五妙水仙膏指纹图谱的检测方法与流程

本发明涉及一种中成药的检测方法，具体涉及五妙水仙膏指纹图谱的检测方法。
背景技术：
：指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的dna，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段。它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的、能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。五妙水仙膏是通过对中医古籍的挖掘、整理，经过多年医疗实践，5000余例临床运用验证、总结而成的经验方。由五倍子、黄柏、紫草、碳酸钠和生石灰组成，主要用于治疗各种皮肤科疾病，具消炎解毒、祛腐生新的作用，疗效显著。目前关于五妙水仙膏的质量检测方法较少，本发明采用高效液相色谱法建立五妙水仙膏的指纹图谱检测方法，对五妙水仙膏中的有效成分进行了准确的分析，对全面客观评价五妙水仙膏的质量具有重要的意义。技术实现要素：发明目的：本发明的目的是解决现有技术的补足，提供一种五妙水仙膏的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价五妙水仙膏的质量，对控制五妙水仙膏的质量和保证临床疗效具有重要意义。技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种五妙水仙膏指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：步骤1、五妙水仙膏供试品溶液的制备：取不同批次的五妙水仙膏样品，精密称取膏体，置锥形瓶中，加含盐酸的甲醇溶液，超声处理后抽滤得到滤液，得到的滤渣再次加含盐酸甲醇溶液重复提取，收集两次得到的滤液，水浴蒸干后，加适量含盐酸甲醇溶解定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；步骤2、对照品溶液的制备：精密称定盐酸小檗碱对照品，置于容量瓶中，用含盐酸甲醇定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；步骤3、分别精密吸取步骤1的供试品溶液和步骤2的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；步骤4、将步骤3中获得的五妙水仙膏供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a；选择不同批次五妙水仙膏的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成五妙水仙膏的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。作为优选方案为，所述的五妙水仙膏指纹图谱的检测方法，步骤1五妙水仙膏供试品溶液制备方法为：取10批次的五妙水仙膏样品，精密称取5g膏体，置100ml锥形瓶中，加25ml含1％盐酸的甲醇溶液，超声处理15min后抽滤得到滤液，得到的滤渣再次加25ml含1％盐酸的甲醇溶液重复提取，收集两次得到的滤液，水浴蒸干后，加含1％盐酸的甲醇溶解定容至25ml，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。作为优选方案为，所述的五妙水仙膏指纹图谱的检测方法，步骤2中对照品溶液的制备方法为：取精密称定的盐酸小檗碱对照品，置于容量瓶中，用1％盐酸甲醇溶液定容至刻度，摇匀，制成0.528mg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液。作为优选方案为，所述的五妙水仙膏指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱为ymc-pack-ods-a的c18色谱柱；流动相：乙腈为a相和含0.1％体积磷酸的水为b相，二极管阵列检测器，检测波长345nm，流速1ml/min，进样体积：10μl，梯度洗脱程序。作为优选方案为，所述的五妙水仙膏指纹图谱的检测方法，步骤3中，梯度洗脱程序为：程序时间(min)a相体积/％b相体积/％105952455050350505046510005701000685595。作为优选方案为，所述的五妙水仙膏指纹图谱的检测方法，指纹图谱中选择4个共有峰作为五妙水仙膏指纹图谱的特征峰，以这4个特征峰的峰面积作为质量评价的指标，4个共有峰中对照品盐酸小檗碱为2号峰，保留时间为33.015分钟，1号峰保留时间为31.097分钟，3号峰保留时间为38.358分钟，4号峰的保留时间为50.876分钟。指纹图谱检测条件的优化1.在样品溶液的制备优化方面本发明通过对不同提取方法(超声、回流)及不同提取溶剂(甲醇、水、乙醇、1％盐酸甲醇)进行实验比较，结果发现超声提取与回流提取所得的谱图差异较小且超声提取效率高，故采用超声提取的方法：对提取溶剂的考察中发现含1％盐酸的甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量高，所以选用含1％盐酸的甲醇进行提取。2.在色谱条件进行优化方面本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取254nm、280nm、345nm处的色谱图，发现检测波长为345nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选取354nm为检测波长；3、流动相的优化：本发明比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水3个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果，结果发现以乙腈-含0.1％体积磷酸的水为流动相时，五妙水仙膏中各成分能达到较好的分离效果，故最终选定以乙腈-含0.1％体积磷酸的水为流动相。4、梯度洗脱筛选由于五妙水仙膏活性成分复杂，且含有离子态的生物碱盐，极性接近，普通洗脱方式，在色谱柱难以达到好的分离度，本发明通过大量实验筛选其梯度洗脱方式，得到最佳的梯度洗脱效果。有益效果：1、本发明根据五妙水仙膏中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的五妙水仙膏指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价五妙水仙膏的质量，为保证其临床疗效具有重要意义。2、用本发明所提供的方法所建立的五妙水仙膏指纹图谱，能有效地表征五妙水仙膏的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定五妙水仙膏质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。3、本发明提供的五妙水仙膏指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现好等优点。附图说明图1为本发明的五妙水仙膏样品的对照指纹图谱。图2为本发明的五妙水仙膏样品的10批次供试品指纹图谱具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所述试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例用到的仪器与试剂如下：实验器材1.1仪器日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高效液相色谱系统，，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统prominencesil-20a，二极管阵列检测器spd-m20a和自动温控柱温箱cto-20a，kq3200db型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，bp121s电子分析天平(sartorius)。1.2药品与试剂10批五妙水仙膏样品(由南京海昌中药集团有限公司生产制备得到)见表1；盐酸小檗碱(批号170321南京森贝伽生物科技有限公司)；甲醇(分析纯)；盐酸(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(分析纯)；实施例11、一种五妙水仙膏指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、五妙水仙膏供试品溶液的制备：取10批次的上述五妙水仙膏样品，精密称取5g膏体，置100ml锥形瓶中，加25ml含1％盐酸的甲醇溶液，超声处理15min后抽滤得到滤液，得到的滤渣再次加25ml含1％盐酸的甲醇溶液重复提取，收集两次得到的滤液，水浴蒸干后，加含1％盐酸的甲醇溶解定容至25ml，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。步骤2、对照品溶液的制备：取精密称定的盐酸小檗碱对照品，置于容量瓶中，用1％盐酸甲醇溶液定容至刻度，摇匀，制成0.528mg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液；步骤3、分别精密吸取步骤1的供试品溶液和步骤2的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；步骤4、将步骤3中获得的五妙水仙膏供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a；选择不同批次五妙水仙膏的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成五妙水仙膏的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱为ymc-pack-ods-a的c18色谱柱；流动相：乙腈为a相和含0.1％体积磷酸的水为b相，二极管阵列检测器，检测波长345nm，流速1ml/min，进样体积：10μl，梯度洗脱程序如下：将10批次的五妙水仙膏的hplc数据导出为aia格式，导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统2004版”，生成标准指纹图谱，并选择4个色谱峰为特征峰，进行指纹图谱相似度评价。10个样品的指纹图谱共有模式见图2，指纹图谱中选择4个共有峰作为五妙水仙膏指纹图谱的特征峰，以这4个特征峰的峰面积作为质量评价的指标，4个共有峰中对照品盐酸小檗碱为2号峰，保留时间为33.015分钟，1号峰保留时间为31.097分钟，3号峰保留时间为38.358，4号峰的保留时间为50.876分钟。10批五妙水仙膏共有峰相对保留时间如表2，五妙水仙膏共有峰相对峰面积如表3，相似度评价结果见表4。根据指纹图谱相似度评价结果显示，不同批次的五妙水仙膏具有一定的差异，研究结果显示，指纹图谱相似度分析可以用于区分不同批次的五妙水仙膏，可以用于五妙水仙膏的质量控制。表1十批次五妙水仙膏样品来源编号生产批号s1180801s2171007s3170901s4170801s5170501s6170301s7170201s8160401s9150901s10150802表2五妙水仙膏共有峰相对保留时间编号峰1峰2峰3峰4s131.15733.12438.32150.826s231.10433.05238.30850.833s331.15433.09038.40750.941s431.13033.06938.40150.920s531.11533.05838.40050.925s631.06333.00438.34650.855s731.09533.03838.34650.856s831.06433.00238.35150.860s931.05232.99238.35250.881s1031.03232.97638.35150.865平均值31.09733.01538.03650.876rsd0.130.140.080.07表3五妙水仙膏共有峰相对峰面积表4不同批次五妙水仙膏指纹图谱相似度实施例2方法学考察1.精密度实验精密吸取实施例1下的对照品溶液，按实施例1下色谱条件连续进样6次，其主要共有峰保留时间的rsd均小于0.24％，相对峰面积rsd均小于2.82％，表明仪器的精密度良好。具体实验结果见表5和表6表5相对保留时间序号峰1峰2峰3峰4131.31833.28738.37750.834231.25133.20338.3850.833331.21633.16238.39650.85431.17133.10938.38250.831531.16333.10138.53650.814631.12933.06238.36850.829平均值31.20833.15438.38950.831rsd0.220.240.210.02表6相对峰面积序号峰1峰2峰3峰4115093957542622437811753342148144574029224498717487231538705911378249390176288415160857809882483061747685141773574265125072717289461508715767894251430170906平均值1495345782910248103174177rsd2.821.121.241.112、稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样进行测定，其主要共有峰相对保留时间的rsd均小于0.24％、相对峰面积rsd均小于2.8％，结果表明：供试品溶液在24h内稳定。具体实验结果见表7和表8。表7相对保留时间序号峰1峰2峰3峰4131.31833.28738.37750.384231.25133.20338.3850.833331.21633.16238.39650.85431.17133.10938.38250.831531.16333.10138.53650.814631.12933.06238.36850.829平均值31.20833.15438.40650.831rsd0.220.240.160.023表8相对峰面积序号峰1峰2峰3峰411503957542622437811753342148144574029224498717487231538705911378249390176288415160857809882483061747685141773574265125072717289461508715767894251430170906平均值1495345782910248103174177rsd2.81.121.241.113、重复性试验结果精密吸取同一批样品，按照实施例1下方法制备供试品溶液，以实施例1下的色谱条件进样，其主要共有峰相对保留时间的rsd均小于0.6，相对峰面积rsd均小于2.84，表明方法的重复性良好。具体实施例结果见表9和表10。表9相对保留时间序号峰1峰2峰3峰4130.83832.73638.30550.805231.07633.20338.28950.791331.07933.20738.29150.799431.11233.24138.28850.733531.01632.95438.27850.77631.0633.18638.29750.775平均值31.0333.08838.29150.779rsd0.320.60.020.05表10相对峰面积以上实验结果表明，本发明提供的五妙水仙膏指纹图谱检测方法，稳定性好、精密度高、重复性好，能全面客观评价五妙水仙膏的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本发明技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。当前第1页12