光热差分显微成像装置及单个粒子成像方法与流程

本发明涉及一种实现单个分子显微成像的系统，通过提取出光热差分信号来实现对单颗粒的成像。

背景技术：

从单细胞和单分子水平上原位地了解物质之间的相互作用以及生命的过程已经成为当今生命科学领域的研究热点。目前国际上通用的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、近场光学扫描显微术、共焦荧光显微术和全内反射荧光显微术。这些技术在分子生物学、分子化学及纳米材料等领域受到广泛关注。其中全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的倏逝波来激发样品，由于倏逝波的强度成指数衰减，使样品表面数百纳米厚薄层内的荧光团受到激发，从而使荧光成像的信噪比和对比度得到大大提高。它是当今世界上研究单分子科学领域中最灵敏的成像和检测技术之一，可以用来直接探测单个荧光分子。因此，已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。

但利用全内反射荧光显微术实现单分子荧光成像也有其自身的缺点。我们都知道，荧光成像的质量很大程度上依赖于荧光信号强度，提高激发光强度固然可以提高信号强度，但激发光的强度不是可以无限提高的，当激发光的强度超过一定限度时，光吸收就趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子，就会出现光漂白现象。在显微术中，光漂白使得观测变得很复杂，因为它会造成破坏，使荧光团无法继续放光，以至于对实验观测造成影响。

光热差分显微成像技术是利用单粒子吸收过程中热效应导致其周围介质折射率的变化，使探测光被频移的激光与未频移的激光进行外差(类似于拍)，再利用微弱信号探测系统提取到粒子的吸收信息，从而实现对单个粒子的成像。

技术实现要素：

本发明的目的是克服了传统荧光成像技术中光漂白的缺点，设计一套系统来实现对单个颗粒成像，其中所采用的技术是光热差分显微成像。

本发明的技术方案如下：

一种光热差分显微成像装置，参见图1，包括用于光学成像的照明系统，用于提取金属颗粒周围热吸收信息的泵浦-探测双光束微弱信号探测系统，以及对样品作二维扫描的平面扫描系统，其中：

所述照明系统包括第二激光器10、双色镜8、油浸物镜16、空气物镜18、凸透镜22和cmos传感器23，第二激光器10发出的激光经衰减、扩束后进入双色镜8，再进入油浸物镜16，油浸物镜16将激光聚焦到样品上，透射光通过空气物镜18收集起来，经凸透镜22聚焦后在cmos传感器23上成像；

所述泵浦-探测双光束微弱信号探测系统包括第一激光器1、第二激光器10、声光调制器3、信号发生器30、双色镜8、油浸物镜16、空气物镜18、半透半反镜20、高速光电探测器27和锁相放大器29，第一激光器1发出加热激光光束，经衰减后进入声光调制器3，声光调制器3在信号发生器30所给的调制频率下对激光光强进行调制，调制后的激光经扩束后进入双色镜8，再进入油浸物镜16，油浸物镜16将激光聚焦到样品上，样品受到该激光加热后向周围介质热辐射；而第二激光器10发出探测激光光束，其进入油浸物镜16的光路与所述照明系统光路一致，区别在于探测激光光束被油浸物镜16聚焦到样品上后将出现频移，频移后的激光通过空气物镜18收集，在半透半反镜20的分束作用下，一束激光用于cmos成像，另外一束激光聚焦到高速光电探测器27上，高速光电探测器27收集光强信号传递给锁相放大器29，提取出振荡频率与声光调制器3调谐频率匹配的强度信号；

所述平面扫描系统包括位于油浸物镜16和空气物镜17之间的超精细三维平移台17，以及对超精细三维平移台17进行控制的计算机控制器，样品放置在超精细三维平移台17上。

进一步的，上述照明系统还包括可调圆形衰减片11、激光扩束器14、半透半反镜20、带通滤波片21和若干反射镜，第二激光器10发出的激光通过可调圆形衰减片11衰减后，经反射镜12和13进入激光扩束器14，扩束后的激光依次经反射镜15、双色镜8和凸透镜9后进入油浸物镜16，油浸物镜16将激光聚焦到样品上，透射光通过空气物镜18收集起来，然后经反射镜19、半透半反镜20和带通滤波片21，最后由凸透镜22聚焦后在cmos传感器23上成像。

照明系统中的油浸物镜16和空气物镜18的焦点必须重合，且样品处在两物镜的焦平面上，cmos传感器23处在的凸透镜22一倍焦距处。由于样品尺寸极小，超过了光学分辨率的极限，所以光学成像照明系统是方便寻找样品标记物的位置。在本装置中还可以添加一条科勒照明光路专门实现对样品周围标记物的光学成像。

上述泵浦-探测双光束微弱信号探测系统的第一激光器1发出的激光经过可调圆形衰减片2衰减后进入声光调制器3，声光调制器3与信号发生器30相连，在信号发生器30所给的调制频率下实现对激光光强的调制，调制后的激光经过光阑4和反射镜5、6后进入激光扩束器7，扩束后的激光经过双色镜8和凸透镜9进入油浸物镜16，油浸物镜16将激光聚焦到样品上，样品受到该激光加热后向周围介质热辐射。

为了提取样品粒子周围的热辐射信息，泵浦-探测双光束微弱信号探测系统引入一束探测激光束，即由第二激光器10发出探测激光光束，其光路与照明系统的光路在半透半反镜20分束之前是一致的，探测激光光束被油浸物镜16聚焦到样品后，由于样品周围介质折射率受热发生变化，探测激光将会出现频移，频移后的激光通过空气物镜18收集，然后经反射镜19后被半透半反镜20分为两束：一束激光经带通滤波片21(滤掉加热激光光束)后由凸透镜22聚焦于cmos传感器23上，另一束激光经反射镜24和带通滤波片25(滤掉加热激光光束)后，由凸透镜26聚焦到高速光电探测器27上。强度信号被高速光电探测器27收集后通过锁相放大器29提取出振荡频率与声光调制器3调谐频率匹配的强度信号，最终实现微弱信号探测功能。

在泵浦-探测双光束微弱信号探测系统中，双色镜8可以实现两束激光在平面内合成一束激光，两束激光光轴高度必须保持一致。带通滤波片25的作用是滤掉加热激光光束使高速光电探测器27只收样品集频移后的探测激光，两台激光器的波长是依据所测样品来选择的。

上述平面扫描系统由油浸物镜16、普通物镜18、超精细三维平移台17和计算机28的控制器构成。利用油浸物镜16将激光聚焦到样品上，利用编写好的电脑程序控制超精细三维平移台17的扫描范围、扫描速率和步进大小，实现平面扫描功能。

本发明的光热差分显微成像装置中，光学成像照明系统主要用来寻找样品标记物所在的位置，泵浦-探测双光束微弱信号探测系统主要利用探测光束将样品周围的热辐射微弱信号提取出来，平面扫描系统主要是实现对样品的二维扫描，通过计算机处理将得到的锁相放大器读取的微弱热信号作二维强度分布图，最终即可实现对样品的二维热成像。

本发明实现单个粒子(特别是纳米颗粒)成像的原理和实施方式是：被声光调制器(aom)调谐的第一束激光对粒子进行加热，热传递导致粒子周围温度升高，周围介质折射率随温度发生变化，且其折射率随时间的变化率与加热激光束光强随时间的变化率，信号发生器所给信号频率相一致。为了提取粒子周围的热辐射信息，我们引入另一束探测激光束。第二束激光被汇聚于同一位置，被介质散射。随时间波动的折射率会导致散射光的频移，使得第二束激光出现差频信号。透过样品台的探测激光感受到的热波动越大，被频移的光强就越强，可以从频移的光强中推出热波动的相对幅值。被频移的激光与未频移的激光进行外差(类似于拍)，强度信号被高速光电探测器收集。经过锁相放大器提取出振荡频率与声光调制器调谐频率匹配的强度信号，也就取出了被频移的第二束激光光强。保持两束激光的良好聚焦，将样品台移动，进行如30nm步进的二维扫描，即可获得二维的热量分布图，实现对单个粒子的光热差分显微成像。

本发明的装置中，为了使我们的成像达到单颗粒水平，样品准备阶段需要将所测纳米颗粒旋涂在盖玻片上，以保证颗粒之间的间隔大于1微米。同时选用折射率随热改变大的介质(如甘油等)，使其充分浸润在纳米颗粒的表面，并且利用隔片和盖玻片使样品密封起来。

本发明的装置中，利用编写的控制软件，实现超精细三维平移台与锁相放大器联用。通过设置平移台步进与锁相放大器读取数据的时序，并设置平移台步进大小，扫描范围，实现对单个颗粒的光热差分显微成像。

本发明的装置中，选用油浸物镜的优点是，其大的数值孔径可以将激光光斑聚集的很小，有利于实验的进行。另外，锁相放大器和高速光电探测器的挑选应当由实验中信号发生器所提供的信号频率决定。

本发明的装置中，两个激光器波长的选择是依据所测样品来制定的，比如在具体实施方式中待测样品是直径20nm左右的金属颗粒，由于此尺寸结构下金属颗粒的共振吸收峰位在532nm附近，所以可采取第一束激光器的波长为532nm，能够更有效的加热样品。第二束激光器所起作用是探测功能，所以选择的是远离金属纳米颗粒共振吸收峰的633nm激光器。

该发明技术克服了传统荧光成像技术中光漂白的缺点，并能广泛地运用于分子生物学和材料科学。

附图说明

图1为本发明光热差分显微成像装置的示意图。

图1中：1、第一激光器，2和11、可调圆形衰减片，3、声光调制器，4、光阑，5、6、12、13、15、19和24、反射镜，7和14、激光扩束器，8、双色镜，10、第二激光器，16、油浸物镜，17、超精细三维平移台，18、空气物镜，20、半透半反镜，21和25、带通滤波片，9、22和26、凸透镜，23、cmos传感器，27、高速光电探测器，28、计算机，29、锁相放大器，30、函数信号发生器。

图2为对样品实现平面扫描的二维平面扫描装置结构示意图。

图3为对加热激光光束进行光强调制的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图来解释本发明内容及其应用。所述的实施方案是为了更好地说明本发明，而不能理解为是对本发明的权利要求的限制。

具体工作过程是：

图1是光热差分显微成像装置的示意图，第一激光器1是波长为532nm的激光器，它发出的激光经过可调圆形衰减片2衰减后进入到声光调制器3中，声光调制器3在函数信号发生器30给出的信号频率下实现对激光光强的调制，调制后的激光束依次经光阑4、反射镜5和6后进入激光扩束器7，经过激光扩束器7的作用，光束会变宽，扩束后的激光再经过双色镜8和反射镜9进入油浸物镜16(60x)聚焦，即可对加载在三维平移台17上的样品进行加热。加热后的粒子会使其周围介质的折射率随温度发生变化，且折射率随时间的变化率与加热激光束光强随时间的变化率相一致。为了提取粒子周围的热辐射信息，我们引入另一束探测激光束。第二激光器10是波长为633nm的激光器，其发出的激光通过可调圆形衰减片11衰减后经反射镜12、13进入激光扩束器14，然后再经过双色镜8和凸透镜9后进入油浸物镜16(60x)，同样被油浸物镜16聚焦，且其聚焦光斑与532nm的激光聚焦光斑严格重合。空气物镜18(40x)用来接收从样品表面散射出来的光束，散射光束由反射镜19反射而经过半透半反镜20后，一部分经带通滤波片21和凸透镜22进入cmos传感器23，另一部分会经反射镜24、带通滤波片25和凸透镜26进入高速光电探测器27。其中633nm带通滤波片21和25的作用是滤掉起加热作用的532nm激光光束。cmos传感器23可以用来寻找样品所在位置的标记物，而高速光电探测器27可以接收到633nm激光的外差信号。利用锁相放大器29即可提取出与声光调制器调谐频率匹配的强度信号。保持两束激光的良好聚焦，利用超精细三维平移台17进行20nm步进的二维扫描，即可获得二维的热量分布图，实现对单个颗粒的光热差分显微成像。

二维平面扫描装置，如图2所示。在进行二维扫描前，两束激光必须严格共轴，且被油浸物镜16(60x)聚焦在同一焦点处，样品被加载在超精细三维平移台17上。超精细三维平移台17的控制器安装在计算机28上，通过控制软件即可控制平移台17的步进、扫描方式和扫描范围。

加热激光光束光强的调节，如图3所示。函数信号发生器30与声光调制器3相连结，调节激光光束入射到声光调制器3的入射角大小，当入射角的大小正好满足布拉格衍射角时，激光通过声光调制器3会产生单一的衍射，再利用小孔光阑4滤掉其零级衍射光，使+1级衍射光透过。即可实现通过信号发生器所给信号频率大小调制激光光强。