一种利用碳量子点可视化检测L-半胱氨酸浓度的方法与流程

本发明涉及医药化学技术领域，更具体地，涉及一种利用碳量子点可视化检测l-半胱氨酸浓度的方法。

背景技术：

l-半胱氨酸又称半胱氨酸，是一种人体非必需氨基酸。l-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基(-sh)的氨基酸。l-半胱氨酸存在于角蛋白中，角蛋白是构成指甲、趾甲、皮肤与毛发的主要蛋白质。l-半胱氨酸能帮助胶原组织产生，能维持皮肤的弹性与肌理。它也与消化酶的蛋白质有关，半胱氨酸可将—sh基供给体内许多重要的酶，如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等。l-半胱氨酸主要应用在化妆品、医药、食品领域。在化妆品方面，用于制备烫发精、防晒霜、生发香水与养发精等。在医药领域用于制备甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、半胱氨酸甲酯、半胱氨酸乙酯及综合氨基酸制剂等药物。半胱氨酸可用作放射线损伤的防护药物。在食品方面，l-半胱氨酸用作面包发酵助剂(催熟剂)、奶粉及果汁用抗氧化剂的稳定剂及宠畜食物的营养剂等。l-半胱氨酸浓度的检测具有重大意义。

现有技术cn104777117a公开了一种半胱氨酸的检测方法，但是，该方法的试剂昂贵、检测成本较高，难以在社会生产活动中大规模应用。急需开发出一种新的检测l-半胱氨酸浓度的方法。

技术实现要素：

本发明为克服上述现有技术所述的制备过程复杂、成本高，且稳定性不足缺陷，提供一种利用碳量子点可视化检测l-半胱氨酸浓度的方法，提供的检测方法灵敏度高、检测限低，能够实现样品中l-半胱氨酸浓度的快速可视化检测，而且试剂廉价、检测成本低，具有极大的应用价值，市场前景广阔。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种利用碳量子点可视化检测l-半胱氨酸浓度的方法，利用混合溶液中l-半胱氨酸的浓度与混合溶液的吸光度之间呈线性关系，从而检测l-半胱氨酸的浓度；

所述混合溶液含有tmb、过氧化氢、碳量子点、磷酸柠檬酸缓冲液和磷酸盐缓冲液。

本发明创造性地发现碳量子点能够用于可视化检测l-半胱氨酸的浓度，检测过程简单方便，灵敏度高、检测限低，可实现实际样品中l-半胱氨酸的快速检测。碳量子点稳定性好、制备成本低，该检测方法检测成本低，具有极大的应用价值，市场前景广阔。

优选地，所述碳量子点采用水溶性碳量子点溶液，所述水溶性碳量子点溶液由鸡血制备得到。水溶性碳量子点溶液，稳定性好，制备简单，操作方便，毒性小。

优选地，所述方法包括如下步骤：

s1.制备水溶性碳量子点溶液；

s2.配制检测溶液和l-半胱氨酸的标准浓度溶液，将所述检测溶液与标准浓度溶液混合得到混合溶液，建立混合溶液的吸光度与所述混合溶液中l-半胱氨酸的浓度的线性关系；所述检测溶液含有tmb、过氧化氢、水溶性碳量子点、磷酸柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和水；

s3.将待测溶液与所述检测溶液混合得到待测混合溶液，测试所述待测混合溶液的吸光度，从而得到l-半胱氨酸的浓度；所述待测混合溶液的体积与所述混合溶液相等，所述待测混合溶液中待测溶液的体积与所述混合溶液中标准浓度溶液相等。

制备水溶性碳量子点溶液的步骤如下：

收集新鲜鸡血，在10000rpm，4℃的条件下离心15分钟，去除上层血清，收集下层血凝块。将血凝块在滤纸上挤压出水分，再将挤压后的血凝块转移至烘箱，在40~60℃烘干，然后在研钵上研磨成粉。将鸡血粉末按质量比0.95%~1.15%溶于水中，然后在170~190℃进行充分反应，反应11~13小时，室温冷却后将反应液用0.45μm微孔滤膜过滤去除不溶性杂质即获得到水溶性碳量子点溶液。

优选地，所述过氧化氢为30%过氧化氢溶液。

优选地，所述tmb溶液的浓度为10mm。

优选地，所述水溶性碳量子点溶液的浓度为10mg/ml。

优选地，所述检测溶液由tmb溶液、30%过氧化氢、水溶性碳量子点溶液、磷酸柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和水按体积比40∶1∶125∶500∶875∶460配制得到。

所述标准浓度溶液为一系列含有不同浓度的l-半胱氨酸的溶液。浓度可以为1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.90、1.95、0.98、0.48、0.24、0.12、0μm。

优选地，所述标准浓度溶液与检测溶液的体积比为1∶4。

优选地，所述待测溶液与检测溶液的体积比为1∶4。

优选地，所述待测混合溶液在37℃条件下反应30min后，用硫酸终止反应。所述硫酸的浓度可以为2m。

而且，研究发现，上述检测溶液能够用于l-半胱氨酸的特异性检测。

特异性检测的具体步骤如下：

m1.配制浓度为500μm的l-phenylalanine、dl-tryptophan、l-methionine、glycine、glucose、creatinine、sucrose、l-serine、l-cysteine；

m2.配制检测溶液，检测溶液的混合液体积比为tmb溶液：30%过氧化氢：碳量子点溶液：磷酸柠檬酸缓冲液：磷酸盐缓冲液：水=40∶1∶125∶500∶875∶460；

m3.取相同体积的l-phenylalanine、dl-tryptophan、l-methionine、glycine、glucose、creatinine、sucrose、l-serine、l-cysteine，作为测量溶液，向每个测量溶液中加入4倍测量溶液体积的检测溶液；

m4.在37℃温育30min后，加入2m硫酸终止反应；

m5.在450nm检测每个添加了检测溶液的测量溶液的吸光度，建立测量溶液的吸光度与测量溶液成分的关系。

测试吸光度时，采用的激发波长可以为450nm。

本发明中，tmb是指3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明将碳量子点用于可视化检测l-半胱氨酸的浓度，检测过程简单方便，灵敏度高、检测限低，可实现实际样品中l-半胱氨酸的快速检测。该检测方法检测成本低，具有极大的应用价值，市场前景广阔。

另外，基于鸡血制备的水溶性碳量子点溶液，稳定性好，操作方便，制备简单，毒性小，是绿色环保无毒性产品。

附图说明

图1为实施例1中得到的不同浓度l-半胱氨酸标准溶液的标准曲线图。

图2为实施例1中检测溶液对检测l-半胱氨酸的特异性图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例中的原料均可通过市售得到；

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

一种利用碳量子点可视化检测l-半胱氨酸浓度的方法，具体步骤如下：

步骤一、基于鸡血制备水溶性碳量子点溶液，具体为：

收集新鲜鸡血，在10000rpm，4℃的条件下离心15分钟，去除上层血清，收集下层血凝块。将血凝块在滤纸上挤压出水分，再将挤压后的血凝块转移至烘箱，在40~60℃烘干，然后在研钵上研磨成粉。将鸡血粉末按质量比1.0%溶于水中，然后在180℃进行充分反应，反应12小时，室温冷却后将反应液用0.45μm微孔滤膜过滤去除不溶性杂质即获得到水溶性碳量子点溶液。水溶性碳量子点溶液的浓度为10mg/ml。

步骤二、建立混合溶液的吸光度强度与l-半胱氨酸浓度的线性关系，具体为：

a、配制浓度为1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.82、3.90、1.95、0.98、0.48、0.24、0.12、0μm的l-半胱氨酸溶液，作为标准溶液；

b、配制检测溶液，检测溶液为由检测溶液为tmb溶液、30%过氧化氢、碳量子点溶液、磷酸柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、水的混合液，其体积比为40:1:125:500:875:460；tmb溶液的浓度为10mm。

c、取40μl的标准溶液置于酶标孔中，向每个酶标孔中加入160μl的检测溶液，得到混合溶液，最终使得每个酶标孔中的混合溶液的总体积为200μl，每个酶标孔中的标准溶液与检测溶液的体积比为1:4；

d、在37℃温育30min后，加入2m硫酸终止反应；

e、在450nm检测每个添加了检测溶液的混合溶液的吸光度，以标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，并进行线性拟合，建立混合溶液的吸光度与l-半胱氨酸的浓度的线性关系。

混合溶液的吸光度与l-半胱氨酸的浓度的线性关系如图1所示，线性方程为：y=0.73728x-0.00315，r²=0.996。

步骤三、在线性关系的基础上，对检测l-半胱氨酸的特异性进行检测，具体为：

a、配制浓度为500μm的l-phenylalanine、dl-tryptophan、l-methionine、glycine、glucose、creatinine、sucrose、l-serine、l-cysteine；

b、配制检测溶液，检测溶液的混合液体积比为tmb溶液、30%过氧化氢、碳量子点溶液、磷酸柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、水=40:1:125:500:875:460；

c、取40μl的l-phenylalanine、dl-tryptophan、l-methionine、glycine、glucose、creatinine、sucrose、l-serine、l-cysteine置于酶标孔中，作为测量溶液，向每个酶标孔中加入160μl的检测溶液，最终使得每个酶标孔中的溶液的总体积为200μl，每个酶标孔中的测量溶液与检测溶液的体积比为1:4；

d、在37℃温育30min后，加入2m硫酸终止反应；

e、在450nm检测每个添加了检测溶液的测量溶液的吸光值，建立测量溶液的吸光值与测量溶液成分的关系。

测量溶液的吸光值与检测溶液的关系如图2所示，测量溶液对l-cysteine有较高的吸光值，而对l-phenylalanine、dl-tryptophan、l-methionine、glycine、glucose、creatinine、sucrose、l-serine的吸光值较低，说明该方法对l-半胱氨酸的检测具有较高的特异性。

步骤四、向l-半胱氨酸的待测溶液中加入检测溶液，得到待测混合溶液，检测待测混合溶液的吸光值强度，根据步骤二建立的线性关系，确定待测溶液中l-半胱氨酸的浓度。具体按照以下步骤：

a、配制检测溶液，检测溶液的混合液体积比为tmb溶液：30%过氧化氢：碳量子点溶液：磷酸柠檬酸缓冲液：磷酸盐缓冲液：水=40:1:125:500:875:460；

b、取40μl的待测溶液置于酶标孔中，向每个酶标孔中加入160μl的检测溶液，得到待测混合溶液，最终使得每个酶标孔中的待测混合溶液的总体积为200μl，每个酶标孔中的待测溶液与检测溶液的体积比为1:4；

d、在37℃温育30min后，加入2m硫酸终止反应；

e、在450nm检测每个添加了检测溶液的待测混合溶液的吸光值，根据步骤二建立的线性方程，确定待测溶液中l-半胱氨酸的浓度。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。