电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法
【专利摘要】本发明提供了一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法利用，鲁米诺电致化学发光被首次应用于单细胞内生物分子(如葡萄糖)的检测。在检测过程中，单个细胞被直接定位在单个细胞大小的微洞电极；加入含有鲁米诺、曲通100和葡萄糖氧化酶的混合溶液后，曲通100可以破坏细胞膜，释放细胞内的葡萄糖到微洞中，和洞内的葡萄糖氧化酶反应生成过氧化氢；过氧化氢与鲁米诺反应在正电位下产生光信号。这种新发明的电化学发光测定方法将有可能被应用于对单细胞中更多的细胞内分子进行快速分析，以阐明细胞间的异质性。
【专利说明】
电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物仪器检测领域，具体涉及一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法。
【背景技术】
[0002]电化学发光是物质发生电化学反应后形成的激发态物质跃迀、释放能量并诱导光学辐射的一个过程。与化学发光和荧光等检测系统相比，电化学发光结合了电化学和光学方法，具有许多独特的优点。具体而言，与化学发光相比，电化学发光更可控，对于发射光的选择性分离也更好;与荧光相比，电化学发光不存在激发光，这使得背景光的干扰被降到最低，从而获得较高的灵敏度。因此，在生化分析中，电化学发光是一种强有力的分析工具。
[0003]众所周知，鲁米诺-过氧化氢体系能产生较强的电化学发光。在此过程中，鲁米诺和过氧化氢发生电化学反应产生对二氮烯和其他含氧化物，并进一步经过高能电子转移反应，生成3-氨基邻苯二甲酸，进而发射光信号。考虑到相应的氧化酶与目标分子反应会产生过氧化氢，我们在先前的工作中引入胆固醇氧化酶，利用鲁米诺电化学发光，对胆固醇在单个细胞细胞膜中的含量进行分析。为了提高分析速度，我们意识到可以使用电化学发光成像进行平行测定，即使用电子倍增CCD(EM CCD)把多个细胞表面的过氧化氢或者活性胆固醇的发光情况记录在一张图像中。虽然我们的工作已经证明了电化学发光是单细胞分析的有效方法，然而这个方法受限于分析细胞表面分子。因为细胞内小分子波动与细胞活性相关联，对于生物学研究而言是相当重要，因此如能利用电化学发光对细胞内分子进行，将具有重要的生物学意义。
【发明内容】
[0004]发明目的:为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法。
[0005]技术方案:为实现上述技术目的，本发明的电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法，待检测的成分在对应的氧化酶的作用下催化产生双氧水，其特征在于，包括如下步骤:
[0006](I)提供表面具有若干微孔的氧化铟锡电极表面作为微电极，将该微电极作为工作电极与电化学工作站连接，银/氯化银和铂电极分别作为参比电极和辅助电极，通过电沉积将金纳米颗粒沉积到微电极的微孔表面；
[0007](2)以含有200-500μΜ L012的10_20mM PBS的混合溶液作为氧化铟锡片发光成像的溶液加入到微孔中，将待分析的单个细胞设置于微孔内，加入表面活性剂和待分析成分对应的氧化酶，使用电压发生器施加正负交替的电压在电极上诱使发光，然后使用电化学发光成像装置连续采集曝光时间为60s的两张照片，来收集来自细胞的发光信号；
[0008](3)使用Image J软件计算两个图像中发光强度的差异，同时为了校准来自ITO微孔处的发光差异，将50-100μΜ过氧化氢水溶液引入微孔内并对微孔发光的光强进行采集，在微电极的微孔内的单个细胞的发光强度和加入的过氧化氢收集到的发光强度的比率作为信号被用于细胞内成分的分析检测。
[0009]其中，所述的待检测成分可以为葡萄糖、乳酸或胆固醇中的任意一种或其他在氧化酶作用下可以产生双氧水的物质。
[0010]优选地，步骤(I)中，所谓微电极表面设置有64-256个用于容纳单个细胞的微孔。[0011 ] 所述金纳米粒子的电沉积通过在含有l-5mM HAuCl4的0.1M HCl溶液中，循环扫描得到，其中，电势由-0.2V到0.55V，循环扫描400-800s。
[0012]所述电压发生器施加的正负交替的电压为lV，2s和_lV，0.5s。
[0013]步骤(2)中，所述的表面活性剂为0.1 -0.5 %的Tr i ton X-100，所述的葡萄糖氧化酶的浓度为0.l-0.5U/mL。
[0014]在本文中，电化学发光方法被首次尝试用来分析单细胞中的物质，细胞内的葡萄糖被选为模型分子。如图1所示，单个细胞被置于氧化铟锡电极表面的微孔上。加入的表面活性剂，如triton X-100，可以溶解细胞膜，使得细胞内葡萄糖被释放，与溶液中的葡萄糖氧化酶进行反应;生成的过氧化氢在正电压的刺激下，可以诱导发光，以实现细胞内葡萄糖的分析。微孔结构的设计不仅可以保留单个细胞，也可以降低过氧化氢从氧化铟锡电极表面扩散到微孔的过程，从而可以在一段时间内应该使用鲁米诺发光成像系统持续地收集光信号，实现单细胞的快速检测。本发明实现了可以同时检测多个细胞，增加了检测通量，并通过对微孔镀金修饰，增强了发光信号，从而实现微洞的电致发光成像。
【附图说明】
[0015]图1电致化学发光成像装置和单细胞细胞内葡萄糖的检测技术示意图；
[0016]图2微孔中电沉积AuNPs(实线)和未沉积Au NPs(虚线)的ITO区域的特征发光曲线。光电倍增管(PMT)电压为800V;
[0017]图3氧化铟锡片上制备的微洞镀金后在含有200μΜL012的1mM PBS中电致化学发光照片。(A)明场照片；(B-H)5，10，20，50，100，200，500μΜ双氧水加入前后的发光差异照片；
(I)发光差异强度和双氧水浓度的相关性。误差棒代表来自64个微洞的发光强度的标准偏差;
[0018]图4(A)单个细胞位于微洞中的明场照片；(B)加入葡萄糖氧化酶和曲通100后在第一个60s采集的发光照片；(C)第二个60s采集的发光照片；(D)这两张照片的发光差异；
[0019]图5(A)微洞中单个饥饿细胞的明场图像；(B)只加入曲通100后，第一个个60s内收集到的发光图像;(C)第二个60s内收集的发光图像;(D)两张图像之间的发光差异；
[0020]图6(A)微孔中单个饥饿细胞的明场图像；(B)加入葡萄糖氧化酶/曲通100后首个60s内收集到的发光图像;(C)第二个60s内收集的发光图像;(D)两张图像之间的发光差异；[0021 ]图7(A) 128个正常细胞的发光比率；(B) 128个饥饿处理4h的细胞.每个点代表一个细胞。
【具体实施方式】
[0022]下面通过具体的实例详细说明本发明的技术方案。
[0023]化学试剂和细胞培养:光致抗蚀剂SU-8和显影剂是从Microchem公司(Newton，MA)购置的。化合物8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3，4-d]哒嗪-1，4(2H，3H)_ 二酮(L012)从光化工美国公司购买得到。其他所有化学试剂都是从西格玛奥德里奇公司购置的。实验中采用电阻率为18.2MΩ /cm的纯水。缓冲溶液均经过消毒处理。
[0024]Hela细胞来自于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所(中国上海)C=Hela细胞在加有10% (v/v)牛胎血清(FBS)和I %(v/v)抗菌素(青霉素/链霉素)的DEME高糖培养基中培养。细胞培养过程在37 °C恒温，含5 % C02的湿润环境中进行。
[0025]本实例提供了一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法，包括如下步骤:
[0026](I)金纳米颗粒(Au-NPs)在氧化铟锡微洞电极表面的沉积:在氧化铟锡表面上制备获得了直径为30微米的64个微洞，用于容纳单个细胞。简要来说，在氧化铟锡片(边长2cm)上旋转镀上一层厚度约30μπι的SU-8光刻胶，65°C软烤3分钟，95°C软烤7分钟后，通过氧化铁掩模片和光刻系统对氧化铟锡玻璃上的光刻胶紫外照射20s;接着65°C软烤I分钟，95°C软烤3分钟，未聚合的光刻胶通过SU-8显影剂进行移除;暴露出来的ITO区域就可以导电，得到一个有64个孔径为30μπι的微孔电极。接下来，将具有微洞的玻片在120°C下硬烤30min;并将O型圈粘附在氧化铟锡片上，以形成细胞室。将该微电极作为工作电极与电化学工作站(CHI 630E，辰华公司)连接，银/氯化银和铂电极分别作为参比电极和辅助电极。金纳米粒子的电沉积通过在含有ImM HAuCl4的0.1M HCl溶液中.循环扫描(电势由-0.2V到0.55V，400s)得到。(2)电化学发光成像:化学发光成像的光学装置如图1所示，其由1X目镜(Olympus ,Japan)、一根管和 EM CCD (Evo Ive ,Photometries，Tuson，AZ)所组成，这种直立的成像系统设计使得传输过程中化学发光损失达到最小，且提供了最短的光通路传输。分散的细胞在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4，1011^)环境中与20(^1 L012—起加入细胞格室，单个细胞借助其自身重力落入细胞格室大小的微孔中，显微镜下通过反复操作达到高负载效率。多余的细胞在粘附在洞外表面前，使用新鲜缓冲溶液反复轻柔清除掉。装有细胞的64微孔的氧化铟锡玻璃片作为工作电极，Ag/AgCl电极和Pt丝分别作为参考电极和辅助电极连接;含有200μΜ L012的1mM PBS(pH 7.4)作为氧化铟锡片发光成像的溶液。电压发生器(DG1021，1^801，0^肪)施加正负交替的电压(1￥，28和-1￥，0.58)在电极上诱使发光。随后，在缓冲溶液中加入0.1%的Triton X-100和0.lm/mL葡萄糖氧化酶，对细胞进行裂解;释放细胞内的葡萄糖与葡萄糖氧化酶发生反应双氧水，提高发光强度。使用EM CCD连续采集曝光时间为60s的两张照片，来收集来自细胞的发光信号。这两个图像中发光强度的差异，使用Image J软件进行计算。为了校准来自ITO微孔处的发光差异，50μΜ过氧化氢水溶液被引入并对微孔发光的光强进行采集。在微洞电极上细胞和过氧化氢收集到的发光强度的比率作为信号被用于细胞内葡萄糖的分析检测。
[0027]实验结果
[0028]为了实现细胞内葡萄糖的分析检测，对微孔中过氧化氢溶液的成像是非常关键的。我们在之前的一些工作中已经证实了，通过电化学发光成像，氧化铟锡表面ΙΟμΜ浓度的过氧化氢是可以被检测到的。然而，氧化铟锡玻璃在经过多重的微加工过程制备微洞后发光很弱，造成较高的检测限。发光效率的损失可能是由于氧化铟锡的微孔区域在经过微加工后残留的光刻胶所导致的。由于有报道表明，金纳米粒子(Au NPs)能够加速与鲁米诺电化学发光相关联的电化学反应，产生更多的电化学发光信号，因此我们在氧化铟锡微孔中电镀产生Au NPs以改善检测限。优化后的的电镀时间为400s，相对于没有修饰Au NPs的ITO区域，Au NPs覆盖的氧化铟锡区域的发光量增加了十倍，发光情况如图2中所示。发光强度的增加使得氧化铟锡微孔中过氧化氢电化学发光具有了较好的检测限。
[0029]图3A显示出，在10倍目镜下氧化铟锡片上的64微孔在电镀修饰AuNPs后的明场照片。当过氧化氢浓度从5μΜ上升到升高到500μΜ时，鲁米诺发光照片被收集。图3Β-Η中计算并展示了过氧化氢加入前后光信号的差异。加入后发光信号的增强说明过氧化氢在氧化铟锡微洞电极上可以被观测到。发光强度的增加与过氧化氢的浓度呈正相关，如图31所示，这表明了我们的平台可以提供单细胞的定量检测。过氧化氢的检测限是5μΜ，比我们以前实验中的检测限(ΙΟμΜ)有所改善。这些64孔板中微孔的发光强度的相对标准偏差为17.6%，接近我们课题组之前报告过的八个微电极阵列的标准偏差15.6%。这种标准偏差的相似性说明微孔中Au NPs覆盖的ITO区域是相对均匀的。
[0030]为了实现单个细胞中葡萄糖的快速分析，电致化学发光成像被应用于同时记录64个细胞/微孔的发光强度。图4Α显示了有单细胞的64微孔的明场图像。细胞成功进入到微孔中的效率超过了80%。无细胞的微孔或有多个细胞的微孔在接下来的电化学发光分析中被排除。在葡萄糖氧化酶/Titron Χ-100被加入到缓冲溶液中之后，视频记录显示了微孔中的细胞在第45-60S开始破碎。因此，如图4Β和C所示，以60s的曝光时间进行成像。在第一幅图像中，发光强度显示背景发光仅仅是来源于L012的。在第二个图像中，L012，以及从细胞内释放出的葡萄糖与水溶液中葡萄糖氧化酶反应产生的过氧化氢是发光的主要来源。图4D展示了这两张图像的发光差异，每个微孔显示出了更多的发光。如图5中所示，加入Titron X-100进行对照实验表明，这两张图像没有给出任何发光差异。这些结果表明，我们的电致化学发光成像方法能够在单细胞层面实现对胞内葡萄糖的可视化。
[0031]为了校准从这些细胞产生的光强，装载有细胞的氧化铟锡片被洗净，除去残留在微孔中的过氧化氢;然后，由50μΜ过氧化氢，200μΜ L012和0.1 %的Titron Χ-100构成的新鲜缓冲液被加入到氧化铟锡表面，重新进行发光成像。图7Α中显示了 128个细胞在给予50μΜ过氧化氢下的发光情况，平均发光率的计算结果是1.06±0.46，证明了微孔中过氧化氢浓度在50μΜ附近。考虑一个细胞和一个微孔的体积分别是IpL和21pL，细胞内的葡萄糖浓度被估计为约1禮，这是与文献值比较接近的。128个细胞的相对标准偏差是43.4% ;根据目前我们所能了解到的，这是首次对细胞内葡萄糖水平的巨大差异有所报道。由于葡萄糖是细胞中重要的营养物质和代谢产物，这种差异可以促进我们进一步理解细胞之间的异质性。
[0032]为了进一步验证我们对细胞内葡萄糖含量的测定方法，对“饥饿”细胞进行了实验。在此实验中，这些细胞被置于细胞外缓冲溶液(ECB:135mM NaCl，5mM KCl, ImM MgCl2,ImM CaCl2aOmM HEPES，5mM glucose,pH 7.4)中培养4个小时，以降低细胞内的葡萄糖含量。“饥饿”细胞的明场和图像之间的差异显示在图6中。在微孔中观测到了微弱的发光，这也证实了在“饥饿”细胞中仍然存在一定量的葡萄糖。与对正常细胞的测定类似，利用50μΜ过氧化氢产生的光强对128个细胞的发光情况进行校正，如图7Β所示。与正常细胞的结果相比，对“饥饿”细胞的发光情况进行计算可以得到一个较小的平均值，约为0.36±0.19，这应当归因于在饥饿期间的葡萄糖消耗。根据图31中的校准曲线，可以估计细胞内的葡萄糖浓度约为0.36mM。这个对不同状态下细胞内葡萄糖水平的变化证实了发光强度与细胞内葡萄糖浓度是相关联的。这个实验的相对标准偏差为52.8%，揭示了在饥饿处理后细胞的异质性仍然存在。
[0033]在本实例中，鲁米诺电化学发光首次被应用在对单个细胞内的葡萄糖进行分析。在与电化学发光成像平台结合之后，64个单细胞在60s内就能得到分析，这大大加快了单细胞分析速度。在对正常细胞和饥饿细胞的胞内葡萄糖进行观测后，研究结果显示细胞之间展现出了高度的异质性。这是首次利用电致化学发光分析对单细胞内分子进行检测，这将解除此前该技术仅能被用于测量细胞表面物质的限制。因此，这种方法将会被用于检测更多的细胞内代谢产物，从而对更多的生物现象加以探讨。
【主权项】
1.一种电致化学发光成像方法快速分析单细胞内成分的方法，待检测的成分在对应的氧化酶的作用下催化产生双氧水，其特征在于，包括如下步骤: (1)提供表面具有若干微孔的氧化铟锡电极表面作为微电极，将该微电极作为工作电极与电化学工作站连接，银/氯化银和铂电极分别作为参比电极和辅助电极，通过电沉积将金纳米颗粒沉积到微电极的微孔表面； (2)以含有200-500μΜL012的10-20mM PBS的混合溶液作为氧化铟锡片发光成像的溶液加入到微孔中，将待分析的单个细胞设置于微孔内，加入表面活性剂和待分析成分对应的氧化酶，使用电压发生器施加正负交替的电压在电极上诱使发光，然后使用电化学发光成像装置连续采集曝光时间为60s的两张照片，来收集来自细胞的发光信号； (3)使用ImageJ软件计算两个图像中发光强度的差异，同时为了校准来自ITO微孔处的发光差异，将50-100μΜ过氧化氢水溶液引入微孔内并对微孔发光的光强进行采集，在微电极的微孔内的单个细胞的发光强度和加入的过氧化氢收集到的发光强度的比率作为信号被用于细胞内成分的分析检测。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的待检测成分为葡萄糖、乳酸或胆固醇中的任意一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所谓微电极表面设置有64-256个用于容纳单个细胞的微孔。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述金纳米粒子的电沉积通过在含有l_5mM HAuClJ^0.lM HCl溶液中，循环扫描得到，其中，电势由-0.2V到0.55V，循环扫描400-800s。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述电压发生器施加的正负交替的电压为lV，2s和-lV，0.5s。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的表面活性剂为0.Ι-Ο.5 % 的Triton X_100，所述的葡萄糖氧化酶的浓度为0.1-0.5U/mL。
【文档编号】G01N21/76GK105928927SQ201610237426
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】江德臣, 方丹君, 徐晶晶
【申请人】南京大学