一种厚朴辐照前后质量检测方法与流程

本发明属于中药分析领域，具体涉及一种厚朴辐照前后质量检测方法。

背景技术：

厚朴，植物学范围内别名紫朴、紫油朴、温朴等，为木兰科、木兰属植物，常见为厚朴(原亚种)m.officinalissubsp.officinalis与凹叶厚朴(亚种)m.officinalissubsp.biloba两种，主产于四川、湖北等地。中药材中专指该植物的干燥干皮、根皮及枝皮。4～6月剥取根皮及枝皮直接阴干，干皮置沸水中微煮后堆置阴湿处，"发汗"至内表面皮紫褐色或棕褐色时，蒸软取出，卷成筒状，干燥。切丝，姜制用。对食积气滞、腹胀便秘、湿阻中焦等疾病有治疗作用。还能加入癌症药物中。

厚朴广泛用于人们的日常生活中，由于中药材的特性，一般中药材含有大量的微生物，根据卫生部发布关于《钴60辐照灭菌剂量标准》中，厚朴可以进行一定剂量的辐照，对厚朴进行辐照前后质量研究，保证产品的疗效有重要意义。但是现有技术中，未有一个全面的辐照前后的质量分析方法。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种厚朴辐照前后质量检测方法，本方法能有效、全面的表征厚朴辐照前后的质量，克服了原质量控制方法的单一性，具有较高的应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种厚朴辐照前后质量检测方法，包括以下步骤：

(1)对厚朴辐照处理，得到辐照后的厚朴；

(2)辐照前后厚朴的厚朴酚与和厚朴酚含量分析

第1步，对照品溶液的制备：取厚朴酚对照品2.0mg，和厚朴酚2.4mg，精密称定，加入甲醇溶液定容至刻度，称量，离心，取上清液，稀释，制成含厚朴酚40.0μg/ml，和厚朴酚24.0μg/ml的单一对照品溶液；

第2步，供试品溶液的制备：分别取辐照前和辐照后的厚朴粉末0.2g，精密称定，加入甲醇25ml，称量，室温浸渍，滤过，精密量取续滤液5ml置25ml量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀，得到辐照前和辐照后供试品溶液；

第3步，采用高效液相色谱仪对单一对照品溶液、辐照前和辐照后供试品溶液进行样品分析并测得相应峰面积及计算所得含量具体数值；其中，色谱条件为：检测波长294nm；流速1.0ml/min；柱温30℃；进样量4μl；以甲醇-水为流动相等度洗脱；

(3)指纹图谱分析

第1步，供试品溶液的制备：分别取辐照前或辐照后的厚朴粉末0.2g，精密称定，加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液，即得对照品溶液，其中，所述对照品溶液编号s1～s6，奇数号为辐照前厚朴供试品溶液，偶数号为辐照后供试品溶液；

第2步，采用高效液相色谱法建立，色谱条件为：检测波长：274nm；流速1ml/min；柱温40℃；以乙腈c-0.1％磷酸溶液d为流动相，进样量10μl；按如下顺序进行梯度洗脱；0-7min,15％-25％c；7-15min，25％-35％c；15-25min，35％-44％c；25-28min，44％-60％c；28-35min，60％-80％c；35-40min，80％-95％c；40-50min，95％-100％c；建立辐照前后的厚朴hplc指纹图谱。

优选地，所述步骤(1)离心速率为13000r/min，离心时间为10min。

优选地，所述步骤(1)甲醇-水的体积比为78：22。

优选地，所述步骤(2)超声处理的功率为250w，频率为40khz，超声处理时间为30min。

优选地，所述步骤(2)离心速率为13000r/min，离心时间为10min。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：本方法能有效、全面的表征厚朴辐照前后的质量；且本发明建立了厚朴辐照前后指纹图谱的共有模式，标定有18个峰为共有峰，能有效的表征其质量，克服了原质量控制方法的单一性，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为厚朴对照品和样品色谱图；

图2为3批次厚朴辐照前后指纹图谱；

图3为厚朴hplc对照指纹图谱；

图4为厚朴稳定性考察hplc对照指纹图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件按照说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

其中，本发明实施例所用仪器为：kq-500e型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；tg16w台式高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；fa2104分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)。agilent1260高效液相色谱仪(四元泵，自动进样器，柱温箱，dad检测器)(美国)。

本发明实施例所用试剂为：提取用甲醇(分析醇，南京化学试剂股份有限公司)、液相色谱用甲醇(hplc、tedia)、乙腈(hplc、tedia)、磷酸(分析纯，南京化学试剂服务有限公司)、水为超纯水。

厚朴酚(中国食品药品检定研究院，批号110729-201513，含量98.8％)、和厚朴酚(中国食品药品检定研究院，批号110730-201614，含量99.3％)。3批辐照前后厚朴粉末，批号分别为y-1603-1、y-1702-1、y-1702-2，标记为s1、s2、s3。

实施例1

2.1厚朴辐照处理

对厚朴辐照处理，得到辐照后的厚朴；

2.2厚朴酚与和厚朴酚含量分析

2.2.1对照品溶液的制备

取厚朴酚对照品2.0mg，和厚朴酚2.4mg，精密称定，分别置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度，称量，离心(13000r/min，10min)，取上清液，稀释一定倍数，制成含厚朴酚40.0μg/ml，和厚朴酚24.0μg/ml的单一对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取厚朴粉末0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称量，室温浸渍24h，滤过，精密量取续滤液5ml置25ml量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀，即得。

2.2.3色谱条件

agilent1260高效液相色谱仪，agilentsb-c18(4.6×250mm,5μm)，agilentc18ods保护柱(4.6mm×12.5mm，5μm)；流动相：甲醇-水(78：22)；检测波长：294nm；流速1.0ml/min；柱温30℃；进样量4μl；等度洗脱。

2.2.4样品分析

将各样品及对照药材按“2.2”项下方法进样，每个样进样2次，测得相应峰面积及计算所得含量具体数值见表1，色谱图见图1。

表1厚朴辐照前后厚朴酚及和厚朴酚含量测定数据

如表1和图1所示：三批次厚朴辐照前后样品厚朴酚和和厚朴酚含量总和均高于2015版中国药典规定(厚朴酚与和厚朴酚总量不少于1.6％)，均为合格厚朴药材。从3批次厚朴中厚朴酚和和厚朴酚平均值来看，辐照后厚朴酚和和厚朴酚含量均有所降低，绝对含量差为0.14％和0.20％，相对含量下降比例分别为3.80％和4.36％，厚朴酚和和厚朴酚总量绝对含量相差为0.34％，相对含量下降比例为4.11％。三批次含量进行配对样本t检验，结果表明p>0.05，无统计学差异。三批次辐照前后厚朴样品分析结果表明辐照会使厚朴药材中厚朴酚和和厚朴酚含量降低，但降低比例较小。

2.3厚朴指纹图谱分析

2.3.1供试品溶液制备

取本品粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心(13000r/min10min)，取上清液，即得。样品编号s1～s6，奇数号为辐照前样品，偶数号为辐照后样品。

2.3.2色谱条件

色谱柱：agilentsb-c18柱(4.6mm×250mm，5μm)；保护柱：agilentc18ods柱(4.6mm×12.5mm，5μm)；流动相：乙腈(c)-0.1％磷酸水溶液(d)；流速1ml/min；柱温40℃；进样量10μl；梯度洗脱(0-7min，15％-25％c；7-15min，25％-35％c；15-25min，35％-44％c；25-28min，44％-60％c；28-35min，60％-80％c；35-40min，80％-95％c；40-50min，95％-100％c)；检测波长：274nm.

2.3.3方法学考察

2.3.3.1精密度试验

取样品s11份(批号y-1603-1)，按“3.1”项下方法制备供试品溶液，精密量取同一供试品溶液，连续进样6次，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004a版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.98，说明该仪器精密度良好。

2.3.3.2稳定性试验

取样品s11份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样分析，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004a版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.97，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.3.3.3重复性试验

取样品s16份，按“3.1”项下方法制备供试品溶液，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004a版)对6次色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱进行相似度计算，相似度为均大于0.99，表明该方法重复性良好。

2.3.4指纹图谱的建立

2.3.4.1参照峰选择及共有峰标定

将3批次辐照前后厚朴药材与厚朴对照药材按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液后按照“2.3.2”项下色谱条件进样分析，建立厚朴hplc指纹图谱。将色谱图导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004a版)，进行共有峰的标定。13号峰(和厚朴酚)在33.69min处出峰，为厚朴的主要成分，峰面积相对较大，较稳定，色谱峰分离度较好，因此选择其为参照峰。

以s1作为参照谱，选择中位数法生成对照图谱，采用多点校正法建立指纹图谱，见图2，共有18个峰为共有峰。建立的共有指纹图谱见图3。

表23批次厚朴辐照前后18个共有峰的相对峰面积

2.3.5相似度计算

将测定获得的6份厚朴指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004a版)，进行色谱峰匹配，以样品s1分析得到的图谱作为参照图谱，采用中位数法(时间窗为0.1)进行多点校正，生成6份厚朴的对照指纹图谱，并计算不同样品的相似度。结果显示6份样品s1～s6与对照图谱之间的相似度分别为0.998，0.999，0.996，0.999，0.998，0.996。3批辐照前样品与对照图谱之间相似度分别为0.999、0.999、0.995，3批辐照后样品与对照图谱之间相似度分别为0.998、0.999、0.994，辐照前后样品间相似度结果为0.997、0.998、0.999，由于厚朴酚与和厚朴酚在样品中占比较大，因此去除厚朴酚与和厚朴酚再次进行相似度比较，结果表明3批厚朴辐照前与辐照后相似度均大于0.99，说明不同批次之间与同一批次辐照前后样品相似度均较好，结果表明辐照对厚朴指纹图谱一致性基本无影响。

2.4厚朴辐照前后稳定性考察

2.4.1厚朴辐照前后样品中厚朴酚与和厚朴酚含量稳定性考察

厚朴样品室温放置3个月后，采用“2.2”项下厚朴酚与和厚朴酚含量测定方法。

表3厚朴辐照前后厚朴酚和和厚朴酚含量稳定性考察

由结果可见，放置3个月后厚朴酚与和厚朴酚含量变化较小，放置0个月与3个月样品中厚朴酚与和厚朴酚含量进行配对样本t检验，结果表明辐照前0个月与3个月t检验p值分别为0.844、0.779，辐照后0个月与3个月p值为0.990、0.976，均大于0.05，厚朴酚与和厚朴酚总含量辐照前0个月与3个月t检验p值分别为0.806，辐照后0个月与3个月p值为0.987，均大于0.05，表明厚朴指标性成分贮藏3个月后含量变化无统计学差异，因此认为辐照前后样品在放置3个月厚朴酚和和厚朴酚含量较稳定。

2.4.2厚朴辐照前后样品指纹图谱稳定性考察

厚朴样品室温放置3个月后，采用“2.3”项下建立的姜黄指纹图谱分析方法对辐照前后姜黄样品进行指纹图谱分析，样品编号见表4，结果见图4。

根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004a版)对放置0个月与3个月样品谱图进行相似度计算，放置0个月与3个月各批次样品相似度分别为0.985、0.990、0.994、0.991、0.980、0.991，均大于0.95，去除厚朴酚和和厚朴酚后相似度分别为0.942、0.983、0.977、0.965、0.956、0.945，均大于0.90，表明样品放置后整体化学成分无明显变化。

表4厚朴稳定性考察样品信息

通过以上研究数据标明，钴60辐照，既保证了厚朴的微生物合格，有保留了产品的疗效。

以上所述，仅是本发明较佳的实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何细微修改、等同变化和修饰，均属于本发明技术方案的范围内。