变tirf角度；

sim/tirf-sim模式为：

关闭电动第三电动shutter7(c)和第四电动shutter7(d)，开启第一电动shutter7(a)和第二电动shutter7(b)，首先，第一4f-振镜模块6(a)和第二4f-振镜模块6(b)的第一检流计振镜20(a)上加载直流驱动信号a，第二检流计振镜20(b)处于零位，使得入射光处于如图6(c)所示0°位置，从而形成水平方向干涉条纹，利用第一一维压电位移台8(a)分别步进0，λ/6，2λ/6距离，对条纹进0，2π/3，4π/3移相，并利用ccd相机同步拍摄到相应相位下的照片；

其次，第一4f-振镜模块6(a)和第二4f-振镜模块6(b)的第一检流计振镜20(a)上加载直流驱动信号a，在第二检流计振镜20(b)加载直流驱动信号，使得入射光处于如图6(c)所示60°位置，从而形成60°方向干涉条纹，利用第一一维压电位移台8(a)分别步进0，λ/6，2λ/6距离，对条纹进0，2π/3，4π/3移相，并利用ccd相机同步拍摄到相应相位下的照片；

再次，第一4f-振镜模块6(a)和第二4f-振镜模块6(b)的第一检流计振镜20(a)上加载直流驱动信号-a，在第二检流计振镜20(b)加载直流驱动信号，使得入射光处于如图6(c)所示120°位置，从而形成120°方向干涉条纹，利用第一一维压电位移台8(a)分别步进0，λ/6，2λ/6距离，对条纹进0，2π/3，4π/3移相，并利用ccd相机同步拍摄到相应相位下的照片；

最后，所得到的9张数据，由sim算法反演得到相应的超分辨率图像。

tirf-sim模式为：

tirf-sim操作上与sim基本一致，区别在于直流电压值a要比sim情况下大，以保证入射光束处于入瞳面上的tirf区域，即如图6(d)所示0°位置，从而使得系统干涉光为倏逝波干涉，所得到的9张数据，应由tirf-sim算法反演得到相应的超分辨率图像。

3d-sim模式为：

关闭第四电动shutter7(d)，开启第一电动shutter7(a)、第二电动shutter7(b)和第三电动shutter7(c)，首先，第一4f-振镜模块6(a)和第二4f-振镜模块6(b)的第一检流计振镜20(a)上加载直流驱动信号a，第二检流计振镜20(b)处于零位，第三4f-振镜模块6(c)的振镜处于零位，使得入射光处于如图6(e)所示0°位置，从而形成水平方向的三光束干涉条纹，条纹轴向分布如图7(a)所示，利用第一一维压电位移台8(a)分别步进0，λ/10，2λ/10，3λ/10，4λ/10距离，对条纹进0，2π/5，4π/5，6π/5，8π/5移相，并利用ccd相机同步拍摄到相应相位下的照片；

其次，第一4f-振镜模块6(a)和第二4f-振镜模块6(b)的第一检流计振镜20(a)上加载直流驱动信号a，在第二检流计振镜20(b)加载直流驱动信号，使得入射光处于如图6(d)所示60°位置，从而形成60°方向的三光束干涉条纹，利用第一一维压电位移台8(a)分别步进0，λ/10，2λ/10，3λ/10，4λ/10距离，对条纹进0，2π/5，4π/5，6π/5，8π/5移相，并利用ccd相机同步拍摄到相应相位下的照片；

再次，第一4f-振镜模块6(a)和第二4f-振镜模块6(b)的第一检流计振镜20(a)上加载直流驱动信号-a，在第二检流计振镜20(b)加载直流驱动信号，使得入射光处于如图6(d)所示120°位置，从而形成120°方向的三光束干涉条纹，利用第一一维压电位移台8(a)分别步进0，λ/10，2λ/10，3λ/10，4λ/10距离，对条纹进0，2π/5，4π/5，6π/5，8π/5移相，并利用ccd相机同步拍摄到相应相位下的照片；

最后，所得到的15张数据，由3d-sim算法反演得到相应的超分辨率图像。

fpm模式为：

首先，开启第一电动shutter7(a)和第二电动shutter7(b)，第一4f-振镜模块6(a)和第二4f-振镜模块6(b)的第一检流计振镜20(a)上加载直流驱动信号a，第二检流计振镜20(b)处于零位，使得入射光处于如图6(e)所示0°位置，从而形成水平方向干涉条纹；第三4f-振镜模块6(c)和第四4f-振镜模块6(d)的第二检流计振镜20(b)上加载直流驱动信号a，第一检流计振镜20(a)处于零位，使得入射光处于如图6(e)所示90°位置，从而形成垂直方向干涉条纹，进而形成如图7(b)所示网格状干涉条纹；

其次，利用第一一维压电位移台8(a)分别步进0，λ/20，2λ/20…9λ/20距离，对水平条纹进行0，π/10，2π/10…9π/10移相后，利用第二一维压电位移台8(b)步进λ/20距离，对垂直条纹进行π/10移相，再重复移动第一一维压电位移台8(a)10步以及第二一维压电位移台8(b)步进1步的过程，直至第二一维压电位移台8(b)步进次数也达到10步，从而实现逐行扫描过程，并利用ccd相机同步拍摄到相应相位下的100张数据；

最后，所得到的100张数据，由fpm移频迭代算法反演得到相应的超分辨率图像。

tirf-fpm模式为：

tirf-fpm操作上与fpm基本一致，区别在于直流电压值a要比fpm情况下大，以保证入射光束处于入瞳面上的tirf区域，从而产生倏逝波干涉网格照明。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。