一种葡萄籽中原花青素含量的近红外检测方法与流程

本发明涉及一种植物提取物的检测方法，尤其是一种葡萄籽中原花青素的快速检测方法，属于检测方法领域。

背景技术：

原花青素(proanthocyanidin，pc)是一种生物类黄酮，由不同数量的黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇聚合而成的聚合物的总称。原花青素具有很强的抗氧化性，能够清除哺乳动物体内的氧游离基，降低体内氧化应激水平，进而起到改善血压、预防动脉粥样硬化的作用。此外，原花青素还具有抑制肿瘤，提高机体免疫水平，保护肝脏等作用，在医疗和保健上都具有非常好的开发前景。

葡萄籽作为生产鲜食葡萄、葡萄罐头、葡萄果汁、葡萄酒等食品工业的废渣，是原花青素重要的来源之一。原花青素含量的检测是原花青素生产过程中质量把控的关键步骤。目前原花青素的检测方法多为铁盐催化比色法、hplc法和香草醛-硫酸法。其中hplc法可以精确检测多种单物质，但是前处理过程复杂，分析时间较长；香草醛-硫酸法由于加入硫酸时会放出大量的热，造成原花青素分解，使得检测结果偏低；铁盐催化比色法发展时间较长，操作简便，但是重现性较差，需要进一步改良。

以上三种检测方由于前处理复杂、检测时间长、检测设备昂贵等原因，难以实现快速、大样本量的准确检测。

技术实现要素：

本发明需要解决的技术问题是提供一种葡萄籽中原花青素含量的近红外检测方法，能够简化样品处理过程，缩短检测时间，实现了葡萄籽中原花青素含量的快速和准确检测。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种葡萄籽中原花青素含量的近红外检测方法，包括以下步骤：

a.葡萄籽样本的预处理

采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量中的葡萄籽样本的预处理方法为：去除碎石、土块和葡萄皮渣等杂质；粉碎至90％以上能通过40目筛；在60℃条件下烘干至水分含量≤5％；

采用近红外光谱仪扫描获得葡萄籽样本的光谱数据中的葡萄籽样本的预处理方法为：除碎石、土块和葡萄皮渣等杂质；进行压片处理，冲压压力4000～6000kpa，压片片径2cm，压片厚度1cm；压片后60℃烘干，样本水分含量≤5％；

b.采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量，具体步骤包括：

a.称取对照品葡萄籽提取物，甲醇溶解，分别配制成3个以上浓度梯度的对照品葡萄籽提取物溶液；

b.分别向对照品葡萄籽提取物溶液中加入盐酸-正丁醇和硫酸铁铵溶液，沸水浴中冷凝回流，冷却；

c.分光光度计检测吸光度，绘制一元二次方程标准曲线；

d.取预处理后的葡萄籽样本，加乙醇溶液萃取，加入同步骤b中的盐酸-正丁醇和硫酸铁铵溶液，沸水浴中冷凝回流，冷却，分光光度计检测吸光度，带入步骤c中的标准曲线，得出采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量；

c.采用近红外光谱仪扫描获得葡萄籽样本的光谱数据；

d.结合光谱数据预处理方法和化学计量学建模方法，建立葡萄籽中原花青素含量的近红外光谱模型；

e.取待测葡萄籽样品，采用步骤a中的预处理方法进行预处理，采集待测葡萄籽样品的光谱信息数据，带入近红外光谱模型中，得到葡萄籽样品的原花青素含量。

本发明技术方案的进一步改进在于：葡萄籽品种包括赤霞珠、灰皮诺、黑皮诺、普罗塞克。

本发明技术方案的进一步改进在于：浓度梯度的对照品葡萄籽提取物溶液为6个，配制方法为称取0.0250～0.0900g对照葡萄籽提取物样品至50ml容量瓶中，加入甲醇后超声溶解，定容，摇匀，分别移取上述溶液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到6个浓度梯度的对照品葡萄籽提取物溶液。

本发明技术方案的进一步改进在于：乙醇溶液质量百分数为40～60％，预处理后的葡萄籽样本的质量毫克数与乙醇溶液的体积毫升数比为1:20，萃取温度为40～60℃，萃取时间为30～60min；盐酸-正丁醇的质量分数为5％，硫酸铁铵的质量分数为2％。

本发明技术方案的进一步改进在于：近红外光谱扫描范围为4300～9000cm，扫描方式为连续波长近红外扫描，采集方式为积分球漫反射。

本发明技术方案的进一步改进在于：光谱数据预处理方法为msc、s-g平滑方法和二阶求导方法，化学计量学建模方法中多元校正算法为偏最小二乘法，pls/pcr因子个数为13。

由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：

本发明提供的一种葡萄籽中原花青素含量的近红外检测方法，能够简化样品处理过程，缩短检测时间，实现了葡萄籽中原花青素含量的快速和准确检测。

本发明在使用盐酸-正丁醇法构建标准曲线时，采用了一元二次方程模型作为标准曲线，该种类型标准曲线在原花青素含量的检测中重现性与精确性均优于普通的直线型标准曲线，受系统因素影响较小，因此能保证较大范围的葡萄籽中原花青素含量的精确检测。

本发明在构建标准曲线时，采用对照葡萄籽提取物样品作为标准品，具有良好的适用性，保证待测样品与构建近红外光谱模型中的样本具有较高的相似度，保证结果的准确可靠。

本发明在采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量时，对葡萄籽样本进行了除杂、粉碎、烘干等预处理，达到了样品均匀一致，保证了化学法检测的准确性，为近红外光谱模型的建立提供了保证。采用近红外光谱仪扫描获得葡萄籽样本的光谱数据时，对葡萄籽样本进行了除杂、压片、烘干等预处理，排除了水分与杂质对样品近红外模型构建时带来的影响，同时由于原花青素分布于葡萄籽的表面，所以进行压片处理，既简化了预处理，又保证了对葡萄籽中原花青素进行全面的扫描，此外对样品进行压片方便了上样量的设定，节省了检测时间。

本发明利用近红外光谱技术构建了一个精确稳定的近红外校正光谱模型，保证了检测的及时、准确，能够满足大样本量的快速检测，适合工业化生产中的质量监控。

附图说明

图1为本发明实施例1中的一元二次方程标准曲线；

图2为本发明对比例1中的线性标准曲线；

图3为本发明实施例2中葡萄籽中原花青素含量验证集的实际值和计算值的关系散点图。

具体实施方式

下面是本发明的一些具体实施方式，用以作进一步详细说明。

一种葡萄籽中原花青素含量的近红外检测方法，包括以下步骤：

a.葡萄籽样本的预处理；

葡萄籽品种包括赤霞珠、灰皮诺、黑皮诺、普罗塞克；

采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量中的葡萄籽样本的预处理为：去除碎石、土块和葡萄皮渣等杂质；粉碎至90％以上能通过40目筛；在60℃条件下烘干至水分含量≤5％；

采用近红外光谱仪扫描获得葡萄籽样本的光谱数据中的葡萄籽样本的预处理为：除碎石、土块和葡萄皮渣等杂质；进行压片处理，冲压压力4000～6000kpa，压片片径2cm，压片厚度1cm；压片后60℃烘干，样本水分含量≤5％；

b.采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量包括如下步骤；

a.称取对照品葡萄籽提取物，甲醇溶解，分别配制成3个以上浓度梯度的对照品葡萄籽提取物溶液；

对照品葡萄籽提取物溶液的配制方法为称取0.0250～0.0900g对照葡萄籽提取物样品至50ml容量瓶中，加入甲醇后超声溶解，定容，摇匀，分别移取上述溶液0、1、2ml……于50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到3个以上浓度梯度的对照品葡萄籽提取物溶液；

b.分别向对照品葡萄籽提取物溶液中加入质量分数为5％的盐酸-正丁醇和质量分数为2％的硫酸铁铵溶液，沸水浴中冷凝回流，冷却；

c.分光光度计检测吸光度，绘制一元二次方程标准曲线；

d.取预处理后的葡萄籽样本粉末，加质量百分数为40～60％的乙醇溶液萃取，萃取温度为40～60℃，萃取时间为30～60min，加入质量分数为5％的盐酸-正丁醇和质量分数为2％的硫酸铁铵溶液，沸水浴中冷凝回流，冷却，分光光度计检测吸光度，带入步骤c中的标准曲线，得出采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量；

预处理后的葡预处理后的葡萄籽样本的质量毫克数与乙醇溶液的体积毫升数比为1:20；

c.采用近红外光谱仪扫描获得葡萄籽样本的光谱数据；

近红外光谱扫描范围为4300～9000cm，扫描方式为连续波长近红外扫描，采集方式为积分球漫反射；

d.结合光谱数据预处理方法和化学计量学建模方法，建立葡萄籽中原花青素含量的近红外光谱模型；

光谱数据预处理方法为msc、s-g平滑方法和二阶求导方法，化学计量学建模方法中多元校正算法为偏最小二乘法，pls/pcr因子个数为13；

建立不低于300组的葡萄籽原花青素的光谱校正模型；

e.取待测葡萄籽样品，除碎石、土块和葡萄皮渣等杂质；进行压片处理，冲压压力4000～6000kpa，压片片径2cm，压片厚度1cm；压片后60℃烘干，样本水分含量≤5％。采集待测葡萄籽样品的光谱信息数据，带入近红外光谱模型中，得到葡萄籽样品的原花青素含量。

实施例1采用盐酸-正丁醇法建立一元二次方程标准曲线

(1)标准溶液配制：称取0.0600g(精确至0.0001g)标定过的葡萄籽提取物粉末样品至50ml棕色容量瓶中，加入2/3体积甲醇，超声溶解。冷却至25℃后以甲醇定容，摇匀。分别移取该溶液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀备用。

(2)2％的硫酸铁铵溶液的配制：精确称取2.00g(精确至0.0001g)硫酸铁铵于100ml容量瓶中，加入约50ml纯净水，超声溶解，吸取16.7ml浓盐酸(12m)加入，放冷至室温，用纯净水定容，摇匀备用。

(3)5％盐酸-正丁醇溶液配制：于1000ml容量瓶中加入大约2/3体积的正丁醇，加入50.0ml浓盐酸(12m)，冷却至25℃，用正丁醇定容至刻度，摇匀备用。

(4)移取30ml5％的盐酸-正丁醇溶液于100ml容量瓶中，依次加入1ml2％硫酸铁铵溶液和5ml标准溶液，轻轻混匀，瓶口塞紧空气冷凝管。100℃水浴60min，放入25℃水中冷却10min，取出放置避光处5min，在550nm波长处检测吸光度。

(5)根据吸光度和标准溶液中原花青素含量的对应关系，插入散点图，添加多项式趋势线，得到一元二次方程标准曲线，即y＝0.1021x²+0.1514x+0.0005，r²＝0.9999。

实施例2葡萄籽中原花青素含量的近红外检测方法

a.葡萄籽样本预处理

预处理1：对赤霞珠葡萄籽样本进行人工去除碎石、土块和葡萄皮渣等杂质，粉碎至90％以上能通过40目筛，在60℃条件下烘干至水分含量≤5％，备用；

预处理2：对赤霞珠葡萄籽样本进行人工除杂，利用压片机对粉碎后的葡萄籽原料进行压片，其中压片机冲压压力为6000kpa，片径2cm，厚度1cm，待样品成片后60℃烘干至水分含量≤5％，备用；

b.采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量

取预处理1后的葡萄籽样本10g，加40％的乙醇溶液200ml，40℃萃取30min，加入5％盐酸-正丁醇和2％硫酸铁铵溶液，沸水浴中冷凝回流，冷却，使用分光光度计在550nm处检测吸光度，带入实施例1中的一元二次方程标准曲线，得出采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量，记录测定结果；

c.采用近红外光谱仪扫描获得葡萄籽样本的光谱数据

在25℃下开启近红外光谱仪预热30min，取预处理2的葡萄籽样本20g，放于旋转样品杯中(直径50mm，深度25mm)；采用连续波长近红外扫描中的漫反射模式采集光谱，扫描范围为4300～9000cm^-1，分辨率16cm^-1，采集样品的吸收光谱；为了克服样品粒度差异引起的光谱漂移，减少误差，每个样品重复装样3次，得到校正集样本光谱；

d.近红外光谱模型的建立

采用msc方法预处理光谱、s-g平滑方法和二阶导数对步骤c得到的校正集样本光谱进行预处理；结合处理后的图谱信息与采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量，按照最小二乘法建立近红外光谱模型；

e.葡萄籽样品检测

取待测葡萄籽样品，除碎石、土块和葡萄皮渣等杂质；进行压片处理，冲压压力6000kpa，压片片径2cm，压片厚度1cm；压片后60℃烘干，样本水分含量≤5％。采集待测葡萄籽样品的光谱信息数据，带入步骤d中近红外光谱模型中，得到葡萄籽样品的原花青素含量。

实施例3～7

实施例3～4与实施例1中的方法步骤相同，所不同的是实施例3中步骤(1)为分别移取该溶液0、2、4ml于50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，得到一元二次方程标准曲线，即y＝0.0913x²+0.1583x-0.0001，r²＝0.9999；实施例4中步骤(1)为分别移取该溶液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，得到一元二次方程标准曲线，即y＝0.1064x²+0.1478x+0.0004，r²＝0.9999。

实施例5～7与实施例2中的方法步骤相同，所不同的是参数的选择，如下面表1中所示。

表1

对比例1～2

对比例1与实施例1中的方法步骤相同，所不同的是标准曲线为线性标准曲线。

对比例2与实施例2的方法步骤相同，所不同的是采用盐酸-正丁醇法测定葡萄籽样本的原花青素含量中使用的标准曲线为线性标准曲线。

试验例

对实施例1和对比例1中的标准曲线进行了稳定性验证：(1)从同一批葡萄籽提取物中称取5份质量各不相同的葡萄籽提取物样品，置入50ml棕色容量瓶中。加入2/3体积甲醇，超声溶解，使用甲醇定容摇匀。移取5ml于100ml容量瓶中，依次加入1ml2％硫酸铁铵溶液和30ml5％盐酸-正丁醇溶液，轻轻混匀，瓶口塞紧空气冷凝管。100℃水浴60min，放入25℃水中冷却10min，取出放置避光处5min，在550nm波长处检测吸光度。所得吸光度分别带入对比例1中的线性标准曲线和实施例1中的一元二次方程标准曲线，得到原花青素含量，计算平均值及极差，结果见表2。(2)从同一批葡萄籽中称取5份质量各不相同的葡萄籽样品，加40％的乙醇溶液200ml，40℃萃取30min，移取5ml萃取液于100ml容量瓶中，依次加入1ml2％硫酸铁铵溶液和30ml5％盐酸-正丁醇溶液，轻轻混匀，瓶口塞紧空气冷凝管。100℃水浴60min，放入25℃水中冷却10min，取出放置避光处5min，在550nm波长处检测吸光度。所得吸光度分别带入对比例1中的线性标准曲线和实施例1中的一元二次方程标准曲线，得到原花青素含量，计算平均值及极差。结果见表3。

表2

表3

由表2、表3可见，利用一元二次方程标准曲线得出的检测值的极差远小于利用线性标准曲线得出的检测值的极差，由此可见，利用一元二次方程标准曲线得出的检测值要比利用线性标准曲线得出的检测值更准确、更稳定。

对实施例2与对比例2中的近红外模型进行了验证：取已知原花青素含量检测值的葡萄籽压片样品(即采用盐酸-正丁醇法测定、利用一元二次方程标准曲线计算得到的葡萄籽样品的原花青素含量)检验校正模型，利用步骤d校正模型得到已知原花青素含量结果的葡萄籽压片的检测值，计算实际值与计算值的相关系数(corr，coeff)和方差(rmsec)，评价校正模型的可靠性，结果见图3。

分别利用实施例2和对比例2建立的近红外模型对葡萄籽样品进行原花青素含量检测，同时利用盐酸-正丁醇法(一元二次方程标准曲线)和盐酸-正丁醇法(线性标准曲线)检测得到葡萄籽样品原花青素含量的化学法检测值，结果见表4和表5。

表4

表5

由表4和5可见，利用一元二次方程标准曲线建立的近红外模型与相应的化学法检测结果相对误差均在5％以内，而利用线性标准曲线建立的近红外模型与相应的化学法检测结果相对误差大部分在5％以上，由此可见，利用一元二次方程标准曲线建立的近红外模型的准确性更高。