基于姜黄素复合ZnO纳米粒子猝灭鲁米诺电化学发光传感器的制备的制作方法

本发明涉及一种金杂化mos2/bi2s3纳米棒固载鲁米诺检测淀粉样β蛋白42的电化学发光传感器。具体是采用金杂化mos2/bi2s3纳米棒固载鲁米诺作为发光材料，姜黄素复合zno纳米粒子作为猝灭剂，制备一种检测淀粉样β蛋白42猝灭型电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。

背景技术：

阿尔茨海默病是一种发生于老年和老年前期的神经系统退行性疾病，临床表现为记忆障碍、失语、执行功能障碍以及人格和行为改变等。因此，阿尔茨海默病严重威胁着人类的健康，并且降低人类的生活质量。淀粉样β蛋白的沉积与阿尔茨海默病的发病机理具有一定的关系。淀粉样β蛋白42和淀粉样β蛋白40是淀粉样β蛋白的两种主要成分，其中，淀粉样β蛋白42阿尔茨海默病病人斑块中的主要成分，比淀粉样β蛋白40更容易聚集。早期发现、早期治疗将会改善病人的生存质量。因此，在本发明中，以淀粉样β蛋白42为检测对象，开发一种新颖的、灵敏的免疫测定方法，是非常有意义的。

电化学发光（ecl）分析具有灵敏度高，线性范围宽；反应可控性、时空可控性好；仪器简单，分析速度快；节约试剂；分析的应用范围广；可以同时获得多种信息，有利于研究快速发光反应和发光反应机理等优势，已经发展成为分析化学的一门分支学科。鲁米诺作为传统的电化学发光试剂，具有高效的发光效率，然而，如何将鲁米诺稳定地固载在电极表面构建固态ecl传感器，对于解决ecl传感器的稳定性及灵敏度至关重要。众所周知，无标记型传感器依据生物分子对修饰电极的阻抗作用引起ecl信号的变化实现目标物的检测。因此，发现新型的猝灭剂通过能量转移引起发光材料ecl信号的变化，对于实现目标物的痕量检测具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明设计了一种猝灭型的电化学发光免疫传感器用于检测淀粉样β蛋白。

在本发明中，采用金杂化mos2/bi2s3纳米棒固载发光材料鲁米诺，极大地增强了鲁米诺的ecl强度。mos2/bi2s3纳米棒不仅对过氧化氢的分解具有一定的催化作用，而且可以通过au-s键结合更多的金纳米粒子，从而通过金-nh2键固载更多的鲁米诺和淀粉样β蛋白42抗体。本发明使用mos2/bi2s3纳米棒作为基底材料，利用mos2和bi2s3之间形成的异质结改善了其电化学特性，与单纯的mos2和bi2s3纳米材料相比，复合纳米材料固载鲁米诺具有稳定且强的电化学发光信号，改善了传感器的稳定性和灵敏度。为了灵敏地检测淀粉样β蛋白42，姜黄素复合zno纳米粒子作为猝灭剂，降低鲁米诺的电化学发光强度。抗氧化剂姜黄素可以与超氧根自由基（o2^•−）反应，而鲁米诺的电化学发光强度与o2^•−的含量成正比，因为o2^•−是生成鲁米诺自由基和激发态3-氨基邻苯二甲酸盐必不可少的物质之一。并且，姜黄素的紫外-可见吸收峰与鲁米诺的荧光发射峰具有一定的波谱重叠，即二者之间也存在一定的能量转移，进一步猝灭了鲁米诺的电化学发光强度。姜黄素的疏水性限制了其在生物分析领域的应用，将姜黄素固定在纳米材料上改善了其在水中的分散性，拓宽其在生物传感器领域的应用。在本发明中，将姜黄素与zno纳米粒子复合，为了稳定简单地结合二抗，聚多巴胺自聚合在复合材料表面，通过michael反应聚多巴胺上的苯醌官能团可以和生物分子上的氨基形成共价键。不同浓度的淀粉样β蛋白42可以结合不同量的二抗-聚多巴胺@姜黄素-zno，从而引起鲁米诺-金杂化的mos2/bi2s3纳米棒发光强度的变化，实现淀粉样β蛋白42的检测。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.一种金杂化mos2/bi2s3纳米棒固载鲁米诺检测淀粉样β蛋白42的电化学发光传感器，制备步骤如下：

（1）使用抛光粉预处理直径4mm的玻碳电极，超纯水冲洗干净；

（2）将7µl10mg/ml鲁米诺-金杂化mos2/bi2s3纳米棒溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；

（3）滴涂6μl500μg/ml一抗ab1溶液于玻碳电极表面，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（4）滴涂3μl质量分数为1%的牛血清白蛋白bsa，封闭非特异性活性位点，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）将6μl不同浓度的淀粉样β蛋白42滴涂在电极表面，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）将6µl1～7mg/mlab2-聚多巴胺@姜黄素-zno溶液滴涂在电极表面，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测淀粉样β蛋白42的电化学发光生物传感器。

2.本发明所述的一种金杂化mos2/bi2s3纳米棒固载鲁米诺检测淀粉样β蛋白42的电化学发光传感器，所述鲁米诺-金杂化的mos2/bi2s3纳米棒溶液，制备步骤如下：

（1）mos2/bi2s3纳米棒的制备

将0.242gna2moo4·2h2o和0.765gbi(no3)3·5h2o分散在60ml超纯水中，加入0.76g硫脲，磁力搅拌1h。将上述溶液转移至100ml反应釜中，220℃反应24h，离心、洗涤、干燥得到mos2/bi2s3纳米棒；

（2）鲁米诺-金杂化的mos2/bi2s3纳米棒的制备

将制备的mos2/bi2s3纳米棒分散在50ml超纯水中，超声1h。然后，将2ml1%haucl4和5mgpvp加入到上述溶液中，搅拌6h之后，逐滴加入2ml50mmol/l柠檬酸钠溶液和少量的nabh4溶液还原haucl4。搅拌6h之后，离心去除未结合的金纳米粒子，得到金杂化的mos2/bi2s3纳米棒。然后将纳米棒分散在5ml超纯水中，加入1～5ml5mmol/l鲁米诺过夜搅拌，通过金-nh2键将鲁米诺结合在纳米棒材料表面，离心分离去除未结合的鲁米诺，得到鲁米诺-金杂化的mos2/bi2s3纳米棒。

3.本发明所述的一种金杂化mos2/bi2s3纳米棒固载鲁米诺检测淀粉样β蛋白42的电化学发光传感器，所述ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno，制备步骤如下：

（1）姜黄素-zno的制备

将5mg姜黄素分散在50ml超纯水中，90℃回流至姜黄素完全溶解。加入50ml0.1mol/l硝酸锌溶液，90℃回流1h。当上述溶液冷却至室温，冰水浴中加入5ml0.2mol/lkoh，搅拌1h，形成橙黄色的胶状悬浮液，用超纯水和丙酮洗涤去除未结合的姜黄素，真空干燥得到姜黄素-zno；

（2）ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno

将20mg制备的姜黄素-zno和1～5mg多巴胺分散在30ml超纯水中，搅拌6h，离心去除未结合的多巴胺。将上述混合物分散在10ml10mmol/ltris-hcl（ph=8.5）溶液中，搅拌6h，离心去除未结合的聚多巴胺。然后，将1～10mg聚多巴胺@姜黄素-zno分散在5ml磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，加入500μl500μg/ml二抗ab2，4˚c下搅拌6h。之后，加入100μl1%牛血清白蛋白，封闭非特异性位点，离心得到ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno，将其分散1ml在磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，保存在4℃冰箱中待用。

4.本发明所述的制备方法制备的基于鲁米诺-金杂化的mos2/bi2s3纳米棒构建电化学发光传感器，用于淀粉样β蛋白42的检测，步骤如下：

（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂丝电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为600v，扫描电压设置为-0.2～0.6v；

（2）使用含1mmol/l～8mmol/l过氧化氢的pbs缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的淀粉样β蛋白42产生的电化学发光信号强度；

所述pbs缓冲溶液，其ph=6.5～8.5，是用1/15mol/lna2hpo4和1/15mol/lkh2po4配制；

（3）根据所得的电化学发光强度值与淀粉样β蛋白42浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。

附图说明

图1为本发明设计的传感器的流程设计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1制备鲁米诺-金杂化的mos2/bi2s3纳米棒溶液

（1）mos2/bi2s3纳米棒的制备

将0.242gna2moo4·2h2o和0.765gbi(no3)3·5h2o分散在60ml超纯水中，加入0.76g硫脲，磁力搅拌1h。将上述溶液转移至100ml反应釜中，220℃反应24h，离心、洗涤、干燥得到mos2/bi2s3纳米棒；

（2）鲁米诺-金杂化的mos2/bi2s3纳米棒的制备

将制备的mos2/bi2s3纳米棒分散在50ml超纯水中，超声1h。将2ml1%haucl4和5mgpvp加入到上述溶液中，搅拌6h之后，逐滴加入2ml50mmol/l柠檬酸钠溶液和少量的nabh4溶液还原haucl4。搅拌6h之后，离心去除未结合的金纳米粒子，得到金杂化的mos2/bi2s3纳米棒。然后将纳米棒分散在5ml超纯水中，加入5ml5mmol/l鲁米诺过夜搅拌，通过金-nh2键将鲁米诺结合在纳米棒材料表面，离心分离去除未结合的鲁米诺，得到鲁米诺-金杂化的mos2/bi2s3纳米棒。

实施例2制备ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno

（1）姜黄素-zno的制备

将5mg姜黄素分散在50ml超纯水中，90℃回流至姜黄素完全溶解。加入50ml0.1mol/l硝酸锌溶液，90℃回流1h。当上述溶液冷却至室温，冰水浴中加入5ml0.2mol/lkoh，搅拌1h，形成橙黄色的胶状悬浮液，用超纯水和丙酮洗涤去除未结合的姜黄素，真空干燥得到姜黄素-zno；

（2）ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno

将20mg制备的姜黄素-zno和1mg多巴胺分散在30ml超纯水中，搅拌6h，离心去除未结合的多巴胺。将上述混合物分散在10ml10mmol/ltris-hcl（ph=8.5）溶液中，搅拌6h，离心去除未结合的聚多巴胺。然后，将1mg聚多巴胺@姜黄素-zno分散在5ml磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，加入500μl500μg/ml二抗ab2，4˚c下搅拌6h。之后，加入100μl1%牛血清白蛋白，封闭非特异性位点，离心得到ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno，将其分散在1ml磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，保存在4℃冰箱中待用。

实施例3制备ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno

（1）姜黄素-zno的制备

将5mg姜黄素分散在50ml超纯水中，90℃回流至姜黄素完全溶解。然后，加入50ml0.1mol/l硝酸锌溶液，90℃回流1h。当上述溶液冷却至室温，冰水浴中加入5ml0.2mol/lkoh，搅拌1h，形成橙黄色的胶状悬浮液，用超纯水和丙酮洗涤去除未结合的姜黄素，真空干燥得到姜黄素-zno；

（2）ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno

将20mg制备的姜黄素-zno和5mg多巴胺分散在30ml超纯水中，搅拌6h，离心去除未结合的多巴胺。将上述混合物分散在10ml10mmol/ltris-hcl（ph=8.5）溶液中，搅拌6h，离心去除未结合的聚多巴胺。然后，将5mg聚多巴胺@姜黄素-zno分散在5ml磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，加入500μl500μg/ml二抗ab2，4˚c下搅拌6h。之后，加入100μl1%牛血清白蛋白，封闭非特异性位点，离心得到ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno，将其分散在1ml磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，保存在4℃冰箱中待用。

实施例4制备ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno

（1）姜黄素-zno的制备

将5mg姜黄素分散在50ml超纯水中，90℃回流至姜黄素完全溶解。然后，加入50ml0.1mol/l硝酸锌溶液，90℃回流1h。当上述溶液冷却至室温，冰水浴中加入5ml0.2mol/lkoh，搅拌1h，形成橙黄色的胶状悬浮液，用超纯水和丙酮洗涤去除未结合的姜黄素，真空干燥得到姜黄素-zno；

（2）ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno

将20mg制备的姜黄素-zno和10mg多巴胺分散在30ml超纯水中，搅拌6h，离心去除未结合的多巴胺。将上述混合物分散在10ml10mmol/ltris-hcl（ph=8.5）溶液中，搅拌6h，离心去除未结合的聚多巴胺。然后，将10mg聚多巴胺@姜黄素-zno分散在5ml磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，加入500μl500μg/ml二抗ab2，4˚c下搅拌6h。之后，加入100μl1%牛血清白蛋白，封闭非特异性位点，离心得到ab2-聚多巴胺@姜黄素-zno，将其分散在1ml磷酸盐缓冲溶液（ph=7.4）中，保存在4℃冰箱中待用。

实施例5制备检测淀粉样β蛋白42的电化学发光传感器

（1）使用抛光粉预处理直径4mm的玻碳电极，超纯水冲洗干净；

（2）将7µl10mg/ml鲁米诺-金杂化mos2/bi2s3纳米棒溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；

（3）滴涂6μl500μg/ml一抗ab1溶液于玻碳电极表面，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（4）滴涂3μl质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）将6μl不同浓度的淀粉样β蛋白42滴涂在电极表面，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）将6µl3mg/mlab2-聚多巴胺@姜黄素-zno溶液滴涂在电极表面，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测淀粉样β蛋白42的电化学发光生物传感器。

实施例6制备检测淀粉样β蛋白42的电化学发光传感器

（1）使用抛光粉预处理直径4mm的玻碳电极，超纯水冲洗干净；

（2）将7µl10mg/ml鲁米诺-金杂化mos2/bi2s3纳米棒溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；

（3）滴涂6μl500μg/ml一抗ab1溶液于玻碳电极表面，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（4）滴涂3μl质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）将6μl不同浓度的淀粉样β蛋白42滴涂在电极表面，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）将6µl7mg/mlab2-聚多巴胺@姜黄素-zno溶液滴涂在电极表面，4℃冰箱中保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测淀粉样β蛋白42的电化学发光生物传感器。

实施例7淀粉样β蛋白42的检测方法

（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂丝电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为600v，扫描电压设置为-0.2～0.6v；

（2）使用含3mmol/l过氧化氢的pbs缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的淀粉样β蛋白42产生的电化学发光信号强度；

所述pbs缓冲溶液，其ph=6.5，是用1/15mol/lna2hpo4和1/15mol/lkh2po4配制；

（3）根据所得的电化学发光强度值与淀粉样β蛋白42浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。

实施例8淀粉样β蛋白42的检测方法

（1）将参比电极-ag/agcl电极、对电极-铂丝电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管的高压设置为600v，扫描电压设置为-0.2～0.6v；

（2）使用含5mmol/l过氧化氢的pbs缓冲溶液，通过电化学发光法检测不同浓度的淀粉样β蛋白42产生的电化学发光信号强度；

所述pbs缓冲溶液，其ph=8.0，是用1/15mol/lna2hpo4和1/15mol/lkh2po4配制；

（3）根据所得的电化学发光强度值与淀粉样β蛋白42浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。

实施例9人造脑脊液淀粉样β蛋白42的检测

（1）向稀释的人造脑脊液中加入不同浓度的淀粉样β蛋白42，采用标准加入法测定样品中淀粉样β蛋白42的平均回收率，结果见表1。

表1样品中淀粉样β蛋白42的检测结果

表1检测结果可以看出，样品中淀粉样β蛋白42检测结果的回收率为94～112%，表明本发明可以应用于实际生物样品的检测，结果准确可靠。