一种美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法与流程

本发明涉及测定药物有关物质的
技术领域：
，特别涉及一种美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法。
背景技术：
：溃疡性结肠炎是一个全世界都有的疾病，近年来，溃疡性结肠炎的发病率在我国有增高趋势，临床上多采用柳氮磺胺吡啶(sasp)治疗，虽然有一定疗效，但其副作用发生率较高，且对磺胺过敏者不能应用。美沙拉秦最早由德国霍克大药厂研制成功并投放市场，与sasp相比，其主要化学结构在于保留了5-氨基水杨酸有效成份，去除了磺胺吡啶基团，因此克服了sasp的缺点，是治疗溃疡性结肠炎的一种新药，已在西方国家广泛应用。目前由于人们生活环境恶化和生活习惯等诸多因素影响，溃疡性结肠炎发病率在逐年增加，在美沙拉秦问世前，没有更好的药物用于治疗溃疡性结肠炎，美沙拉秦问世后，以其良好的疗效和不良反应少等优势，在临床上不断推广。美沙拉秦的主要药理作用在于直接抑制结肠过氧化物酶，抑制炎症介质，包括前列腺素、白三烯等的合成和释放；抑制血小板活化因子的活性；清除自由基，降低肠道黏膜的损伤及刺激，且避免了sasp的副作用，适用于sasp、糖皮质激素无效或不耐受的患者。从缓解症状、结肠镜下改变，其有效率明显高于sasp。另外，还可明显降低患者血清中tnf-а和il-8水平，这可能是其治疗溃疡性结肠炎的作用机制之一。美沙拉秦的抗炎作用机制尚不完全清楚。体外研究显示美沙拉秦对肠黏膜前列腺素的含量有一定影响，具有清除活性氧自由基的功能，对脂氧合酶可能起到一定的抑制作用。直肠给予美沙拉秦灌肠液后，美沙拉秦主要局部作用于肠黏膜和粘膜下层组织。有关物质主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。有关物质与药品质量、安全性及疗效密切相关，有关物质的存在可能会降低药物的疗效，甚至引起毒副作用，因此，必须通过适当的检测分析方法控制药物中有关物质的种类和含量，确保药品质量。目前usp、bp标准和进口质量标注中收载美沙拉秦有关物质的检测方法，通过对其检测方法的研究发现：①usp标准采用等度洗脱，无法将混合杂质中的各杂质完全分开；②bp标准中主峰及杂质峰位置处梯度峰干扰较明显，杂质a和c单独采用另一色谱条件，且检测杂质a和c的色谱条件中流动相中加入了高氯酸，容易损伤色谱柱；③进口质量标准中存在杂质检测不全的现象，且部分杂质分离度不高，无法实现准确检测。本发明可以在同一色谱条件下对多美沙拉秦有关物质进行检测，且能有效分离各杂质，对其质量控制具有重要意义。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供一种专属性好、分离度好、能将可能的降解杂质和工艺杂质与主成分有效分开，且灵敏度高，可应用于美沙拉秦灌肠液的质量控制。本发明人针对美沙拉秦合成工艺以及降解情况，鉴定了11个杂质。本发明人经过梯度洗脱程序等条件进行筛选，兼顾11个有关物质分离的需要，最终建立了适当的有关物质分析方法，使主成分与各有关物质之间、各有关物质之间均能达到基线分离，达到了上述发明的目的。本发明实施例首先提供一种美沙拉秦有关物质的测定方法，所述方法采用高效液相色谱法进行测定，所述高效液相色谱法的色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾4.35g，加水溶解至1000ml，用磷酸调ph至7.2)-tbah溶液(取10％四丁基氢氧化铵水溶液80ml，加水稀释至200ml，用硫酸溶液(1→2)调ph至7.5)-甲醇-水(250：50：100：600)为流动相a，以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾4.35g，加水溶解至1000ml，用磷酸调ph至7.2)-tbah溶液(取10％四丁基氢氧化铵水溶液80ml，加水稀释至200ml，用硫酸溶液(1→2)调ph至7.5)-甲醇-水(250：50：500：200)为流动相b；梯度洗脱程序为：柱温为40℃；检测波长为230nm；流速为1.0ml/min。取本品适量，精密称定，加0.01mol/l的盐酸溶解并稀释制成每1ml中约含美沙拉秦1.0mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液适量，加0.01mol/l的盐酸定量稀释制成每1ml中含美沙拉秦1μg的溶液，作为对照溶液。分别精密称杂质对照品各适量，加0.01mol/l的盐酸溶解并定量稀释制成每1ml中约含各杂质1μg的混合溶液，作为杂质对照品溶液。分别精密称杂质对照品和美沙拉秦对照品各适量，加0.01mol/l的盐酸溶解并定量稀释制成每1ml中约含1μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。供试品溶液、对照溶液与杂质对照品溶液的进样量为10μl。附图说明图1为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法的方法优化中洗脱程序1色谱图；图2为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法的方法优化中洗脱程序2色谱图；图3为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法的方法优化中洗脱程序3色谱图(本发明标准色谱图)；图4为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法的方法优化中洗脱程序4色谱图；图5为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法的方法优化中洗脱程序5色谱图；图6为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法的方法对比中usp标准的色谱图；图7为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法的方法对比中bp2017标准的色谱图；图8为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法的方法对比中进口注册标准的色谱图；图9为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法测定的系统适用性试验溶液的色谱图；图10为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法测定的专属性空白试验溶液的色谱图；图11为采用本发明的美沙拉秦灌肠液有关物质测定方法测定的专属性试验溶液的色谱图；需要特别说明的是：由于申请人使用的hplc设备为网络版，该工作站不具有任何的图像编辑、导出功能，只能直接打印成纸质文件，附图因为工作站和打印设备的问题有倾斜，这并不影响本领域技术人员对色谱图的解读。具体实施方式为了测定美沙拉秦有关物质，本发明提供了一种美沙拉秦有关物质的测定方法。在该技术方案中，通过优化高效液相色谱条件，使得美沙拉秦与相邻杂质及各杂质间较好分离。以下结合附图具体说明本发明的技术方案。以下具体实施方式中，所使用的药品、试剂及仪器如：表1对照品信息编号代码名称批号含量来源1杂质a4-氨基苯酚l310r6799.65％百灵威2杂质c2-氨基苯酚lb30r3998.66％百灵威3杂质e4-氨基水杨酸lga0o0898.78％百灵威4杂质f3-氨基水杨酸l610p4197.55％百灵威5杂质g2,5-二羟基苯甲酸lda0q3499.79％百灵威6杂质h水杨酸lrc0q52100.74％百灵威7杂质j3,5-二氨基水杨酸wg01669615040800195.0％毕得医药8杂质l2-氯苯甲酸la50q2298.97％百灵威9杂质m2-氯-5-硝基苯甲酸l270o8899.96％百灵威10杂质n5-硝基水杨酸l370p2899.52％百灵威11杂质r3-硝基水杨酸nxz6f99.4％tgi12——美沙拉秦100565-20070199.9％中检院表2样品信息表3仪器与设备信息名称型号厂家电子天平bp211dsartorioμs高效液相色谱仪agilent1200agilent色谱条件初步优化在初步拟定的准色谱条件(洗脱程序1)下各杂质间分离度较好，但杂质n与杂质r在该保留时间条件下未出峰；由单个杂质出峰情况可知，杂质n与杂质r在下一针样品中能出峰，因此在梯度流动相比例变化速率不变的情况下，适当延长梯度时间进行试验，对洗脱程序1进行初步优化，其中洗脱程序优化为：洗脱程序2及洗脱程序3，图谱见附图1、附图2、附图3。表4洗脱程序表5色谱条件初步优化结果所述的高效液相色谱条件中，在梯度流动相比例变化速率不变的情况下，适当延长梯度时间能全部检出已知杂质，除杂质g和杂质l分离度为1.05外，其余各杂质的分离度均较好；因此在该色谱条件下进行色谱柱的筛选。色谱条件的进一步优化在洗脱程序3方法的基础上，调整梯度洗脱程序，对色谱条件进一步优化，以便选择更好的色谱条件，其中洗脱程序优化为：洗脱程序4及洗脱程序5，图谱见附图4、附图5。表6洗脱程序表7改变洗脱程序试验结果所述的高效液相色谱条件中，三个洗脱程序下，主峰的保留时间基本一致，主峰与相邻峰的分离度均较好，各杂质均能有效检出，与bp2017标准杂质检出能力一致(bp2017原料及制剂中的明确控制限度的11个已知杂质均能有效检出)，且各杂质峰之间分离度较好。本发现确定的美沙拉秦灌肠液有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，所用的流动相a：磷酸盐缓冲液(ph7.2)-tbah溶液-甲醇-水(250：50：100：600)；流动相b：磷酸盐缓冲液(ph7.2)-tbah溶液-甲醇-水(250：50：500：200)，其中梯度洗脱程序见表8：表8洗脱程序时间(min)a％b％09010601585659010759010表中为测定美沙拉秦灌肠液有关物质的进口药品注册标准jx20090090、ep9.0\bp2017、usp40及本发明标准。表9有关物质测定标准表中为测定美沙拉秦灌肠液有关物质的进口药品注册标准jx20090090、ep9.0\bp2017及本发明标准梯度洗脱程序。表10梯度洗脱具体情况表中为测定美沙拉秦灌肠液有关物质的进口药品注册标准jx20090090、ep9.0\bp2017、usp40及本发明标准试验结果，图谱见附图6、附图7、附图8。表11混合杂质测定结果表12原料测结果表13样品测结果对比测定美沙拉秦灌肠液有关物质的进口药品注册标准jx20090090、ep9.0\bp2017及本发明标准，结论如下：①usp40标准：采用等度洗脱，无法将各杂质分开，其中杂质a和杂质j重叠，杂质m与主峰重叠；且检出的各杂质之间分离度较差，杂质h和l峰未分开，分离度小于1.2。②bp2017标准：采用11个杂质的混合溶液进样，该色谱条件下各杂质均能有效检出，但主峰及各杂质峰峰型较差；主峰及杂质峰保留时间较早，各杂质峰间分离度较差；而bp2017标准中杂质a和c单独采用另一色谱条件，且在该色谱条件下检测杂质a和c的流动相中加入了高氯酸，容易损伤色谱柱。③进口质量标准jx20090090标准：各杂质均能有效检出，且各杂质间能有效分离；但主峰及杂质峰位置处梯度峰干扰较明显，可能干扰杂质测定。④本发明标准标准：该色谱条件下各杂质间及主峰与相邻峰的分离度均较好，11个杂质均能有效检出；在usp40色谱条件下样品中能检出一个已知杂质f，在进口质量标准jx20090090的色谱条件下可能受梯度峰干扰样品中未检出已知杂质；而在bp2017和本发明标准色谱条件下样品中均能检出2个杂质，其中一个为已知杂质f。验证内容1系统适用性配制美沙拉秦对照品及各已知杂质的混合溶液，作为系统适用性溶液；精密量取10μl进样；结果见表14，图谱见附图9。表14系统适用性测定结果结果显示：主峰峰形、对称性均较好，理论板数高，主峰与相邻杂质峰分离度较好，各杂质间均能较好分离；表明分析方法系统适用性良好。2专属性①空白辅料干扰试验取稀释剂、空白辅料、原料、有关物质混合对照(杂质a、c、e、f、g、h、j、n、r)、样品各溶液，精密量取各溶液10μl进样；结果见表15、表16。图谱见附图10、附图11。表15专属性试验结果结果显示：稀释剂、空白辅料均不干扰主峰及杂质的检测。表16杂质分离情况杂质名称保留时间(min)相对保留时间分离度4-氨基苯酚2.4450.20——3,5-二氨基水杨酸4.7160.3811.522-氨基苯酚5.5800.456.774-氨基水杨酸8.6420.704.84美沙拉秦12.3711.008.163-氨基水杨酸16.0351.305.722,5-二羟基苯甲酸20.5261.6611.22水杨酸36.6652.9614.283-硝基水杨酸47.2423.8220.545-硝基水杨酸51.9604.2010.122-氯苯甲酸22.2241.803.402-氯-5-硝基苯甲酸29.4592.3812.87结果显示：美沙拉秦与相邻杂质分离度大于2.0，各杂质间分离度大于1.5，均能较好分离。②强制降解试验分别配制美沙拉秦灌肠液贮备液和空白辅料贮备液，量取美沙拉秦灌肠液贮备液和空白辅料贮备液，分别才照表17条件进行强制降解试验，最后量取稀释液10μl，注入液相色谱仪；结果见表18、表19。表17样品和空白辅料降解条件表18样品强制降解结果备注：强光、高温、氧化和强酸条件下供试品溶液未变色，在强碱条件下供试品溶液从无色变为浅棕色至棕色。表19样品降解杂质归属分析结果显示：在高温、强光、强酸、强碱和氧化条件下均有降解杂质产生，主成份降解程度在95.25％～99.96％，其杂质降解情况与原料降解情况基本一致。各降解产物与主峰均有效分离；空白辅料无降解物产生，不干扰样品杂质检测。3定量限与检测限采用信噪比法测定美沙拉秦各有关物质的检测限和定量限。分别配制美沙拉秦各有关物质的贮备液，稀释至一定浓度并进样，计算峰高与噪声的比值(信噪比)，其信噪比(s/n)约为10的样品检测量即为定量限，信噪比(s/n)约为3的样品检测量即为检测限，结果见表20。表20各杂质检测限和定量限试验结果结果显示：各杂质的检测限均低于限度进样量10ng，满足有关物质检测要求；本方法对各有关物质的响应高，能准确控制各有关物质的含量。4线性与范围精密称取美沙拉秦及其各杂质对照品，加0.01mol/l盐酸溶解稀释成贮备液(浓度：约2μg/ml)。配制成6份不同浓度的溶液，分别进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得到美沙拉秦及其各杂质的线性回归方程，结果见表21。表21线性试验结果杂质名称线性范围线性方程线性相关系数美沙拉秦3.10ng～60.64ngy＝2.1453x+0.3722r＝0.9994-氨基酚3.12ng～20.81ngy＝3.6107x-0.7666r＝0.9992-氨基酚2.85ng～19.00ngy＝2.0311x-2.0495r＝0.9974-氨基苯甲酸2.97ng～19.82ngy＝3.2427x-1.2363r＝0.9993-氨基苯甲酸3.18ng～21.20ngy＝2.0251x+1.9682r＝0.9992,5-二羟基苯甲酸3.03ng～20.22ngy＝3.9321x-0.4948r＝0.999水杨酸3.05ng～20.30ngy＝2.2391x+0.1946r＝0.9993,5-二氨基水杨酸3.00ng～20.00ngy＝2.8871x+1.1801r＝0.9995-硝基水杨酸2.97ng～19.80ngy＝2.8417x-1.0882r＝0.9993-硝基水杨酸3.12ng～20.80ngy＝2.5216x-0.8285r＝0.9992-氯苯甲酸3.04ng～20.29ngy＝2.7896x-1.7707r＝0.9992-氯-5-硝基苯甲酸3.09ng～20.63ngy＝2.3251x-0.885r＝0.999结果显示：在本方法下，美沙拉秦及其各杂质在一定浓度范围内，均能呈良好的线性关系。5精密度重复性试验：取各杂质对照品各适量，加入自制品溶液中，制成6份杂质浓度为美沙拉秦标示量0.1％的供试品溶液，分别进样，计算各杂质含量。试验结果见表22。表22重复性试验结果结果显示：各杂质含量rsd均小于3％，表明该方法重复性好。6回收率试验对照溶液配制：取各杂质对照品适量，精密称定，加0.01mol/l盐酸溶解稀释制成浓度为0.02mg/ml的混合杂质贮备液，精密量取混合杂质溶液5ml，置100ml量瓶中，加0.01mol/l盐酸稀释至刻度，制成浓度为1ug/ml的混合杂质对照溶液。美沙拉秦自制品溶液配制：精密称定美沙拉秦自制品适量，加0.01mol/l盐酸溶解稀释制成浓度为15mg/ml的溶液，备用。样品溶液配制：精密量取混合杂质贮备液10ml，置100ml量瓶中，加0.01mol/l盐酸稀释至刻度，制成浓度为2μg/ml的混合杂质贮备液(1)；另精密量取该混合杂质贮备液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.01mol/l盐酸稀释至刻度，制成浓度为5ug/ml的混合杂质贮备液(2)。分别精密量取贮备液(2)各1ml，置10ml量瓶，各加入150mg自制品，加0.01mol/l盐酸，制成为美沙拉秦标示量0.05％供试品溶液3份；另精密量取贮备液(1)5ml、7.5ml各3份，置10ml量瓶，各加入150mg自制品，加0.01mol/l盐酸，制成为美沙拉秦标示量0.10％、0.15％的供试品溶液各3份。上述溶液共计9份，比较理论值和测定值，计算回收率。试验结果见表23。表23回收试验结果结果显示：各杂质的平均回收率均在95.40％～105.91％之间，回收率rsd均小于10％，表明有关物质测定方法的准确度良好。7耐用性试验分别考察柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％、磷酸盐缓冲液ph值变化±0.2、流动相比例变化±5％、检测波长变化±5nm及色谱柱条件，进行耐用性试验。取自制品溶液，美沙拉秦浓度为1mg/ml，精密量取10μl注入液相色谱仪。试验结果见表24。表24不同色谱条件试验结果结果显示：在所有参数发生微小变化时，美沙拉秦和杂质峰理论塔板数和分离度无显著变化，分析方法耐用性良好。当前第1页12