基于肽段C末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法与流程

本发明涉及一种基于肽段c末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法及其应用。

背景技术：

多肽类药物是指通过化学合成、基因重组或动植物中提取的具有特定治疗作用的多肽。多肽类药物能够广泛作用于内分泌系统、免疫系统、消化系统、心血管系统、肌肉骨骼系统等。多肽类药物市场增长极快，是近年药物市场研发的趋势之一。目前全球批准上市的多肽药物已超过80余种，如治疗糖尿病的胰岛素、治疗老年疾病和侏儒症的人生长激素、治疗心血管疾病的利钠激素等。多肽类药物活性很高，给药剂量低，体内循环的药物浓度通常在亚纳克每毫升的浓度范围内。生物体内存在大量的干扰物质，如结构相同或者相似的内源性蛋白多肽类物质等，因此多肽类药物的研究需要超高灵敏度的检测方法。液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)技术集高效液相色谱的高分离性能与质谱的高灵敏度于一体，已经广泛应用于多肽类药物的药物代谢与药物动力学研究，并将成为未来发展的趋势。由于很多药物肽的末端缺乏碱性氨基酸导致其在质谱中的碎裂效率差，不利于质谱鉴定。通过在肽段的末端标记碱性分子可以提高多肽类药物的电离效率和离子传输率，从而提高其检测灵敏度。基于肽段c末端的衍生可屏蔽羧基的电负性，从而增强肽段的质谱分析能力。乔晓强等人将阳离子衍生化试剂溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑应用于肽段的羧基衍生化,模式肽段的质谱检测灵敏度可提高42倍以上(scichinalifesci,2013,43,96-102)。因此，基于肽段c末端化学衍生碱性分子可以提高多肽类药物在质谱碎裂效率和响应，从而提高其检测灵敏度。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于肽段c末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法。为实现该目的，本方法采用的技术方案为：

基于肽段c末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法，首先在含有机相的溶剂中，将肽段c末端的羧基，或肽段c末端的羧基与侧链谷氨酸或天冬氨酸的羧基进行酰胺化反应或者酯化反应；接着利用肽段酰胺酶特异性水解并暴露肽段c末端的羧基；最后在含有机相的溶剂中，将暴露的c末端羧基进行碱性分子的化学衍生，进行质谱检测。

所述的含有机相的溶剂是水和有机相的混合物，溶剂中水的体积浓度2-30％；有机相为乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、丙酮、异丙醇中的一种或两种以上。

所述的酰胺化反应是指肽段c末端的羧基，或肽段c末端的羧基与侧链谷氨酸或天冬氨酸的羧基与甲胺、乙胺、丙胺、乙醇胺中的一种或两种以上反应生成酰胺类物质；所述的酯化反应是指肽段c末端的羧基，或肽段c末端的羧基与侧链谷氨酸或天冬氨酸的羧基与甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或两种以上反应生成酯类物质。

所述的酰胺化反应温度为4-50℃，反应时间为0.5-12h；所述的酯化反应温度为4-50℃，反应时间为0.5-12h。

所述的肽段酰胺酶从大肠杆菌体内提取，能够特异性催化水解肽段c末端的酰胺键，而对肽段侧链的酰胺键和骨架的肽键无水解作用。

所述的肽段酰胺酶催化水解反应的ph为6.8-8.5，温度为25-50℃，时间为6-48h，酰胺酶与肽段的质量比为1:50-20:1。

所述的碱性分子是氨基胍、胍基丁胺、n,n-二甲基乙二胺、n,n-二甲基-1,3-丙二胺、(2-氨基乙基)三甲基氯化铵中的一种或两种以上。

所述的暴露出c末端羧基的肽段与碱性分子反应时的质量体积比为0.005-1克每毫升，反应温度为4-50℃，反应时间为0.5-12h。

肽段c末端标记上的碱性分子能够增加二级质谱中y离子的数目，提高肽段在质谱中的碎裂效率和响应，从而提高肽段的检测灵敏度。

所述的肽段为多肽类药物肽，所述的多肽类药物肽是化学合成、基因重组或动植物中提取的具有特定治疗作用的多肽，由几个到几十个氨基酸组成；所述的方法应用于提高多肽类药物肽的检测灵敏度。

(1)将5-100μg肽段(合成的模式肽段或购买的药物肽)粉末溶解于水和有机相的混合物，混合物中水的体积浓度为2-30％，有机相为乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、丙酮、异丙醇中的一种或两种以上，溶剂的总体积在50-500μl。在上述复溶后的肽段溶液中加入终浓度为25-1000mm的甲胺、乙胺、丙胺、乙醇胺中的一种或两种以上进行酰胺化反应，加入终浓度为20-200mm的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和终浓度为10-100mm的n-羟基琥珀酰亚胺进行活化羧基，反应温度为4-50℃，反应时间为0.5-12h。或者在上述复溶后的肽段溶液中加入终浓度为25-1000mm甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或两种以上进行酯化反应，加入终浓度为20-200mm的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和终浓度为10-100mm的n-羟基琥珀酰亚胺进行活化羧基，反应温度为4-50℃，反应时间为0.5-12h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(2)将第(1)步得到的产物复溶后进行肽段酰胺酶的水解反应，复溶的体积在50-500μl，水解反应ph为6.8-8.5，温度为25-50℃，时间为6-48h，酰胺酶与肽段的质量比为1:50-20:1。反应完毕，进行液相色谱除盐、冻干。

(3)将第(2)得到的产物溶解于水和有机相的混合物，混合物中水的体积浓度为2-30％，有机相为乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、丙酮、异丙醇中的一种或两种以上，溶剂的总体积在50-500μl。加入终浓度为25-1000mm的氨基胍、胍基丁胺、n,n-二甲基乙二胺、n,n-二甲基-1,3-丙二胺、(2-氨基乙基)三甲基氯化铵中的一种或两种以上进行标记反应，加入终浓度为20-200mm的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和终浓度为10-100mm的n-羟基琥珀酰亚胺进行活化，反应温度为4-50℃，反应时间为0.5-12h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(4)将(1)(2)(3)得到的产物进行lc-ms/ms的分析，比较标记前后肽段的碎片离子数目和信号强度。

本发明具有如下优点：

1.在肽段水平用小分子进行化学封闭c末端、侧链谷氨酸和天冬氨酸羧基的反应效率高。

2.肽段酰胺酶特异性水解肽段c末端的酰胺键，而对侧链的酰胺键和骨架的肽键无水解作用。

3.肽段c末端标记上碱性分子，在二级质谱中产生更多的y离子，提高肽段在质谱中的碎裂效率和响应。

附图说明

图1为肽段c末端化学衍生提高质谱碎裂效率和响应的方法流程图；

图2为模式肽段1200标记甲胺前后的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图；

图3为模式肽段9094标记甲胺前后的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图。

具体实施方式

实施例1

(1)称取1mg合成的模式肽段ct1200(序列为lvvstqtala)，加入1000μl的n,n-二甲基甲酰胺和水的混合溶液配成肽段母液，水的体积浓度是5％。另取一个离心管，加入20μl肽段母液，75μl的乙腈，2.5μl，1m的n-羟基琥珀酰亚胺，2μl，2.5m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，0.5μl，5m甲胺，25℃反应2h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(2)上述产物加入100μl，ph7.5的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲盐进行复溶，加入0.5μg的肽段酰胺酶，25℃水解12h。反应完毕进行液相色谱除盐、冻干。

(3)上述产物加入93.5μl的n,n-二甲基甲酰胺和水的混合溶液进行复溶，水的体积浓度是2％。再加入2.5μl，1m的n-羟基琥珀酰亚胺，2μl，2.5m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，2μl，5m氨基胍，25℃反应2h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(4)将(1)(2)(3)得到的产物进行lc-ms/ms的分析，比较标记前后肽段的碎片离子数目和信号强度，达到提高模式肽段的检测灵敏度的目的。

实施例2

(1)称取1mg合成的模式肽段9094(序列为keifvgi)，加入1000μl的n,n-二甲基甲酰胺和水的混合溶液配成肽段母液，水的体积浓度是5％。另取一个离心管，加入20μl肽段母液，74.5μl的乙腈，2.5μl，1m的n-羟基琥珀酰亚胺，2μl，2.5m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，1μl，5m甲胺，25℃反应2h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(2)上述产物加入100μl，ph7.5的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲盐进行复溶，加入0.5μg的肽段酰胺酶，25℃水解12h。反应完毕进行液相色谱除盐、冻干。

(3)上述产物加入90μl的n,n-二甲基甲酰胺和水的混合溶液进行复溶，水的体积浓度是2％。再加入5μl，1m的n-羟基琥珀酰亚胺，4μl，2.5m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，1μl，5m胍基丁胺，25℃反应2h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(4)将(1)(2)(3)得到的产物进行lc-ms/ms的分析，比较标记前后肽段的碎片离子数目和信号强度，达到提高模式肽段的检测灵敏度的目的。

实施例3

(1)称取1mg购买的药物肽催产素(序列为cyiqncplg)，加入1000μl的丙酮和水的混合溶液配成肽段母液，水的体积浓度是5％。另取一个离心管，加入20μl肽段母液，65.5μl的n,n-二甲基甲酰胺，2.5μl，1m的n-羟基琥珀酰亚胺，2μl，2.5m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，10μl，5m乙醇胺，25℃反应2h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(2)上述产物加入100μl，ph7.5的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲盐进行复溶，加入0.1μg的肽段酰胺酶，30℃水解24h。反应完毕进行液相色谱除盐、冻干。

(3)上述产物加入93.5μl的n,n-二甲基甲酰胺和水的混合溶液进行复溶，水的体积浓度是2％。再加入2.5μl，1m的n-羟基琥珀酰亚胺，2μl，2.5m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，2μl，5m的n,n-二甲基乙二胺，25℃反应4h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(4)将(1)(2)(3)得到的产物进行lc-ms/ms的分析，比较标记前后肽段的碎片离子数目和信号强度，达到提高药物肽的检测灵敏度的目的。

实施例4

(1)称取1mg购买的药物肽促肾上腺皮质激素(序列为sysmehfrwgkpvgkkrrpvkvyp)，加入1000μl的丙酮和水的混合溶液配成肽段母液，水的体积浓度是5％。另取一个离心管，加入20μl肽段母液，65.5μl的n,n-二甲基甲酰胺，2.5μl，1m的n-羟基琥珀酰亚胺，2μl，2.5m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，10μl，5m乙醇胺，25℃反应2h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(2)上述产物加入100μl，ph7.5的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲盐进行复溶，加入0.1μg的肽段酰胺酶，30℃水解24h。反应完毕进行液相色谱除盐、冻干。

(3)上述产物加入81μl的n,n-二甲基甲酰胺和水的混合溶液进行复溶，水的体积浓度是2％。再加入5μl，1m的n-羟基琥珀酰亚胺，4μl，2.5m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，10μl，5m的n,n-二甲基-1,3-丙二胺，25℃反应4h。反应完毕，冻干后进行液相色谱除盐、冻干。

(4)将(1)(2)(3)得到的产物进行lc-ms/ms的分析，比较标记前后肽段的碎片离子数目和信号强度，达到提高药物肽的检测灵敏度的目的。