一种基于纳米金比色的microRNA-7a快速检测方法与流程

本发明涉及一种基于纳米金比色的microrna-7a快速检测方法，属于分子生物学和核酸化学领域。

背景技术：

microrna（mirna）作为一种非常重要的非编码蛋白的rna，长度约为19~25个碱基，广泛存在于植物、病毒、哺乳动物当中。在细胞增殖、细胞死亡、肿瘤发生和哺乳动物细胞生长中起着重要的调节功能，mirna序列短序列相似性高，含量低，因此发展灵敏选择性好的mirna检测方法十分有必要，也为疾病的早期诊断提供新思路。

目前，mirna的检测手段主要有两种。一种是标记法，其灵敏度高，但在标记过程中涉及到合成，纯化、标记等过程，过于繁琐且会对生物样品的活性造成破坏；二种是免标记法,但其仪器成本高，需要较为专业的操作技术，使其应用受到较大的局限性。

近年来，纳米金的应用得到了广泛的关注。金纳米粒子（aunps）有着其独特的物理和化学性质，如极高的摩尔吸收系数、稳定的化学性质、优异的荧光淬灭能力以及显著的催化作用，使其成被广泛地应有于生物分析有关领域中。本发明利用了单链和双链dna的静电差异，设计一个比色检测mirna-7a的方法。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明设计了一种基于纳米金比色的mirna-7a快速检测方法。

具体步骤为：

（1）金纳米粒子的制备：移取100ml质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入1.5ml质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行,得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

（2）设计与目标物mirna-7a互补的探针probe（碱基数22~40mer）。

（3）将终浓度为5.33~259.74nmol/l的目标物mirna-7a与物质的量为40~200pmol，碱基数为22~40mer探针probe混合后，置于33~43℃下杂交30分钟，得杂交混合溶液。

（4）将步骤（3）所得杂交混合溶液置于200μl步骤（1）所得的金纳米粒子溶液中震荡混匀,在室温下静置10分钟。

（5）往步骤（4）所得混合液中加入100μl含60~200mmol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液，平衡2分钟后，使用数码相机拍照做颜色对比。

（6）使用紫外可见光谱仪对步骤（5）所得溶液进行检测，分别在524nm和700nm出现特征峰。记录浓度分别为5.33~259.74nmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

（7）检验方法的特异性：经过一系列的优化实验，得到最佳的实验条件，即探针probe的碱基数为34mer，nacl的浓度为大于或者等于160mmol/l，探针probe物质的量为80pmol，杂交温度为30℃。在最优的实验条件下，分别取与目标物mirna-7a同种类的序列浓度为131.57nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤（2）~（6）进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、131.57nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g的紫外光谱。

所述的34mer探针probe的碱基序列为：5´-ttttttaactatacaacctactacctcatttttt-3´，mirna-7a的碱基序列为：5´-tgaggtagtaggttgtatagtt-3´，mirna-7d的碱基序列为：5´-agaggtagtaggttgcatagt-3´，mirna-7e的碱基序列为：5´-tgaggtaggaggttgtatagt-3´，mirna-7g的碱基序列为5´-tgcggtagtagtttgtacagta-3´。

本发明方法的优点如下：

1、使用纳米金比色法，检测方法简单，过程简便，且检测周期短，全程不超过1个小时，方便携带；

2、反应环境温和无污染，实现了绿色化检测，该生物传感器制作成本低，符合产业化低廉的要求；

3、具有较高的选择性和特异性，能够很好地区分互补目标与单碱基错配和非互补序列；

4、能够用肉眼可视目标物浓度的检测下限，分析速度快。

附图说明

图1为本发明的原理图。

图2为本发明实施例1中nacl浓度优化图。

图3为本发明实施例2中探针序列长度优化图。

图4为本发明实施例3中探针物质的量优化图。

图5为本发明实施例4中杂交温度优化图。

图6为本发明实施例5中方法的检测标准曲线图。

图7为本发明实施例5中方法的特异性图。

具体实施方式

以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做详细说明。

实施例1：

（1）金纳米粒子的制备：移取100ml质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入1.5ml质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行。得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

（2）设计与目标物mirna-7a互补的探针probe（碱基数34mer）。

（3）将浓度为131.57nmol/l的目标物mirna-7a与物质的量为80pmol，碱基数为34mer的探针probe混合后，置于38℃下杂交30分钟，得杂交混合溶液。

（4）将步骤（3）所得杂交混合溶液置于200μl步骤（1）所得的金纳米粒子溶液中震荡混匀,在室温下静置10分钟。

（5）往步骤（4）所得混合液中加入100μl分别含60mmol/l、80mmol/l、100mmol/l、120mmol/l、140mmol/l、160mmol/l、180mmol/l、200mmol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液，平衡2分钟后，使用数码相机拍照做颜色对比。

（6）使用紫外可见光谱仪对步骤（5）所得溶液进行检测，分别在524nm和700nm出现特征峰。记录浓度为131.57nmol/lnmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

（7）检验方法的特异性：经过一系列的优化实验，得到最佳的实验条件，即探针probe的碱基数为34mer，nacl的浓度为大于或者等于160mmol/l，探针probe物质的量为80pmol，杂交温度为30℃。在最优的实验条件下，分别取与目标物mirna-7a同种类的序列浓度为131.57nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤（2）~（6）进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、131.57nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g的紫外光谱。

所述的34mer探针probe的碱基序列为：5´-ttttttaactatacaacctactacctcatttttt-3´，mirna-7a的碱基序列为：5´-tgaggtagtaggttgtatagtt-3´，mirna-7d的碱基序列为：5´-agaggtagtaggttgcatagt-3´，mirna-7e的碱基序列为：5´-tgaggtaggaggttgtatagt-3´，mirna-7g的碱基序列为5´-tgcggtagtagtttgtacagta-3´。

实施例2：

（1）金纳米粒子的制备：移取100ml质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入1.5ml质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行；得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

（2）设计与目标物mirna-7a互补，碱基数分别为22mer、34mer、40mer的探针probe。

（3）将浓度为131.57nmol/l目标物mirna-7a与物质的量为80pmol，碱基数分别为22mer、34mer、40mer的探针probe混合后，置于38℃下杂交30分钟，得杂交混合溶液。

（4）将步骤（3）所得杂交混合溶液置于200μl步骤（1）所得的金纳米粒子溶液中震荡混匀,在室温下静置10分钟。

（5）往步骤（4）所得混合液中加入200mmol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液，平衡2分钟后，使用数码相机拍照做颜色对比。

（6）使用紫外可见光谱仪对步骤（5）所得溶液进行检测，分别在524nm和700nm出现特征峰；记录浓度为131.57nmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

（7）检验方法的特异性：经过一系列的优化实验，得到最佳的实验条件，即探针probe的碱基数为34mer，nacl的浓度为大于或者等于160mmol/l，探针probe物质的量为80pmol，杂交温度为30℃。在最优的实验条件下，分别取与目标物mirna-7a同种类的序列浓度为131.57nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤（2）~（6）进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、131.57nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g的紫外光谱。

所述的34mer探针probe的碱基序列为：5´-ttttttaactatacaacctactacctcatttttt-3´，mirna-7a的碱基序列为：5´-tgaggtagtaggttgtatagtt-3´，mirna-7d的碱基序列为：5´-agaggtagtaggttgcatagt-3´，mirna-7e的碱基序列为：5´-tgaggtaggaggttgtatagt-3´，mirna-7g的碱基序列为5´-tgcggtagtagtttgtacagta-3´。

实施例3:

（1）金纳米粒子的制备：移取100ml质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入1.5ml质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行；得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

（2）设计与目标物mirna-7a互补，碱基数为34mer的探针probe。

（3）将浓度为131.57nmol/l目标物mirna-7a与物质的量分别为40、80、120、160、200pmol，碱基数为34mer的探针probe混合后，置于38℃下杂交30分钟，得杂交混合溶液。

（4）将步骤（3）所得杂交混合溶液置于200μl步骤（1）所得的金纳米粒子溶液中震荡混匀,在室温下静置10分钟。

（5）往步骤（4）所得混合液中加入200mmol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液，平衡2分钟后，使用数码相机拍照做颜色对比。

（6）使用紫外可见光谱仪对步骤（5）所得溶液进行检测，分别在524nm和700nm出现特征峰；记录浓度为131.57nmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

（7）检验方法的特异性：经过一系列的优化实验，得到最佳的实验条件，即探针probe的碱基数为34mer，nacl的浓度为大于或者等于160mmol/l，探针probe物质的量为80pmol，杂交温度为30℃。在最优的实验条件下，分别取与目标物mirna-7a同种类的序列浓度为131.57nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤（2）~（6）进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、131.57nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g的紫外光谱。

所述的34mer探针probe的碱基序列为：5´-ttttttaactatacaacctactacctcatttttt-3´，mirna-7a的碱基序列为：5´-tgaggtagtaggttgtatagtt-3´，mirna-7d的碱基序列为：5´-agaggtagtaggttgcatagt-3´，mirna-7e的碱基序列为：5´-tgaggtaggaggttgtatagt-3´，mirna-7g的碱基序列为5´-tgcggtagtagtttgtacagta-3´。

实施例4:

（1）金纳米粒子的制备：移取100ml质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入1.5ml质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行；得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

（2）设计与目标物mirna-7a互补，碱基数为34mer的探针probe，

（3）将浓度为131.57nmol/l目标物mirna-7a与物质的量为80pmol，碱基数为34mer的探针probe混合后，分别置于30、33、35、38、43℃下杂交30分钟，得杂交混合溶液；

（4）将步骤（3）所得杂交混合溶液置于200μl步骤（1）所得的金纳米粒子溶液中震荡混匀,在室温下静置10分钟；

（5）往步骤（4）所得混合液中加入200mmol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液，平衡2分钟后，使用数码相机拍照做颜色对比。

（6）使用紫外可见光谱仪对步骤（5）所得溶液进行检测，分别在524nm和700nm出现特征峰；记录浓度为131.57nmol/l目标物mirna-7a的紫外光谱。

（7）检验方法的特异性：经过一系列的优化实验，得到最佳的实验条件，即探针probe的碱基数为34mer，nacl的浓度为大于或者等于160mmol/l，探针probe物质的量为80pmol，杂交温度为30℃。在最优的实验条件下，分别取与目标物mirna-7a同种类的序列浓度为131.57nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤（2）~（6）进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、131.57nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g的紫外光谱。

所述的34mer探针probe的碱基序列为：5´-ttttttaactatacaacctactacctcatttttt-3´，mirna-7a的碱基序列为：5´-tgaggtagtaggttgtatagtt-3´，mirna-7d的碱基序列为：5´-agaggtagtaggttgcatagt-3´，mirna-7e的碱基序列为：5´-tgaggtaggaggttgtatagt-3´，mirna-7g的碱基序列为5´-tgcggtagtagtttgtacagta-3´。

实施例5:

（1）金纳米粒子的制备：移取100ml质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入1.5ml质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行；得到粒径约为24nm的纳米金粒子。

（2）设计与目标物mirna-7a互补，碱基数为34mer的探针probe，

（3）将浓度分别为5.33nmol/l、13.31nmol/l、26.59nmol/l、53.05nmol/l、79.36nmol/l、131.57nmol/l、183.24nmol/l、234.37nmol/l、259.74nmol/l目标物mirna-7a与物质的量为80pmol，碱基数为34mer的探针probe混合后，置于30℃下杂交30分钟，得杂交混合溶液。

（4）将步骤（3）所得杂交混合溶液置于200μl步骤（1）所得的金纳米粒子溶液中震荡混匀,在室温下静置10分钟。

（5）往步骤（4）所得混合液中加入200mmol/lnacl浓度为10mmol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液，平衡2分钟后，使用数码相机拍照做颜色对比。

（6）使用紫外可见光谱仪对步骤（5）所得溶液进行检测，分别在524nm和700nm出现特征峰；记录浓度为5.33nmol/l、13.31nmol/l、26.59nmol/l、53.05nmol/l、79.36nmol/l、131.57nmol/l、183.24nmol/l、234.37nmol/l、259.74nmol/l的目标物mirna-7a的紫外光谱。

（7）检验方法的特异性：经过一系列的优化实验，得到最佳的实验条件，即探针probe的碱基数为34mer，nacl的浓度为大于或者等于160mmol/l，探针probe物质的量为80pmol，杂交温度为30℃。在最优的实验条件下，分别取与目标物mirna-7a同种类的序列浓度为131.57nmol/l的mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g以及0nmol/lmirna-7a按照步骤（2）~（6）进行实验操作，记录浓度为0nmol/lmirna-7a、131.57nmol/l的mirna-7a、mirna-7d、mirna-7e、mirna-7g的紫外光谱。

所述的34mer探针probe的碱基序列为：5´-ttttttaactatacaacctactacctcatttttt-3´，mirna-7a的碱基序列为：5´-tgaggtagtaggttgtatagtt-3´，mirna-7d的碱基序列为：5´-agaggtagtaggttgcatagt-3´，mirna-7e的碱基序列为：5´-tgaggtaggaggttgtatagt-3´，mirna-7g的碱基序列为5´-tgcggtagtagtttgtacagta-3´。

如图1所示，单链探针裸露在外的碱基吸附在金纳米上面，对纳米金起到了保护作用，当加入nacl溶液时不会使其团聚变蓝。当目标物存在时，与探针杂交形成双链，探针从金纳米表面脱落下来，失去了对金纳米的保护作用，导致金纳米加入nacl溶液后团聚，颜色变蓝，通过颜色变化达到了检测mirna-7a的目的。

由图2可以看出，最佳的nacl浓度为大于或者等于160mmol/l。

由图3可以看出，三种不同长度的探针中效果最佳的为34mer

由图4可以看出，最佳的探针物质的量为80pmol。

由图5可以看出，最佳的杂交温度为30℃。

由图6可以看出，比例吸光度值与目标物浓度有一个良好线性关系，线性回归方程为a=0.002c+0.238，（a为紫外吸收值，c为目标物的浓度），r=0.990，检出下限为5.3nmol/l。

由图7可以看出，目标物mirna-7a的比例吸光度值远远比空白和错配序列高，此可知本发明的方法能够很好地区分互补目标与单碱基错配和非互补序列，具有高灵敏度和特异性。

以上仅是本发明的优选实施方案，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。